Development of secondary mitochondrial dysfunction of mononuclear blood leukocytes in patients with chronic obstructive pulmonary disease and chronic bronchitis

Full Text

Введение

В соответствии с современными представлениями хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) является лидирующей причиной заболеваемости и смертности во всем мире, представляя собой значительное и постоянно растущее социально-экономическое бремя [1]. Установлено, что наиболее распространенным и изученным фактором риска ХОБЛ и хронического бронхита является курение, способное, в свою очередь, индуцировать развитие вторичной митохондриальной дисфункции [2].

Под митохондриальной дисфункцией понимается нарушение любого из процессов, протекающих в митохондриях, например, таких как: окислительное фосфорилирование, участие в апоптозе, регуляция цитоплазматического и митохондриального уровня кальция, синтез и катаболизм некоторых метаболитов [3]. Митохондриальная дисфункция является важным патогенетическим звеном, обуславливающим развитие системных нарушений при ХОБЛ [2]. Так установлено, что скелетные мышцы от пациентов с ХОБЛ характеризуются уменьшенным количеством митохондрий, сниженным биогенезом митохондрий, уменьшенной активностью комплексов дыхательной цепи, повышенной продукцией активных форм кислорода, что создает предпосылки для нарушения функции скелетных мышц у ­больных ХОБЛ при ­обострениях и в значительной мере обусловливают уменьшение толерантности к физической нагрузке [4, 5]. Наряду с системными эффектами важным аспектом в патогенезе ХОБЛ является персистирующее воспаление, которое сохраняется даже после прекращения курения [5, 6].

Определение маркеров митохондриальной дисфункции, тесно связанной с развитием окислительного стресса (ОС) и формированием патологической воспалительной реакции, у больных ХОБЛ наряду с клиническими показателями может стать дополнительным критерием, который позволит разделять больных на подгруппы с целью оптимизации подбора терапии. Учитывая, что для функционирования митохондрий большое значение имеют процессы адаптации к гипоксии, срыв которых связан с образованием избытка активных форм кислорода (АФК), представляется целесообразным исследование активности ферментов дыхательной цепи и их субстратов у больных ХОБЛ и хроническим бронхитом [5, 7, 8]. Избыточное образование АФК способствует развитию ОС с повреждением всех клеточных структур, в том числе белков. В связи с этим исследование карбонильных производных белков позволит провести как количественную оценку выраженности ОС, так и, возможно, охарактеризовать качественные аспекты окислительного повреждения при ХОБЛ и хроническом бронхите [9, 10]. По данным ряда исследователей, периферические лимфоциты, являясь мигрирующими клетками организма, способны отражать изменения, протекающие в других тканях, и удобны для исследования в клинической практике [11].

Целью данного пилотного исследования является изучение показателей энергетического обмена и окислительного стресса моноядерных лейкоцитов и оценка возможности развития митохондриальной дисфункции в лимфоцитах и моноцитах при ХОБЛ и хроническом бронхите.

Материалы и методы

Проведённое исследование одобрено ЛЭК РязГМУ (протокол № 2 от 7.10.2016 г.) и соответствует требованиям Надлежащей Клинической Практики (GCP) и Хельсинской декларации Всемирной Медицинской Ассоциации «Этические принципы проведения медицинских исследований с участием людей в качестве субъектов исследования».

В исследование было включено 50 пациентов — мужчин курильщиков в возрасте от 40 до 75 лет (медиана — 67 [61; 70] лет), проходивших лечение в ГБУ РО «ОКБ» (г. Рязань) по поводу обострения ХОБЛ или хронического бронхита. Критериями включения в группу больных ХОБЛ служили подписанное информированное согласие, возраст от 40 до 75 лет, исходный постбронходилатационный модифицированный индекс Тиффно ≤0,7. Для группы больных хроническим бронхитом: подписанное информированное согласие, возраст от 40 до 75 лет, наличие хронического бронхита в анамнезе более 2-х лет. Критериями исключения для всех групп служили хирургические вмешательства на легких в анамнезе, злоупотребление алкоголем и наркотиками, пациенты с легочными заболеваниями, отличными от пациентов ХОБЛ и больных хроническим бронхитом, или имеющие значимые воспалительные заболевания, другие хронические заболевания внутренних органов в фазе декомпенсации, моноцитоз (>11 %) в результатах общего анализа крови. Больные были разделены на три группы. Первая группа включила 13 пациентов с хроническим бронхитом, средний возраст которых составил 68[61;71] лет. В соответствии со спирометрической классификацией GOLD вторая группа включала пациентов с ХОБЛ 2 (по 50 % ≤объем форсированного выдоха за 1 секунду n=17), средний возраст больных в этой группе составил 67[61;72] лет. Третья группа включала ­пациентов с ХОБЛ 3 (30 % ≤объем форсированного выдоха за 1 секунду n=20), средний возраст в группе — 68[62, 5;72] лет. Все исследуемые группы были сопоставимы по полу и возрасту (p1-2=0,79; p1-3=0,967, p2-3=0,59).

Всем пациентам проводилось общеклиническое обследование, определение функции внешнего дыхания с помощью спирометра MicroLab (Micro Medical, Великобритания). Забор крови осуществлялся утром натощак на второй день госпитализации путем венепункции с помощью вакуумных систем для забора крови из кубитального доступа с помощью пробирок, содержащих гепарин натрия, разделительный гель и раствор фиколла для создания градиента плотности (BD Vacutainer CPT, США).

Выделение лимфоцитов из крови проводилось путем центрифугирования забранной крови в пробирках BD CPT при относительном центробежном ускорении 1 600 в течение 16 минут в соответствии с инструкцией производителя. После центрифугирования забирали плазму с лимфоцитами и моноцитами из содержимого пробирки над разделительным гелем. Мононуклеарные лейкоциты отделяли от плазмы путем центрифугирования при 3 000 оборотах/минуту в течение 10 минут. Полученные клетки отмывали 0,9 % NaCl с последующим центрифугированием при 3 000 оборотах/минуту в течение 5 минут троекратно.

Выделенные мононуклеарные лейкоциты ресуспендировали в 1 мл дистиллированной воды, получая суспензию. В 20 мкл суспензии подсчитывали количество клеток, окрашенных раствором метиленового синего в камере Горяева, с последующим их перерасчетом на объем суспензии. После завершения подсчета клеток к 1 мл суспензии добавляли детергент (10 мкл Triton X-100) и замораживали её. После разморозки суспензию использовали для определения показателей окислительного стресса, концентрации янтарной кислоты и активности ферментов с последующим пересчетом показателей на 106 клеток/мл суспензии.

Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли фотометрически по торможению реакции аутоокисления кверцетина [12]. Активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) определяли фотометрически по реакции восстановления гексацианоферрата (III) калия [13]. Концентрацию сукцината определяли с помощью набора Succinate Colorimetric Assay Kit (Sigma-Aldrich, США). Окислительную модификацию белков определяли методом, основанным на реакции взаимодействия карбонильных групп и иминогрупп окисленных аминокислотных остатков с 2,4-динитрофенилгидразином с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов, обладающих специфическим спектром поглощения в ультрафиолетовой и видимой областях спектра. Общее количество продуктов окислительной модификации белков (ОМБ) определяли по суммарной площади под кривой спектра поглощения. Затем рассчитывали доли ранних и поздних маркеров окислительной деструкции белков — альдегиддинитрофенилгидразонов (АДНФГ) и кетондинитрофенилгидразонов (КДНФГ) нейтрального и основного характера. АДНФГ нейтрального характера имеют максимумы поглощения при 230, 254, 270, 280, 356 нм, а основного — при 428 и 430 нм. Максимумы абсорбции света для КДНФГ нейтрального характера наблюдаются при 363 и 370 нм, а для основных — при 434, 520, 535 нм. АДНФГ являются маркерами фрагментации белков, а КДНФГ — их агрегации. Нейтральный или основный характер карбонильных производ­ных характеризует степень повреждения нейтральных и основных аминокислот. Дополнительно рассчитывался резервно-адаптационный потенциал белков как доля в % суммарной площади под спектром абсорбции света спонтанной ОМБ к площади ОМБ, индуцированной с помощью реакции Фентона (последняя принималась за 100 %). Чем ниже доля продуктов спонтанного окисления, тем выше резервно-­адаптационный потенциал [9].

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программ Microsoft Office Excel 2016 и StatPlus 6.0. Соответствие выборок нормальному распределению проверяли посредством критерия Шапиро — Уилка. Так как распределение в выборках носило характер отличный от нормального, применялся критерий Манна — Уитни для попарного сравнения исследуемых групп. Статистически значимыми считали отличия при вероятности нулевой гипотезы об отсутствии различий p≤0,05.

Результаты и обсуждение

Из результатов, представленных в табл. 1, следовало, что для больных с ХОБЛ 2 (↓1-2 в 3,38 раз, p1-2=0,0025) и ХОБЛ 3 (↓1-3 в 3,15 раз, p1-3=0,0058) был характерен более низкий уровень активности СОД по сравнению с больными хроническим бронхитом. Наряду с этим, оценка активности СОД в мононуклеарных лейкоцитах периферической крови при ХОБЛ средней тяжести (группа 2) и тяжелой ХОБЛ (группа 3) не выявила статистически значимых отличий (p=1,0).

 

Таблица 1. Биохимические показатели мононуклеарных лейкоцитов крови исследуемых групп больных

Исследуемый показатель	Хронический бронхит (группа 1) (n=13)	ХОБЛ 2 (группа 2) (n=17)	ХОБЛ 3 (группа 3) (n=20)
Активность СОД, у.е./106 клеток в 1 мл суспензии	65,84[42, 93;67, 29] (p1-2=0,0025 p1-3=0,0058)	19,48[16, 48;25, 49] ↓1-2 в 3,38 раз	20,85[15, 54;26, 96] ↓1-3 в 3,15 раз
Активность СДГ, нмоль сукцината/мин* 106 клеток в 1 мл суспензии	76,83[66, 67;162, 75] (p1-2=0,0281 p1-3=0,0263)	16,88[10, 30;40, 54] ↓1-2 в 4,55 раз	30,67[14, 20;43, 20] ↓1-3 в 2,5 раз
Концентрация сукцината, нмоль/106 клеток в 1 мл суспензии	560[464;763] (p1-2=0,0133 p1-3=0,005)	273[241;446] ↓1-2 в 2,05 раз	296[381;361] ↓1-3 в 1,89 раз

Результаты представлены в форме: медиана [1-ый квартиль; 3-ий квартиль]; СОД – супероксиддисмутаза, СДГ – сукцинатдегидрогеназа; n — количество больных в группе исследуемых.

 

Более низкий показатель активности СОД мононуклеарных лейкоцитов позволил сделать предположение о, вероятно, более выраженном повреждении лимфоцитов и моноцитов в условиях окислительного стресса, являющегося значимой частью патогенеза ХОБЛ [1]. Это предположение нашло подтверждение в увеличении общего уровня спонтанно окисленных белков моноядерных лейкоцитов периферической крови у больных с ХОБЛ 2 (↑1-2 в 2,45 раз, p1-2=0,0176) и ХОБЛ 3 (↑1-3 в 2,94 раз, p1-3=0,0168) по сравнению с показателем больных с хроническим бронхитом (табл. 2). При этом прирост площади под кривой поглощения (S) ­АДНФГ (↑1-2 в 2,55 раз, p1-2=0,0034; ↑1-3 в 3,23 раз, p1-3=0,0048) и КДНГФ (↑1-2 в 2,49 раз, p1-2=0,0034; ↑1-3 в 2,92 раз, p1-3=0,0126) в ультрафиолетовой части спектра у больных группы 2 и группы 3 указывал на преимущественное повреждение аминокислотных остатков нейтрального характера по сравнению с показателями группы 1. Оценка соотношения ранних (АДНФГ) и поздних (КДНФГ) маркеров окислительного повреждения в мононуклеарных ­лейкоцитах у больных с ХОБЛ (%, ХОБЛ 2: АДНФГ 74,60[74, 46;75, 31], КДФНГ 25,40[24, 69;25, 54], ХОБЛ3: АДНФГ 74,25 [72, 84;75, 63], КДНФГ 25,75[24, 37;27, 16]) и с хроническим бронхитом (%, АДНФГ 72,93[71, 11;73, 28], КДФНГ 27,07[26, 72;28, 89]) выявила незначительное увеличение доли ранних маркеров окислительной деструкции белков.

 

Таблица 2. Содержание спонтанно-окисленных производных белков в мононуклеарных лейкоцитах
периферической крови исследуемых групп больных

	S АДНФГ uv	S КДНФГ uv	SАДНФГ vs	S КДНФГ vs	S ОМБ
Хронический бронхит (группа 1), у.е./106 клеток в 1 мл суспензии (n=13)	26,22 [24, 28;26, 89] (p1-2=0,0034 p1-3=0,0048)	10,30 [8, 71;11, 47] (p1-2=0,0034 p1-3=0,0126)	10,58 [5, 61;20, 3]	2,69 [2, 13;7, 10]	50,85 [44, 50;61, 63] (p1-2=0,0176 p1-3=0,0168)
ХОБЛ 2 (группа 2), у.е./106 клеток в 1 мл суспензии (n=17)	66,90 [38, 26;122, 58] ↑1-2 в 2,55 раз	25,70 [15, 16;36, 77] ↑1-2 в 2,49 раз	26,91 [16, 08;40, 24]	4,56 [3, 35;7, 22]	124,65 [72, 85;206, 25] ↑1-2 в 2,45 раз
ХОБЛ 3 (группа 3), у.е./106 клеток в 1 мл суспензии (n=20)	84,59 [34, 38;186, 94] ↑1-3 в 3,23 раз	30,07 [15, 98;62, 97] ↑1-3 в 2,92 раз	28,51 [13, 43;47, 59]	5,53 [2, 04;9, 59]	149,55 [65, 80;297, 75] ↑1-3 в 2,94 раз

Результаты представлены в форме: медиана [1-й квартиль; 3-й квартиль]; АДНФГ — альдегиддинитрофенил­гидразоны, КДНФГ — кетондинитрофенилгидразоны, S — значение площади под кривой, uv — в ультрафиолетовой области спектра, vs — в видимой области спектра; n — количество больных в группе исследуемых.

 

Увеличение соотношения продуктов спонтанного окисления к индуцируемому с помощью реакции Фентона демонстрировало более низкий резервно-адаптационный потенциал мононуклеарных лейкоцитов крови у больных 2-й и 3-й групп в сравнении с больными хроническим бронхитом, что, возможно, обуславливало нарушение способности мононуклеарных лейкоцитов поддерживать функциональную активность в условиях окислительного стресса при обострении заболевания (табл. 3).

 

Таблица 3. Отношение значений динитрофенилгидразонов мононуклеарных лейкоцитов, полученных
при спонтанном окислении, к значениям, полученным при индуцированном окислении белка

	Хронический бронхит (группа 1) (n=13)	ХОБЛ 2 (группа 2) (n=17)	ХОБЛ 3 (группа 3) (n=20)
АДФНГ uv, %	31,73[26, 59;31, 77] p1-2=0,017 p1-3=0,0015	49,13[28, 96;79, 72] ↑1-2 в 1,54 раз	69,05[68, 70;93, 46] ↑1-3 в 2,17 раз
АДФНГ vs, %	34,33[31, 86;53, 31]	60,93[46, 11;90, 55]	72,78[72, 13;93, 75]
КДФНГ uv, %	36,83[25, 61;40, 98] p1-2=0,017 p1-3=0,0067	50,56[30, 11;74, 00] ↑1-2 в 1,37 раз	82,89[71, 08;98, 97] ↑1-3 в 2,25 раз
КДФНГ vs, %	51,57[42, 50;60, 64]	57,51[42, 69;77, 31]	76,66[67, 97;97, 95]
Общая ОМБ, %	33,67[32, 64;34, 57] p1-2=0,0301 p1-3=0,0016	53,34[32, 36;82, 80] p2-3=0,0446 ↑1-2 в 1,58 раз	76,91[73, 80;99, 10] ↑1-3 в 2,28 раз ↑2-3 в 1,44 раз
Нейтральные, %	33,11[26, 28;34, 20] p1-2=0,017 p1-3=0,0015	49,52[29, 28;79, 63] ↑1-2 в 1,49 раз	71,56[69, 58;98, 45] ↑1-3 в 2,16 раз
Основные, %	35,48[34, 81;60, 71]	60,34[45, 48;88, 49]	75,36[73, 39;95, 68]

Результаты представлены в форме: медиана [1-й квартиль; 3-й квартиль]; АДНФГ — альдегиддинитрофенил­гидразоны, КДНФГ — кетондинитрофенилгидразоны, uv — в ультрафиолетовой области спектра, vs — в видимой области спектра.

 

При сравнении больных 2-й и 3-й групп показатели спонтанной окислительной модификации белков статистически значимо не отличались (+19,9%, p=0,96). При оценке соотношения спонтанной и металл-индуцируемой окислительной модификации белков отмечалось увеличение соотношения у больных с ХОБЛ 3 (+44,18%, p=0,0446), что указывало на снижение резервно-адаптационного потенциала окислительной модификации белков в мононуклеарных лейкоцитах больных 3-й группы. Возможно, это отражало большую интенсивность окислительного стресса, ­связанного с развитием обострения заболевания.

Таким образом, мононуклеарные лейкоциты больных с ХОБЛ по сравнению с больными с хроническим бронхитом при обострении характеризовались большей выраженностью окислительного повреждения и снижением антиоксидантной защиты, что, вероятно, создавало условия для нарушения их функциональной активности.

При изучении показателей энергообмена мононуклеарных лейкоцитов у больных с ХОБЛ по сравнению с больными с хроническим бронхитом была выявлена более низкая активность СДГ [↓1-2 в 4,55 раз, p1-2=0,0281; ↓1-3 в 2,55 раз, p1-3=0,0263] и меньшая концентрация сукцината [↓1-2 в 2,05 раз, p1-2=0,0133; ↓1-3 в 1,89 раз, p1-3=0,005]. В гипоксических условиях активация функционального комплекса II с соответствующим повышением активности СДГ позволяет митохондриям компенсаторно сохранить поступление восстановительных эквивалентов в цепь переноса электронов с сохранением энергопродуцирующей функции. В то же время принято считать, что при ­гипоксии сукцинат аккумулируется в клетках, обеспечивая реализацию адаптивных процессов, связанных с переключением путей окисления митохондриальных субстратов [8]. Выявленные отличия активности СДГ и концентрации сукцината, являющегося его субстратом, указывают, вероятно, на ингибирование процессов цикла Кребса по механизму отрицательной обратной связи в связи с накоплением избытка восстановленных коферментов и нарушение адаптивных процессов в митохондриях мононуклеарных лейкоцитов. Такое состояние в лимфоцитах и моноцитах у больных ХОБЛ при обострении, возможно, было связано с развитием острой гипоксии, когда на фоне быстрого снижения концентрации кислорода крови уменьшалось его содержание в митохондриях, что сопровождалось нарушением процесса переноса электронов с восстановленных коферментов на комплексы дыхательной цепи с образованием избытка активных форм кислорода.

Выявленные изменения показателей энергетического обмена в совокупности с исследованными маркерами окислительного стресса, отражающими окислительное повреждение белков лимфоцитов и моноцитов, обнаруживали декомпенсацию адаптивных процессов митохондрий, что косвенно подтверждало развитие митохондриальной дисфункции лимфоцитов и моноцитов у больных ХОБЛ по сравнению с больными хроническим бронхитом.

Выводым

У больных с ХОБЛ наблюдается нарушение процессов энергетического обмена митохонд­рий и развитие вторичной митохондриальной дисфункции в мононуклеарных лейкоцитах периферической крови.

В нашем исследовании выявлено, что в мононуклеарных лейкоцитах больных с ХОБЛ по сравнению с больными хроническим бронхитом регистрируется тенденция к снижению уровня антиоксидантной защиты и большей выраженности окислительного повреждения белков, что создает предпосылки для нарушения их функциональной активности.

Больные с тяжелой формой заболевания (ХОБЛ 3) характеризуются более выраженным повреждением мононуклеарных лейкоцитов, чем больные со средней степенью тяжести заболевания (ХОБЛ 2), что отражается в статистически значимом уменьшении резервно-­адаптационного потенциала окислительной модификации белков.

 

Исследование выполнено в рамках реализации внутривузовского гранта ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России № 2/17 «Исследование митохондриальной дисфункции лимфоцитов крови у больных хронической обструктивной болезнью легких как возможного предиктора тяжести заболевания».

Авторы выражают благодарность коллективу пульмонологического отделения ГБУ РО ОКБ г. Рязань за помощь в проведении исследования.

About the authors

E S Bel’skikh

Ryazan State Medical University n.a. academician I.P. Pavlov

Author for correspondence.
Email: ed.bels@yandex.ru
Ryazan, Russia

O M Uryas’ev

Ryazan State Medical University n.a. academician I.P. Pavlov

Email: ed.bels@yandex.ru
Ryazan, Russia

V I Zvyagina

Ryazan State Medical University n.a. academician I.P. Pavlov

Email: ed.bels@yandex.ru
Ryazan, Russia

S V Faletrova

Ryazan State Medical University n.a. academician I.P. Pavlov

Email: ed.bels@yandex.ru
Ryazan, Russia

References

Supplementary files