Reaction of hemostasis system in hypercapnic hypoxia after the course of mexidol assessed by the method of thromboelastography

Cover Page

Abstract


Aim. To study the reaction of hemostasis system to a single effect of hypercapnic hypoxia of maximum intensity in rats and possibility of correcting hemostasis disorders by means of a preliminary course of an antihypoxant - mexidol.

Methods. The study involved sexually mature male rats (48 specimens) of the Wistar line with an average mass of 274.0 ± 32.0 g. The rats were kept on a standard diet, food and water were fed once a day between 10 and 11 hours. In the evening, animals underwent a single hypercapnic hypoxia in a special flow chamber. The state of hypercapnic hypoxia of maximum intensity was modeled at O2 content of 5.0 %, CO2 - 5.0 % during a single 20-minute exposure. As a training regimen, a 30-fold course of mexidol was used, the drug was administered intraperitoneally to rats at a dose of 50 mg/kg for 1.5 hours prior to exposure to hypercapnic hypoxia.

Results. After a single exposure to hypercapnic hypoxia of maximum intensity, shortening of the onset of clot formation, an increase of alpha angle, and maximum clot density were recorded. Also, the clot formation time shortened and the maximum clot lysis index increased. With a single exposure to hypercapnic hypoxia of maximum intensity after the course of mexidol, a decrease in the maximum clot density was recorded.

Conclusion. A single exposure to hypercapnic hypoxia of maximum intensity was characterized by a shift of hemostatic potential toward hypercoagulability along with fibrinolytic system activation. The course use of antihypoxant mexidol, preceding hypercapnic hypoxia of maximum intensity, significantly reduces the risk of clot formation.


Острая гиперкапническая гипоксия (ГГ) может возникнуть при нарушении штатной работы системы кислородообеспечения, когда в воздухе герметического объекта содержание кислорода снижается, а концентрация углекислого газа увеличивается. Также ГГ наблюдается при некоторых заболеваниях ­сердечно-сосудистой, дыхательной систем и сис­темы крови [1, 2].

Установлено, что ГГ вызывает в организме человека и животных сложную интегральную реакцию, определенная роль в которой принадлежит системе гемостаза [3, 4]. Ранее было выявлено, что различные режимы ГГ приводят к смещению гемостатического баланса в сторону тромбинемии [5, 6]. В то же время в других исследованиях показано, что ГГ вызывает активацию тромбоцитарного звена, гипокоагуляцию коагуляционного звена [7] и активацию фибринолитической системы крови [8].

В настоящее время для обеспечения выживаемости человека в условиях острой ГГ используются в основном средства индивидуального жизнеобеспечения [2, 9]. Однако их применение ограничено из-за громоздкос­ти, большой стоимости, сложности эксплуатации и способности ограничивать движения и обзор, а также затруднять прием пищи, воды и т.п. [1, 10]. В то же время поддержание жизнеспособности в условиях острой гипоксии на дос­таточно высоком уровне возможно с помощью лекарственных средств, обладающих антигипоксическими свойствами [11].

Дефицит энергии, лежащий в основе любой формы гипоксии, в том числе и при ГГ, приводит к качественно однотипным метаболическим и структурным сдвигам в различных органах и тканях: возникновению ацидоза, активации свободно-радикального окисления, повреждению биологических мембран, затрагивающему как липидный бислой, так и мембранные белки. Среди фармакологических препаратов метаболического типа действия особое место занимает антигипоксант мексидол [11], представляющий собой сукцинатсодержащее производное 3-оксипиридина (2-этил-6-­метил-3-оксипиридина сукцинат) [12].

Мексидол подавляет агрегацию тром­боци­тов, вызываемую коллагеном, тромбином, АДФ и арахидоновой кислотой, ингибирует фосфодиэстеразу циклических нуклеотидов тромбоцитов, а также защищает клетки крови при механической травме [13]. Установлено, что мексидол обеспечивает подавление агрегации и адгезии тромбоцитов и лейкоцитов, по­вышает пластичность эритроцитов, улуч­шает реологические свойства крови, что спо­собствует устранению нормокапнической гипоксии [14].

Показано, что при нормокапнической гипоксии со стороны системы гемостаза мексидол нормализует как сосудисто-­тромбоцитарные (что проявляется в сохранности самих кровяных пластинок и их свойств), так и коагуляцион­ные механизмы, а также фибринолитические свойства крови. Это может быть основанием применения препарата при нарушениях гемостаза, вызванных воздействием нормокапнической гипоксии [8, 15].

Стоит отметить однако, что данные об эффективности применения антигипоксантов при моделировании ГГ в литературе отсутствуют.

В связи с вышеизложенным целью настоя­щей работы стало изучение реакции системы гемостаза на однократное воздействие ­гиперкапнической гипоксии максимальной интенсивности у крыс и возможность коррекции гемостазиологических нарушений с помощью предварительного курсового применения ­мексидола.

Исследования выполнены на 48 половозрелых крысах-самцах линии Wistar сред­ней массой 259,0 ± 36,0 г. Все экспериментальные животные были разделены на 4 группы: две контрольные (n = 12 × 2) и две опытные (n = 12 × 2).

1-я и 2-я опытные группы подвергались однократному воздействию ГГ максимальной интенсивности путем помещения крыс на 20 мин в камеры с газовой средой, содержащей 5,0 ± 0,5 % О2 и 5,0 ± 0,5 % СО2. Кроме того, 2-й опытной группе животных за 1,5 ч (время обусловлено пиком концентрации препарата в плазме крови [14]) до воздействия гиперкапнической гипоксии предварительно на протяжении 30 дней ежедневно осуществлялось внутрибрюшинное введение мексидола (50 мг/кг).

Режим максимальной интенсивности воздействия гиперкапнической гипоксии был подобран экспериментальным путем, при котором наблюдалась 100 % выживаемость животных.

Контрольные группы помещались в ту же камеру на аналогичное по продолжительности время, что и опытные группы, однако в этом случае вместо газовой смеси компрессором нагнетался атмосферный воздух, а вместо мексидола осуществлялось введение 0,9 % раствора NaCl по той же схеме.

Для моделирования ГГ использовали спе­циальную проточную камеру, в которую при помощи компрессора подавалась заданная смесь газов со скоростью 15 л/мин. Камера имела выпускное отверстие, соединенное при помощи шланга с емкостью, наполненной водой, что обеспечивало стравливание из камеры повышенного давления газов. Контроль газового состава камеры производили при помощи газоанализатора «Microlux O2 + CO2» (ООО «Микролюкс», Екатеринбург, Россия).

Забор крови у всех групп животных выполняли на фоне наркотизации путем внутрибрюшинного введения раствора золетила в дозе 5 мг/100 г.

Кровь для исследования в объеме 5 мл получали путем забора из печеночного синуса в полистироловый шприц, содержащий 0,11 М (3,8 %) раствора натрия цитрата (соотношение крови и цитрата — 9:1) [16]. До проведения эксперимента на протяжении недельной адаптации к условиям вивария все крысы находились в стандартных условиях содержания согласно требованиям «Надлежащей ­лабораторной ­практики» (Good Laboratory Practice, GLP). Использование крыс в экспериментах осуществляли в соответствии с Европейской конвенцией по охране позвоночных животных, используемых в эксперименте, а также Директивами 86/609/EEC [17]. Обезболивание и умерщвление животных проводили в соответствии с правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных. Работа была одобрена этическим комитетом ФГБОУ ВО АГМУ Мин­здрава РФ. Протокол № 1 от 29 января 2018 г.

В настоящей работе для оценки системы гемостаза использовался интегральный метод исследования — тромбоэластография. Запись тромбоэластограммы с использованием активатора «Start-tem» проводилась на аппарате «Rotem Gamma» (Германия) [18].

В ходе расшифровки тромбоэластограммы учитывались следующие показатели.

Время начала образования сгустка (СТ). Описывает время от начала анализа до распознаваемого начала формирования сгустка посредством добавления активатора (реагенты и кальций). Время начала образования сгустка является важным параметром активизации показателей свертывания, а также их баланса с соответствующими ингибиторами.

Время образования сгустка (CFT). Отображает кинетику образования стойкого сгустка из тромбоцитов и фибрина. Время образования сгустка зависит в основном от количества тромбоцитов и особенно от их участия в формировании сгустка. Кроме того, на время образования сгустка влияет уровень фибриногена и его склонность к полимеризации.

Угол альфа (α ̊) — угол, построенный по касательной к тромбоэластограмме из точки начала образования сгустка. Отображает скорость роста фибриновой сети и ее структурообразование (увеличение прочности сгустка).

Максимальная плотность сгустка (MCF) представляет собой максимальную величину амплитуды формирования сгустка, достигнутую к моменту, когда активируется процесс фибринолиза. Максимальная плотность сгустка является одним из наиболее важных парамет­ров в тромбоэластометрии.

Максимальный лизис (ML) соответствует максимальной интенсивности фибринолиза, обнаруженной в течение анализа, и определяется как нахождение самой низкой амплитуды после достижения MCF [18].

Все цифровые данные, полученные в ходе исследования, подвергались статистической обработке. Данные исследований представлены в виде m [25 % ÷ 75 %], где m — ­медиана в ­выборочной совокупности, [25 % ÷ 75 %] — 25-й и 75-й перцентили. Достоверность различий оценивали при помощи непараметрического U-критерия Манна — Уитни. Различия считались достоверными при уровне статистической значимости р < 0,05. Для обработки и хранения полученного экспериментального материала создавали базы данных с использованием редактора электронных таблиц Microsoft Excel 2010. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли при помощи программ математической статистики Jmp Statistical Discovery v 6.1.2 и Biostat 5.03 на персональном компьютере [16, 18].

Сравнительный анализ результатов данных тромбоэластографии, зарегистрированных после однократного воздействия ГГ максимальной интенсивности, без/после предварительного введения мексидола в течение 30 дней приведен в табл. 1.

 

Таблица 1. Показатели системы гемостаза плазмы крови крыс при однократном воздействии гиперкапнической ­гипоксии максимальной интенсивности без/после использования курсового приема мексидола (m [25 % ÷ 75 %])

Показатели

Однократное воздействие ГГ максимальной интенсивности
(5,0 % О2, 5,0 % СО2)

Однократное воздействие ГГ максимальной интенсивности (5,0 % О2, 5,0 % СО2) после 30-кратного курсового применения
мексидола (50 мг/кг)

Контроль 1

Опыт 1

Контроль 2

Опыт 2

CT, с

236,0

[219,3 ÷ 252,8]

124,0***

[116,2 ÷ 140,3]

174,0

[168,2 ÷ 181,2]

188,7

[179,3 ÷ 190,5]

α ̊

59,0

[52,0 ÷ 64,0]

78,0**

[72,3 ÷ 84,0]

62,8

[57,1 ÷ 69,5]

67,2

[64,0 ÷ 72,8]

CFT, с

124,0

[118,9 ÷ 128,3]

72,0***

[67,4 ÷ 76,0]

92,0

[88,2 ÷ 101,4]

88,4

[85,5 ÷ 95,6]

MCF, мм

67,0

[64,2 ÷ 73,6]

79,0

[70,6 ÷ 82,4]**

76,0

[68,4 ÷ 79,8]

68,0**

[65,3 ÷ 71,0]

ML, %

1,0

[0,8 ÷ 1,3]

2,0

[1,8 ÷ 2,3]*

0,0

[0,0 ÷ 0,0]

0,0

[0,0 ÷ 0,0]

Примечание: обозначены статистически значимые отличия от соответствующих показателей группы контроля: * — при p < 0,05; ** — при p < 0,01; *** — при p < 0,001. ГГ — гиперкапническая гипоксия. СТ — время коагуляции; α — угловая константа; MCF — максимальная амплитуда ТЭГ; CFT — время образования сгустка; ML — максимальный лизис.

 

По данным тромбоэластографии после однократного воздействия ГГ максимальной интенсивности было зарегистрировано укорочение времени начала образования сгустка (CT) на 47,0 % (p < 0,001) на фоне повышения угла α ̊ на 32,0 % (p < 0,01) и максимальной плотности сгустка (MCF) на 18,0 % (p < 0,001). Также выраженно укорачивалось время образования сгустка (CFT) на 42,0 % (p < 0,001). Увеличение функциональной активности фибринолитичес­кой системы подтверждалось повышением показателя максимального лизиса (ML) в два раза (p < 0,05). Для наглядности полученных ­данных представлены тромбоэластограммы животных из контрольной и опытной групп (рис. 1, рис. 2). В описанных выше экспериментах показано, что однократное воздействие ГГ максимальной интенсивности без предшествующего курсового введения мексидола сопровождается активацией как тромбоцитарного, так и коагуляционного звеньев гемостаза, а также активацией фибринолитической системы крови.

 


Рис. 1. Тромбоэластограмма (контрольная группа, животное № 5), зарегистрированная после однократного пребывания в камере в течение 20 мин в условиях обычного атмосферного давления

 


Рис. 2. Тромбоэластограмма (опытная группа, животное № 1), зарегистрированная сразу после однократного воздействия гиперкапнической гипоксии максимальной интенсивности (О2 — 5 %; СО2 — 5 %) в течение 20 мин

 

Зафиксированные изменения частично подтверждаются результатами, полученными W.D. Toff (2006), показавшего, что вдыхание гиперкапнической смеси (5,0 % СО2 в воздухе) стимулировало гемокоагуляцию вследствие усиления контактной и фосфолипидной активаций пусковых механизмов системы свертывания, повышения тромбопластиновой и тромбиновой активностей, снижения антикоагулянтного потенциала и неферментативного фибринолиза [8].

По данным тромбоэластографии при однократном воздействии ГГ максимальной интенсивности после курсового введения мексидола было зарегистрировано уменьшение показателя максимальной плотности сгустка (MCF) на 11 % (p < 0,01), по остальным показателям достоверных отличий зафиксировано не было. В качестве примера представлены тромбоэластограммы, полученные у животных из контрольной и опытной групп (рис. 3, рис. 4). Предварительное курсовое применение мексидола во многом нормализовало гемостазиологическую картину, зарегистрированную после однократного воздействия ГГ ­максимальной интенсивности. При этом было обнаружено лишь снижение максимальной плотности сгустка, что может быть связано со снижением количества тромбоцитов, а также угнетением их способности к агрегации. Этот факт может быть объяснен тем, что СО2 способен стимулировать эндотелиальную NO-синтазу [19], приводящую к увеличению содержания в кровотоке NO, обладающего мощным дез- и антиагрегантным действием [20]. Кроме того, известно, что мексидол самостоятельно улучшает кровообращение в сосудистом русле, ингибируя агрегацию тромбоцитов и повышая антитромбогенный потенциал крови.

 


Рис. 3. Тромбоэластограмма (контрольная группа, животное № 3), зарегистрированная при однократном воздействии гиперкапнической гипоксии максимальной интенсивности (О2 — 5 %, СО2 — 5 %) в течение 20 мин после 30-кратного введения 0,9 % раствора NaCl

 


Рис. 4. Тромбоэластограмма (опытная группа, животное № 4), зарегистрированная при однократном воздействии гиперкапнической гипоксии максимальной интенсивности (О2 — 5 %, СО2 — 5 %) в течение 20 мин после 30-кратного введения мексидола

 

Выводы

Однократное воздействие ГГ максимальной интенсивности приводит к гиперкоагуляции в системе гемостаза.

Предварительное 30-кратное введение мексидола (50 мг/кг) перед воздействием ГГ максимальной интенсивности устраняет состояние гиперкоагуляционного сдвига в системе ге­мостаза.

Мексидол повышает резистентность организма к воздействию экстремальных факторов и кис­лородзависимым патологическим сос­тояниям.

 

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

S V Moskalenko

Altai State Medical University; Scientific Research Institute of Physiology and Fundamental Medicine

Author for correspondence.
Email: sunrisemsv@gmail.com
Barnaul, Russia; Novosibirsk, Russia

I I Shakhmatov

Altai State Medical University; Scientific Research Institute of Physiology and Fundamental Medicine

Email: sunrisemsv@gmail.com
Barnaul, Russia; Novosibirsk, Russia

Yu A Bondarchuk

Altai State Medical University; Scientific Research Institute of Physiology and Fundamental Medicine

Email: sunrisemsv@gmail.com
Barnaul, Russia; Novosibirsk, Russia

O V Alekseeva

Altai State Medical University; Scientific Research Institute of Physiology and Fundamental Medicine

Email: sunrisemsv@gmail.com
Barnaul, Russia; Novosibirsk, Russia

O M Ulitina

Altai State Medical University; Scientific Research Institute of Physiology and Fundamental Medicine

Email: sunrisemsv@gmail.com
Barnaul, Russia; Novosibirsk, Russia

  1. Novikov V.E., Katunina N.P. Pharmacology and biochemistry of hypoxia. Obzor po klinicheskoy farmakologii i ­lekarstvennoy terapii. 2002; 1 (2): 73–78. (In Russ.)
  2. Agadzhanyan N.A., Stepanov O.G., Arkhipenko Yu.V. Adaptation to hypoxia as a method of treatment and prevention of mucosal damage of stomach and duodenum. Byulletenʹ ehksperimentalʹnoy biologii i meditsiny. 2001; 132 (9): 358–360. (In Russ.)
  3. Shakhmatov I.I., Vdovin V.M., Kiselev V.I. State of hemostasis in different types of hypoxic effect. Byulletenʹ SO RAMN. 2010; 2: 131–138. (In Russ.)
  4. Grinevich I.V. Effect of adaptation to hypoxic hypoxia on cellular composition of the spleen. Patologiya. 2011; 8 (2): 127–129. (In Russ.)
  5. Пак Г.Д. Влияние дыхательной гипоксии на свер-
  6. Pak G.D. Effect of respiratory hypoxia on coagulation system in dogs. Vestnik AN KazSSSR. 1979; 10: 50–52. (In Russ.)
  7. Mannucci P.M., Gringeri A., Peyvandi F., Paolantonio T. Di, Mariani G. Short-term exposure to high altitude causes coagulation activation and inhibits fibrinolysis. Thrombosis and Haemostasis. 2002; 87 (2): 342–343. doi: 10.1055/s-0037-1612997.
  8. Kulikov V.P., Polukhina M.G., Bespalov A.G., et al. Effect of hypoxic-hypercapnic preconditioning on hemostasis, reology and tolerance of brain to ischemia. Regionalʹnoe krovoobrashchenie i mikrotsirkulyatsiya. 2004; 3 (1): 27–32. (In Russ.)
  9. Toff W.D., Jones C.I., Ford I., Pearse R.J., Watson H.G., Watt S.J., et al. Effect of hypobaric hypoxia, simulating conditions during long-haul air travel, on coagulation, fibrinolysis, platelet function, and endothelial activation. JAMA. 2006; 295: 2251–2261. doi: 10.1001/jama.295.19.2251.
  10. West J.B., Schoene R.B., Milledge J.S. High Altitude Medicine and Physiology. USA: Hodder Arnold. 2007; 499 p.
  11. Stratienko E.N., Petukhova N.F. Search for ways of pharmacological correction of hypoxia. Vestnik Bryanskogo gosudarstvennogo universiteta. 2012; 4 (2): 232–234. (In Russ.)
  12. Aleksandrov O.V., Struchkov P.V., Vinitskaya R.S., et al. Clinical functional effect of interval normobaric hypoxic therapy for patients with chronic obstructive bronchitis and bronchial asthma. Terapevticheskiy arkhiv. 1999; 3: 28–32. (In Russ.)
  13. Levchenkova O.S., Novikov V.E. Inductors of regulatory factor of adaptation to hypoxia. Rossiyskiy mediko-biologicheskiy vestnik imeni akademika I.P. Pavlova. 2014; 2: 134–143. (In Russ.)
  14. Karki­shchenko N.N. Pharmacology of adaptation processes and endurances of maximum loads in sports and operating mode “to overflowing“: the second time for generics. Biomeditsina. 2010; 4: 6–23. (In Russ.)
  15. Chukaev S.A. Evaluation of mecsidol pharmacotherapeutical efficiency as a remedy of correction at hypoxia, ischemia and reoxigination injury. Vestnik Buryatskogo gosudarstvennogo universiteta. 2014; 12: 19–24. (In Russ.)
  16. Mikulyak N.I., Ivanov P.V, Zakharkin A.G. Experimental studies of antioxidant mexidole medicine on hemostasis in x-ray therapy. Kubanskiy nauchnyy meditsinskiy vestnik. 2009; 1: 72–76. (In Russ.)
  17. Moskalenko S.V., Shakhmatov I.I., Bondarchuk Yu.A., et al. Effect of single and multiple impact of hypoxic hypoxia of strong intensity on the state of the hemostatic system in rats. Sibirskiy nauchnyy meditsinskiy zhurnal. 2018; 1: ­32–37. (In Russ.)
  18. European Convention for the Protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purposes. Strasburg: Council of Europe. 1986; 51 p.
  19. Moskalenko S.V. Hemostasis in rats in isolated and combined effect of mexidol and hypoxic hypoxia with the use of thromboelastography. Fundamentalʹnye i prikladnye issledovaniya: problemy i rezulʹtaty. 2016; 27: 34–43. (In Russ.)
  20. Checchin D., Sennlaub F., Sirinyan M., Brault S., Zhu T., Kermorvant-Duchemin E., et al. Hypercapnia prevents neovascularization via nitrative stress. Free Radical Biology and Medicine. 2006; 40: 543–553. doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2005.09.016.
  21. Kimura C., Koyama T., Oike M., Ito Y. Hypotonic stress-induced NO production in endothelium depends on endogenous ATP. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000; 3: 736–740. doi: 10.1006/bbrc.2000.3205.

Views

Abstract - 75

PDF (Russian) - 51

PlumX


© 2018 Moskalenko S.V., Shakhmatov I.I., Bondarchuk Y.A., Alekseeva O.V., Ulitina O.M.

Creative Commons License

This work is licensed
under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International License.


Свидетельство о регистрации СМИ ЭЛ № ФС 77-75008 от 1 февраля 2019 года выдано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор)