Clinical and immunological characteristics of patients with chronic hepatitis C during antiviral therapy in interferon-free regimen

Cover Page

Abstract


Aim. To study the biomarkers of liver inflammation that occur during antiviral therapy in the interferon-free regimen.

Methods. 14 patients were examined during antiviral therapy of chronic viral hepatitis C genotype 1. Treatment with dasabuvir, ombitasvir, paritaprevir and ritonavir for 12 weeks was received by 8 patients. Daklatasvir and asunaprevir was administered to 6 patients for 24 weeks. 11 patients had the concentrations of cytokines/chemokines (TNFα, CCL2/MCP-1, CCL20/MIP-3α, CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10, CXCL11/ITAC) measured in the blood plasma by multiplex analysis. In six patients, the content of CXCR3+ and CCR6+ receptors in different subpopulations of lymphocytes was determined by flow cytofluorimetry. Patients were divided into 2 groups: without liver fibrosis and with severe fibrosis.

Results. 100% demonstrated virologic response. In both groups, significant reduction of CXCL10/IP-10 concentration was found in the patients at the end of treatment compared to pre-therapy (p=0.025 and 0.00015, respectively). In the first group a tendency to increase of the relative content of T-lymphocytes (p=0.065) was observed, and in the second group, a significant increase of the relative content of TNKCCR6+ (p=0.02) was observed.

Conclusion. Chemokine CXCL10/IP-10 is a biomarker characterizing the decrease of liver inflammation during therapy and not depending on the degree of liver fibrosis. The tendency to increase of the relative content of T lymphocytes in the first group and a significant increase in TNKCCR6+ cells during treatment in the second group may play an important role in eliminating hepatitis C virus.


Введение

Вирус гепатита C (ВГС) является основной причиной заболевания печени. Также он занимает лидирующее место в прогрессии фиброза, развитии цирроза и гепатоцеллюлярной карциномы [1]. В последние два десятилетия растет внимание к этиотропной терапии хронического вирусного гепатита C (ХВГС) [2]. У пациентов, получавших противовирусную терапию (ПВТ), снижалась смертность, связанная с прогрессией фиброза печени и возникновением гепатоцеллюлярной карциномы. Долгие годы для лечения использовалась терапия, включавшая в себя применение препаратов интерферона и рибавирина, при этом пациенты достигали устойчивого вирусологического ответа (УВО) только в 28–46% случаев [3]. Ингибиторы протеазы вируса гепатита C — телапревир, боцепревир, нарлапревир, симепревир использовались для лечения пациентов, инфицированных ВГС 1 генотипа, в сочетании с пролонгированными интерферонами и рибавирином, что значительно увеличило долю пациентов, достигших УВО [4]. Через некоторое время появляется возможность лечения HCV-инфекции с помощью безинтерферонового режима терапии с эффективностью 95–100 % [5].

Переносимость пациентами ПВТ в безинтерфероновом режиме гораздо выше, чем ПВТ с использованием интерферонов, ­однако цена таких препаратов остается ­неизменно высокой. Поэтому актуальным оказывается вопрос о прогнозе эффективности терапии в зависимости от особенности иммунологического ответа, обусловленного генетическим свое­образием организма человека. Цитокины и хемокины являются ключевыми медиаторами воспалительного процесса и формирования иммунитета, ответственного за естественную элиминацию ВГС и результат ПВТ. С появлением безинтерфероновой терапии стало возможным лучше изучить взаимодействие ВГС и иммунной системы пациента, так как в этом случае отсутствует экзогенная стимуляция, индуцируемая интерферонами [6]. Длительное воспаление и прогрессия фиброза связаны с повышенной продукцией воспалительных хемокинов и медиаторов воспаления, постоянной активацией NK-клеток, печеночных моноцитов/макрофагов, по большей части Купферовских клеток [7]. Среди печеночных биомаркеров воспаления хемокин протеин-10 (CXCL10/IP-10), индуцируемый интерфероном-гамма (INF-γ), играет важную роль в патогенезе HCV-инфекции и связан с активацией воспаления в печени, а также со степенью развития фиброза [8, 9].

Цель: оценить динамику клинико-лабораторных изменений у пациентов с ХВГС во время ПВТ в безинтерфероновом режиме, а также изучить изменения биомаркеров воспаления печени, в том числе CXCXL10/IP-10.

Материалы и методы исследования

Было проведено исследование среди пациентов с ХВГС во время проведения ПВТ в период с 2015 по 2016 гг. Лечение проводилось на кафедре инфекционных болезней взрослых и эпидемиологии ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургскоий государственный педиатрический медицинский университет» Минздрава России, клинической базой которого явились отделения СПбГБУЗ «Клиническая инфекционная больница им. С.П. Боткина» и ФБУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера».

Было обследовано 14 пациентов в возрасте от 33 до 71 года во время проведения ПВТ в безинтерфероновом режиме. Средний возраст пациентов составил 49,5±7,5 лет.

Для подтверждения диагноза ХВГС у всех пациентов на начальной точке исследования проводилась серологическая диагностика с определением суммарных антител к ВГС (HCV Ab). Методом полимеразной цепной реакции проводили молекулярно-биологическое исследование (обнаружение ВГС в плазме крови пациента и выявление уровня вирусной нагрузки [ВН] и молекулярно-генетическое исследование [определение генотипа вируса]). Кроме того, у всех пациентов проводили дополнительные исследования для исключения наличия маркеров вируса гепатита В, ВИЧ и сифилиса.

Биохимический анализ крови включал определение активности цитолитических фер­ментов аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы (АлАТ и АсАТ), концентрации общего билирубина, активности амилазы, щелочной фосфатазы (ЩФ), гамма-глютамилтранспептидазы (ГГТП), протромбинового индекса (ПТИ).

Определение степени выраженности фиброза печеночной ткани проводилось с помощью непрямой транзиентной эластометрии печени.

Общая характеристика пациентов, включенных в исследование, представлена в табл. 1.

 

Таблица 1. Общая характеристика пациентов

Пол пациентов, м:ж

4:10

Средний возраст пациентов, лет

49,5±7,5

Уровень билирубина, мкмоль/л

18,0±11,3

Активность АлАТ, МЕ/л

99,8±1,5

Активность АсАТ, МЕ/л

102,2±2,6

Медиана вирусной нагрузки, МЕ/л

5,4 х 105

Генотип HCV, 1b:1a, абс.

13:1

Степень фиброза (по METAVIR), абс.

F0

3

F1

0

F2

0

F3

3

F4

8

ПВТ с использованием пролонги­рованных интерферонов в анамнезе, абс.

9

 

При проведении ПВТ в безинтерфероновом режиме у 8 пациентов применяли комбинированный препарат: дасабувир, омбитасвир, паритапревир, ритонавир в течение 12 недель. У 3 пациентов в комбинации с рибавирином. Остальные шесть пациентов получали даклатасвир и асунапревир в течение 24 недель. Эффективность ПВТ ХГС определялась по процентной доле пациентов, у которых уровень ВН в плазме крови был ниже определяемого уровня на 2–4 неделю терапии.

Дополнительное иммунологическое исследование цитокинов/хемокинов во время ПВТ было проведено у 11 пациентов, определение Т- и В-клеток, несущих на своей поверхности хемокиновые рецепторы, проводилось у 6 пациентов.

В плазме крови измеряли концентрации цитокинов/хемокинов: TNFα, CCL2/MCP-1, CCL20/MIP-3α, CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10, CXCL11/ITAC методом мультиплексного анализа по технологии xMAP («Luminex») с использованием коммерческих тест-систем «Milliplex MAP» («Millipore») (США), основанных на магнитных микросферах «Milliplex Mag» (США), согласно инструкциям производителя. Регистрацию и анализ данных проводили на приборе «Luminex MAGPIX» («Luminex») (США).

У шести пациентов также были оценены процентные содержания CXCR3+ и CCR6+ лимфоцитов: Т-клеток, Th (Т-хелперов), CTL (цитотоксических лимфоцитов), NK-клеток (натуральных киллеров) и B-лимфоцитов методом проточной цитофлюориметрии с использованием различных комбинаций моноклональных антител: для оценки CTL и NK-клеток — CD3/CD16,56/CXCR3/CCR6/CD8, В-лимфоцитов и Тh — CD19/CD3/CXCR3/CCR6/CD4.

Для определения статистически значимых различий медиан был использован критерий Краскела-Уоллиса с уровнем значимости р<0,05.

Результаты исследования

Все пациенты, получавшие ПВТ, были разделены на две группы. Принципом деления на группы послужила разная выраженность фиброза печени. В первую группу были отнесены пациенты с отсутствием фиброза печени — F0, а во вторую — с выраженным фиброзом и циррозом печени — F3–F4. Количество наблюдаемых пациентов составило: в первой группе — 3 человека, а во второй — 11 больных.

В процессе ПВТ у всех пациентов обеих групп ВН достигла неопределяемого уровня на 2–4 неделях терапии и оставалась таковой в течение всей терапии и при последующем наблюдении в течение 12 недель.

Также к моменту достижения пациентами вирусологического ответа происходила нормализация активности печеночных ферментов: АлАТ и АсАТ (рис. 1), щелочной фосфатазы и гамма-глютамилтранспептидазы. Средние значения показателей концентрации общего билирубина и ПТИ были в пределах нормы.

 


Рис. 1. Изменение активности АлАТ (слева) и АсАТ (справа) у пациентов с ХВГС в процессе ПВТ

 

У части пациентов обеих групп были определены концентрации цитокинов/хемокинов: TNFα, CCL2/MCP-1, CCL20/MIP-3α, CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10, CXCL11/ITAC (I группа — 2 человека, II группа — 9 человек), а у 6 пациентов были определены субпопуляции Т- и В-лимфоцитов с CXCR3 и CCR6 рецепторами (I группа — 2 человека, II группа — 4 человека). Величины иммунологических показателей в процессе терапии были сопоставлены с показателями группы условно здоровых людей. Для случаев достоверного изменения иммунологических показателей их величины приведены в табл. 2.

 

Таблица 2. Изменение иммунологических показателей (медианы) во время проведения противовирусной терапии в безинтерфероновом режиме

Время

Показатель

Начало

6/12 нед.

12/24 нед.

Досто­верность* (p)

CCL10/IP-10 (F0), пг/мл

1139

603

292

0,025

CCL10/IP-10
(F3-4), пг/мл

1898

933

615

0,00015

CD3(F0), %

67

69

76

0,065

TNKCCR6+(F3-4), %

5,6

9,9

10,7

0,02

* достоверность изменения этих показателей, рассчитанная по трем временным точкам методом Краскела-­Уоллиса.

 

В группе пациентов, не имевших фиброза печени, были обнаружены достоверно значимые снижения концентрации CXCL10/IP-10 к окончанию лечения по сравнению с ­показателями до начала терапии (р=0,025) (рис. 2). Перед проведением терапии медианы для этого показателя превышали медианы в группе здоровых доноров в 6,8 раз и стали приближаться к нормальным показателям к окончанию терапии (превышение составило 1,7 раза).

 


Рис. 2. Концентрации хемокина CXCL10/IP-10 на разных этапах терапии для групп с фиброзом F0 и F3–4 в сравнении с верхней границей нормы (UN).

 

У пациентов второй группы (F3–4) наблюдалось уменьшение концентраций CXCL10/IP-10 к окончанию лечения (p=0,00015) (рис.2). Перед проведением терапии медиана этого показателя в 11,4 раза превышала медиану в контрольной группе. К окончанию терапии превышение снизилось до 3,7 раз. А также в этой группе к окончанию терапии наблюдалась тенденция к уменьшению концентрации CCL3/MIP-1α (p=0,09).

По данным проточной цитометрии в первой группе наблюдалась тенденция к увеличению относительного содержания T-лимфоцитов (p=0,065), а во второй группе — достоверное увеличение относительного содержания TNKCCR6+ (p=0,02) в процессе лечения (рис. 3). На старте терапии этот показатель был в 10 раз меньше, чем в норме, а к окончанию терапии различие сократилось до 5 раз.

 


Рис. 3. Относительное содержание CD3+ лимфоцитов для группы с фиброзом F0 (слева) и TNKCCR6+ для группы с фиброзом F3–4 (справа) на разных этапах терапии в сравнении с нормой (светло-серым показана область, ограничивающая интерквартильный размах, а пунктир соответствует медиане для показателей нормы).

 

Обсуждение

В результате полученных нами данных во время проведения ПВТ в безинтерфероновом режиме у всех пациентов был достигнут УВО, что подтверждает литературные данные о высокой эффективности безинтерфероновой терапии [5].

Согласно научным сведениям CXCL10/­IP-10 является предиктором отсутствия ответа на ПВТ. В статьях ряда авторов [9, 10] сообщается о положительной корреляции между уровнем CXCL10/IP-10 и ответом на лечение пролонгированными интерферонами и рибавирином. Известно, что уровень CXCL10/IP-10 в крови пациентов увеличивается в ответ на введение в организм экзогенного интерферона. В статье Prinapori R. и соавторов исследовалось изменение уровня CXCL10/IP-10 у 8 пациентов через 48 часов после первого ­введения интерферона. ­Показано, что у всех ­пациентов повышался уровень данного хемокина, была обнаружена слабая взаимосвязь между наступлением раннего вирусологического ответа и увеличением уровня CXCL10/IP-10 через 48 часов после начала интерфероновой терапии [11].

В данном исследовании мы проанализировали изменения биомаркеров воспаления печени во времени у пациентов с HCV-инфекцией, получавших ПВТ в безинтерфероновом режиме. В результате анализа изменения концентраций различных воспалительных цитокинов/хемокинов оказалось, что уровень CXCL10/IP-10 значительно снижался к окончанию лечения. Это полностью совпадает с данными Mascia C. и соавторов [12], в статье которых сообщается о снижении уровня CXCL10/IP-10 у пациентов, развивших после лечения УВО уже к концу 1 месяца. Это наблюдалось как в группе пациентов, получавших пролонгированные ­интерфероны, рибавирин и один из препаратов прямого ­противовирусного действия (телапривир или боцепривир), так и в группе пациентов, получавших терапию в безинтерфероновом режиме.

Также в статье Serti E. и соавторов [13] сообщается о понижении сывороточного уровня CXCL10/IP-10 и CXCL11/ITAK в процессе терапии у пациентов, ответивших на ПВТ, с использованием даклатасвира и асунапревира. Однако к моменту окончания терапии уровни этих хемокинов не снижались до значений нормы. В нашем исследовании содержание данных хемокинов также превышает нормальные значения к окончанию лечения.

Нами не было выявлено различий в степени снижения сывороточного уровня CXCL10/IP-10 у пациентов с разной степенью фиброза, что соответствует данным Diago M. и соавторов [14].

Выводы

Эффективность ПВТ в безинтероновом режиме по данным настоящего исследования составила 100 %. Среди изученных показателей основным биомаркером, характеризующим снижение воспалительного процесса в печени во время проведения ПВТ, является хемокин CXCL10/IP-10. Снижение сывороточного уровня хемокина CXCL10/IP-10 во время ПВТ не зависело от степени фиброза печени.

Во время ПВТ наблюдались повышение относительного содержания TNKCCR6+-клеток у пациентов с выраженным фиброзом печени и тенденция к повышению относительного содержания T-лимфоцитов, что, вероятно, может играть ведущую роль в элиминации ВГС.

 

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

V V Basina

Saint Petersburg State Pediatric Medical University

Author for correspondence.
Email: v.basina@mail.ru
Saint-Petersburg, Russia

A A Sukhoruk

Saint Petersburg State Pediatric Medical University; Saint-Petersburg Pasteur Research Institute of Epidemiology and Mictobiology

Email: v.basina@mail.ru
Saint-Petersburg, Russia; Saint-Petersburg, Russia

N A Arsentieva

Saint-Petersburg Pasteur Research Institute of Epidemiology and Mictobiology

Email: v.basina@mail.ru
Saint-Petersburg, Russia

N E Lyubimova

Saint-Petersburg Pasteur Research Institute of Epidemiology and Mictobiology

Email: v.basina@mail.ru
Saint-Petersburg, Russia

A V Semenov

Saint-Petersburg Pasteur Research Institute of Epidemiology and Mictobiology

Email: v.basina@mail.ru
Saint-Petersburg, Russia

E V Esaulenko

Saint Petersburg State Pediatric Medical University; Saint-Petersburg Pasteur Research Institute of Epidemiology and Mictobiology

Email: v.basina@mail.ru
Saint-Petersburg, Russia; Saint-Petersburg, Russia

A A Totolyan

Saint-Petersburg Pasteur Research Institute of Epidemiology and Mictobiology

Email: v.basina@mail.ru
Saint-Petersburg, Russia

  • World Health Organization. Hepatitis C. Key facts. http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/hepatitis-c (access date: 18.06.18).
  • Angeli P., Bernardi M., Villanueva C. et al. European Association for the Study of the Liver. EASL Clinical Practice Guidelines: management of patients with decompensated cirrhosis. J. Hepatol. 2018; 69 (2): 406–460. doi: 10.1016/j.jhep.2018.03.024.
  • Esaulenko E.V., Vysochinskaya V.V., Nikitina O.E. The effectiveness of combined antiviral therapy in patients with chronic hepatitis C, 1B genotype with various degrees of fibrosis. Zhurnal infektologii. 2012; 4 (3S): 75. (In Russ.)
  • Maevskaya M.V., Ivashkin V.T., Znojko O.O. at el. Efficacy and safety of the national inhibitor of Narlaprevir protease in primary and previously treated patients with chronic hepatitis C caused by the 1st genotype virus, without liver cirrhosis (results of the Pioneer study). Rossijskij zhurnal gastroehnterologii, gepatologii, koloproktologii. 2017; 27 (6): 41–51 (In Russ.)
  • Ivashkin V.T., Maevskaya M.V., Аbdurakhmanov D.T. et al. Modern possibilities of antiviral therapy using Daclatasvir in the treatment of patients with chronic viral hepatitis C: results of the individual access program. Rossijskij zhurnal gastroehnterologii, gepatologii, koloprotologii. 2017; 27 (6): 52–62. (In Russ.)
  • Lin J.C., Habersetzer F., Rodriguez-Torres M. et al. Interferon γ-induced protein 10 kinetics in treatment-naive versus treatment-experienced patients receiving interferon-free therapy for hepatitis C virus infection: implications for the innate immune response. J. Infect. Dis. 2014; 210 (12): 881–885. doi: 10.1093/infdis/jiu325.
  • Bility M.T., Nio K., Li F. et al. Chronic hepatitis C infection-induced liver fibrogenesis is associated with M2 macrophage activation. Sci. Rep. 2016; (6): 39520. doi: 10.1038/srep39520.
  • Kazankov K., Barrera F., Moller H.J. et al. Soluble CD163, a macrophage activation marker, is independently associated with fibrosis in patients with chronic viral hepatitis B and C. Hepatology. 2014; 60 (2): 521–530. doi: 10.1002/hep.27129.
  • Sandler N.G., Koh C., Roque A. et al. Host response to translocated microbial products predicts outcomes of patients with HBV or HCV infection. Gastroenterology. 2011; 141 (4): 1220–1230. doi: 10.1053/j.gastro.2011.06.063.
  • Askarieh G., Alsio A., Pugnale P. et al. Systemic and intrahepatic interferon-gamma-inducible protein 10 kDa predicts the first-phase decline in hepatitis C virus RNA and overall viral response to therapy in chronic hepatitis C. Hepatology. 2010; 51: 1523–1530. doi: 10.1002/hep.23509.
  • Prinapori R., Sticchi L., Alicino C. et al. Role of HCV-RNA decay and IP-10 levels after 48 hours of standard HCV therapy as predictors of rapid virological response. Clin. Res. Hepatol. Gastroenterol. 2015; 39: 705–710. doi: 10.1016/j.clinre.2015.04.001.
  • Mascia C., Vita S., Zuccalà P. et al. Changes in inflammatory biomarkers in HCV infected patients undergoing direct acting antiviral-containing regimens with or without interferon. PLoS ONE. 2017; 12 (6): e0179400. doi: 10.1371/journal.pone.0179400.
  • Serti E., Chepa-Lotrea X., Kim Y. J. et al. Successful Interferon-Free Therapy of Chronic Hepatitis C Virus Infection Normalizes Natural Killer Cell Function. Gastroenterology. 2015; 149 (1): 190–200. doi: 10.1053/j.gastro.2015.03.004.
  • Diago C. M., Castellano G., GarcoAa-Samaniego J. et al. Association of pretreatment serum interferon gamma inducible protein 10 levels with sustained virological response to peginterferon plus ribavirin therapy in genotype 1 infected patients with chronic hepatitis. Gut. 2006; 55 (3): 374–379. doi: 10.1136/gut.2005.074062.

Views

Abstract - 40

PDF (Russian) - 40

PlumX


© 2018 Basina V.V., Sukhoruk A.A., Arsentieva N.A., Lyubimova N.E., Semenov A.V., Esaulenko E.V., Totolyan A.A.

Creative Commons License

This work is licensed
under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International License.


Свидетельство о регистрации СМИ ЭЛ № ФС 77-70434 от 20 июля 2017 года выдано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор)