Toxic effect of titanium dioxide nanoparticles on morphological characteristics of thymus

Full Text

К наночастицам (НЧ) относят изолированные твердофазные объекты, имеющие отчетливо выраженную границу с окружающей средой, размеры которых во всех трех измерениях сос­тавляют от 1 до 100 нм. Ряд уникальных ­физико-химических свойств НЧ обуславливает их широкое использование в различных отраслях промышленности и биомедицине. Вместе с тем существует оправданное опасение, что их небольшие размеры являются причиной беспрепятственного прохождения через биологические барьеры, а очень высокая удельная поверхность (в расчете на единицу массы) и реакционная способность могут привести к увеличению продукции активных форм кислорода и далее к пов­реждению биологических структур.

Среди применяемых в настоящее время наноматериалов широко используются НЧ диоксида титана (TiO₂). Они обладают рядом потребительских достоинств, связанных с хорошей фотокаталитической активностью, высокой химической и термической стабильностью и относительно невысокой стоимостью. Однако быстрый рост числа публикаций о токсическом воздействии НЧ TiO₂ на различные органы и ткани определяет высокий интерес исследователей к биологической безопасности их использования. При этом последствия повреждения различных клеточных типов организма и причины такой уязвимости к воздействию НЧ практически не исследованы.

Неблагоприятное воздействие НЧ TiO₂ на клеткии ткани человека может проявиться как в производственных условиях, так и в результате преднамеренного использования, связанного с их включением в состав продовольственных, промышленных и фармакологических товаров. В настоящее время НЧ TiO2 широко используются для производства красок, бумаги, пластмасс, чернил, лекарственных препаратов, продуктов (пищевая добавка E171), косметики, зубных паст, солнцезащитных кремов и т.д. [1]. К пищевым продуктам с высоким содержанием НЧ TiO2 относятся жевательные резинки и леденцы [2]. По данным просвечиваю­щей электронной микроскопии около 36 % частиц в составе Е171 имеют размер меньше, чем 100 нм [3]. Однако следует подчеркнуть, что исследования по безопасности НЧ существенно отстают от масштабного их использования. ­Несмотря на то, что наноматериалы активно используются уже более 15 лет, ни один из них не был изучен в полном объеме на безопасность ни в одной стране мира. Вместе с тем для подавляющего большинства токсикологов очевидно, что наночастицы должны рассматриваться как потенциально опасные материалы [4]. Для дальнейшего безопасного развития нанотехнологий и их внедрения во все сферы жизни необходимо углублять представления о структуре и свойствах нанообъектов, выявлять фундаментальные принципы и закономерности их ­поведения и воздействия на окружающую среду и живые организмы.

Среди различных систем организма наиболее уязвимой к любым неблагоприятным воздействиям является иммунная система. Уже хорошо известно, что результатом негативного воздействия различных НЧ на иммунную систему человека является угнетение ее функций и, как следствие этого, увеличение час­тоты и тяжести инфекционных заболеваний, а также повышение риска злокачественных новообразований [5]. Кроме того, нарушение иммунологических функций организма, вызванное воздействием НЧ, может спровоцировать развитие аллергических и аутоиммунных заболеваний [6]. Такая иммуносупрессия связана, в том числе, и с процессами, происходящими в этих условиях в тимусе [7, 8], который является одним из ключевых звеньев иммунной системы, обеспечивающих антигеннезависимую дифференцировку Т-лимфоцитов и секрецию гормонов, поддерживающих численность этих клеток. По этой причине тимус особенно восприимчив к действию различных токсикантов как за счет непосредственного контакта с ними, так и за счет высвобождения высоких доз глюкокортикоидов, являясь следствием воздействия НЧ [9, 10].

Таким образом, структурно-функциональные изменения в тимусе, возникающие на фоне воздействия различных токсикантов, являются важными показателями их иммунотоксичнос­ти. Однако до сих пор нет достаточных сведений о клеточных основах нарушений в этой железе при воздействии наноматериалов, в частности НЧ TiO₂, что объясняется в том числе и низкой информативностью классических морфологических подходов. Использование иммуногистохимических методов при адекватном подборе маркеров позволяет корректно идентифицировать как клеточный сос­тав, так и функциональные изменения клеток тимуса, возникающие на фоне введения этих НЧ. В нашей работе с использованием специ­фичных маркеров пролиферации клеток (Ki-67), апоптоза (p53) и специфичного маркера макрофагов (CD68) проведено исследование тимуса крыс после перорального введения наночастиц TiO₂.

Цель исследования — изучение влияния наночастиц диоксида титана на морфофункцио­нальное состояние вилочковой железы крыс при их пероральном введении.

Объектом исследования являлся тимус половозрелых самцов крыс линии Wistar массой 170–210 г (n = 24). Исследование влияния НЧ TiO₂ на морфофункциональные показатели тимуса проводили после перорального введения крысам опытной группы изучаемого соединения (10 мг/кг массы тела животного, ежедневно в течение 28 дней). Крысам контрольной группы перорально вводили дистиллированную воду в том же объеме. Животных выводили из эксперимента на 30-й день опыта путем декапитации под эфирным наркозом с соблюдением основных требований к эвтаназии, изложенных в Приложении № 4 к «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных». Всех животных содержали в одинаковых условиях вивария на стандартном сбалансированном рационе, при свободном дос­тупе к воде и пище, в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей. Исследование одобрено Локальным Этическим комитетом ФГБУН «Институт биохимии и генетики» Уфимского научного центра РАН (протокол № 2 от 25 апреля 2016 г.). В работе использовалась дисперсия диоксида титана (рутильная форма, 40–60 нм), полученная разведением порошка TiO₂ в дистиллированной воде. Агрегацию наночастиц предотвращали обработкой суспензии нанодисперсного TiO₂ в ультразвуковой ванне.

Забор и фиксацию материала проводили согласно общепринятой методике. Для гистологического исследования готовили парафиновые срезы толщиной 4–6 мкм, которые окрашивали гематоксилин-эозином, пикрофуксином по Ван Гизону и изучали с помощью микроскопа AxioImager Z1 (C. Zeiss, Германия). Определяли относительную площадь (%), занимаемую корковым и мозговым веществом, общее число клеток на площади 100 мкм². С целью идентификации различных клеточных элементов в структурно-функциональных зонах тимуса и оценки его функционального состояния применяли иммуногистохимический метод окрашивания срезов (4–6 мкм) с использованием моноклональных антител, маркера пролиферации клеток — Ki-67 (MKI67), апоптоза — p53(FL-393), специфичного маркера макрофагов — CD68 (клон ED1) (SantaCruzBiotechnology, США) и системы визуализации ­Leica BOND (Novocastra™, Германия) с докрас­кой гематоксилином. Положительную реакцию оценивали по коричневому окрашиванию ядра (для маркера Ki-67) или цитоплазмы (для маркера CD68), ядра и цитоплазмы (для маркера p53). Количество клеток, экспрессирующих изу­чаемые маркеры, выражали в виде среднего числа Ki-67-, p53- и CD68-иммунопозитивных клеток. Статистическую обработку полученных данных осуществляли с использованием лицензионного пакета прикладных программ Statistica V7.0 (Stat Soft Inc., США). В модуле «Основные статистики» («Basic Statistics») по всем изученным количественным показателям были подсчитаны следующие основные характеристики: выборочное среднее (Mean), стандартную ошибку среднего (Standard Error of Mean) и стандартное отклонение (Standard Deviation). Поскольку распределение признаков в группах, оцененное с помощью критерия Шапиро — Уилка (Shapirо — Wilk’s W-test), соответствовало закону нормального распределения, для сравнительного анализа групп использовали параметричес­кие методы (t-критерий Стьюдента). Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

Изучение препаратов тимуса, окрашенных гематоксилин-эозином, показало, что в конт­рольной группе он имеет типичное дольчатое строение, характерное для этого вида животных. Исследование структурных особенностей тимуса животных опытной группы позволило выявить морфологические изменения со стороны паренхиматозного и стромально-­сосудистого компонентов органа. Структурные преобразования тимуса крыс на фоне воздейс­твия НЧ TiO₂ проявлялись в увеличении количества соединительно-тканного компонента (рис. 1–1), выраженном утолщении капсулы и междольковых перегородок, расширении и полнокровии сосудов микроциркуляторного русла с явлениями стаза/сладжа эритроцитов, что, возможно, связано с отеком. Морфометрический анализ тимуса контрольной группы показал, что площади субкапсулярной зоны и глубокой зоны коры, а также мозгового вещества дольки существенно изменяются по сравнению с аналогичными показателями животных интактной группы (табл. 1). Так, в тимусе экспериментальных животных установлено уменьшение доли коркового вещества на 17,6 % (р = 0,024). Вместе с тем в этой зоне тимуса отмечается значительное снижение плотности клеточной популяции за счет уменьшения количества тимоцитов: число лимфоцитов на единицу площади в субкапсулярной зоне снижается на 26,7 %, а в глубоком корковом веществе — на 19,3 %.

Таблица 1. Площади (%) морфофункциональных зон тимуса контрольной и опытной групп животных (M ± Sd)

Примечание: * — статистически значимые различия по сравнению с контролем (p < 0,05).

 
Рис. 1. Тимус крысы контрольной (А) и опытной (Б) групп животных
Примечание: 1 — окраска по Ван Гизону; 2 — иммуногистохимическое окрашивание антителами к ­ядерному антигену пролиферирующих клеток (Ki-67). Непрямая стрептавидин-биотиновая система детекции. Ув.100; 3 — иммуногистохимическое окрашивание антителами к белку p53. Непрямая стрептавидин-биотиновая система детекции. Ув.100; 4 — иммуногистохимическое окрашивание антителами к CD68-маркеру макрофагов. Непрямая стрептавидин-биотиновая система детекции. Ув.100.

Вероятно, уменьшение плотности клеток за счет сокращения числа лимфоцитов в тимусе опытной группы животных связано с падением их пролиферативного потенциала, что нашло подтверждение в результатах оценки уровня экспрессии маркера пролиферации Ki-67. ­Иммуногистохимическое типирование позволило обнаружить, что в условиях воздействия НЧ TiO₂ наблюдается снижение числа Ki-67-позитивных клеток в корковом веществе долек вилочковой железы (р = 0,013) (табл. 2, рис. 1–2).

Таблица 2. Среднее число Ki-67- и p53-иммунопозитивных клеток в морфофункциональных зонах долек тимуса ­контрольных и опытных групп животных (M ± Sd)

Примечание: * — статистически значимые различия по сравнению с контролем (p < 0,05).

На фоне воздействия НЧ TiO₂ количество клеток, экспрессирующих р53 в корковом ­веществе дольки тимуса опытной группы животных, значительно увеличилось по сравнению с аналогичным показателем интактных крыс, тогда как в мозговом веществе уровень экспрессии p53 остался примерно на прежнем уровне (табл. 2, рис. 1–3), что нашло подтверждение в том числе и при изучении препаратов тимуса опытной группы животных, окрашенных гематоксилин-эозином, где в дольках железы определялось увеличение клеток с признаками деструкции.

Как уже было отмечено выше, важнейшим клеточным типом тимуса являются макрофаги, участвующие как в антигеннезависимой дифференцировке Т-лимфоцитов, так и в селекции плохо обученных клеток. Изменение количества макрофагов может свидетельствовать об эффективности функционирования тимуса. У животных опытной группы при иммуногистохимической оценке уровня экспрессии маркера макрофагов CD68 в тимусе обнаруживается тенденция к увеличению количества макрофагов (рис. 1–4). Среднее число CD68-иммунопозитивных клеток в корковом веществе тимуса опытной группы увеличилось в 2,61 раза, а в мозговом веществе — в 1,35 раза. Это может быть связано суказанными выше реактивными изменениями в микроциркуляторном русле органа и, как следствие этого, с увеличением количества мигрирующих моноцитов в тимус.

Таким образом, нами установлено, что под воздействием НЧ TiO₂ в тимусе крыс обнаруживаются реактивные изменения, заключающиеся в гибели лимфоцитов, уменьшении их относительной плотности в корковом веществе долек органа, увеличении объема междольковой ­соединительной ткани, возможном нарушении гемодинамики. Поскольку тимус обеспечивает дифференцировку тимоцитов и синтез гормонов, регулирующих созревание лимфоцитов, то площадь субкапсулярной зоны коры является одним из показателей функциональной активности органа. Обнаруженное нами уменьшение площади коркового вещества тимуса при воздействии НЧ TiO₂, возможно, свидетельст­вует о снижении функциональных возможнос­тей этой железы и угнетении лимфоцитопоэза и дифференцировки лимфоцитов в нем. Уменьшение числа лимфоцитов в корковом веществе тимуса может привести к сокращению их популяции в периферической крови. Таким образом, НЧ TiO₂ в изученной концентрации оказывают ингибирующий эффект на функциональную активность тимуса, и, как следствие этого, по-­видимому, происходит угнетение как клеточного, так и гуморального иммунных ответов.

Морфологические изменения тимуса под воздействием НЧ TiO₂ могут быть связаны в том числе с повреждением ДНК лимфоцитов, что проявляется в снижении их пролиферативной активности и усилении апоптоза. Это нашло подтверждение в результатах проведенного исследования. Наши данные согласуютсяс данными проведенных в последние годы исследований токсического действия НЧ TiO₂ на других моделях, свидетельствующие об иммуносупрессивном действии последних. Так, при изучении влияния внутрибрюшинного введения мышам в течение четырех недель НЧ TiO₂ на иммунные клетки и рост клеток меланомы (В16/F10) Moon E.Y., et al. (2011 г.) обнаружили угнетение пролиферации B- и T-лимфоцитов, усиление процессов апоптоза различных видов клеток, активацию макрофагов, а также значительное увеличение размера опухоли [11]. В другой работе внутрижелудочное введение НЧ TiO₂ значительно снижало пролиферациюCD4+ и CD8+ Т-клеток, а также их соотношение в печени мышей, что в конечном итоге приводило к подавлению иммунного ответа [12].

Известно, что эпителиальные клетки тимуса продуцируют и секретируют целый спектр гормонов, к которым принадлежат тимулин, тимозин и тимопоэтин. Гормоны тимуса принимают участие в создании специфической внутренней среды тимуса, где пролиферируют и созревают лимфоциты, и таким образом влияют на антигеннезависимый и антигензависимый этапы дифференцировки Т-лимфоцитов, созревание регуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов в тимусе, функциональные свойства Т-лимфоцитов, активность макрофагов и т.д. Полученные нами данные могут свидетельствовать не только о прямом действии НЧ на клетки тимуса, но и возможный вклад в эти процессы может внести нарушение уровня гормональной активности.

Токсичность НЧ TiO₂ и молекулярные механизмы их действия на различные ткани организма в последние годы активно изучаются, однако до сих пор нет полной картины последствий их влияния на организм. Вместе с тем в исследованиях in vitro показано [13, 14] — воздействие различных НЧ приводит к повышенной генерации активных форм кислорода во многих клетках организма, что является одним из повреждающих факторов для большинства изученных клеток. Применительно к НЧ TiO₂ обнаружено, что их воздействие приводит к усилению перекисного окисления липидов, активации ряда каспаз, в конечном итоге к повреждению ДНК. Как следствие этого — последующая гибель клеток [15].

В качестве одной из причин иммуносупрессивного эффекта НЧ TiO₂, как уже отмечалось выше, рассматривается индукция образования активных форм кислорода в большинстве различных клеточных типов организма, а иммунокомпетентные клетки являются высокочувствительными к действию свободных радикалов, которые вызывают в них развитие окислительного стресса и, по-видимому, способствуют угнетению иммунитета [16]. Полученные данные указывают на то, что в предложенных условиях усиление процессов апоптоза значительно превосходит репаративный потенциал железы, что и определяет деструктивные процессы в органе, которые были нами обнаружены.

Вывод

Таким образом, можно утверждать, что среди механизмов реализации токсического влияния НЧ TiO₂ важное значение имеют увеличение интенсивности апоптоза,угнетение пролиферации и дифференцировки лимфоцитов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

About the authors

L A Sharafutdinova

Author for correspondence.
Email: sharafla@yandex.ru
Ufa, Russia

K N Sinel’nikov

Email: sharafla@yandex.ru
Ufa, Russia

V V Valiullin

Email: sharafla@yandex.ru
Kazan, Russia

References

Supplementary files