Proof of the oligomeric nature of fibrinogen b
- Authors: Litvinov R.I.1
-
Affiliations:
- Medical Institute. SV Kurashova and the Kazan State Pedagogical University named after V. I. Lenin
- Issue: Vol 61, No 1 (1980)
- Pages: 45-47
- Section: Articles
- Submitted: 18.03.2021
- Accepted: 18.03.2021
- Published: 31.01.1980
- URL: https://kazanmedjournal.ru/kazanmedj/article/view/63639
- DOI: https://doi.org/10.17816/kazmj63639
- ID: 63639
Cite item
Full Text
Abstract
A study using chromatographic and immunochemical methods showed that fibrinogen B precipitated by ß-naphthol from the blood plasma of sick people has an oligomeric nature. These data, taking into account the chemical composition of fibrinogen B, suggest that fibrinogen B is a variant of soluble fibrin-monomer complexes. This determines the clinical significance of the ß-naphthol test as an express method for the diagnosis of thrombinemia.
Keywords
Full Text
Исследование с применением хроматографического и иммунохимического методов показало, что фибриноген Б, осаждаемый ß-нафтолом из плазмы крови больных людей, имеет олигомерную природу. Эти данные с учетом химического состава фибриногена Б позволяют утверждать, что фибриноген Б предоставляет собой вариант растворимых комплексов фибрин-мономера. Это определяет клиническое значение пробы с ß-нафтолом как экспресс-метода диагностики тромбинемии.
Ключевые слова: фибриноген Б, химическая природа.
2 рисунка. Библиография: 20 названий.
Фибриногеном Б называют белок, который осаждается из патологической плазмы крови при добавлении раствора ß-нафтола в этаноле. Фибриноген Б часто обнаруживается у больных с признаками внутрисосудистой активации свертывания крови [4, 7, 8 и др.], что позволяет использовать реакцию на фибриноген Б для диагностики типеркоагулемии.
Известно, что появление фибриногена Б в крови вызывается действием на фибриноген микроколичеств тромбина [2, 6] и образованием мономерного фибрина [3]. Электрофоретическое- исследование фибриногена Б показало, что его основу составляет фибриноген [5], а анализ полипептидного спектра и N-концевых аминокислот позволил обнаружить в фибриногене Б 13 —18% мономерного фибрина с сохраненными фибринопептидами В.
Исходя из этих результатов, можно предположить, что фибриноген Б — это растворимые производные фибриногена, содержащие фибрин-мономер. Такие производные, известные под названием растворимых комплексов фибрин-мономера (РКФМ), действительно обнаруживаются в крови больных людей [14, 17, 20]. Однако, чтобы окончательно подтвердить идентичность фибриногена Б и РКФМ, необходимо доказать олигомерную природу фибриногена Б, что и сделано в настоящей работе.
Кровь больных острым инфарктом миокарда брали из вены широкой иглой без шприца в пластиковую посуду и смешивали со стабилизатором в отношении 9 : 1 по объему. Состав стабилизатора: 0,1 М цитрат натрия, 0,02 М Nа2-ЭДТА, 500 КІ ед./мл; трасилола (Bayer, ФРГ). Бестромбоцитную плазму получали центрифугированием при 2500 ё в течение 20 мин при комнатной температуре.
Фибриноген Б осаждали из плазмы крови 2% раствором ß-нафтола в 50% этаноле, добавляя к 4 мл плазмы 0,6 мл реактива [12]. Образующийся осадок отделяли центрифугированием (600 g, 5 мин) и ресолюбилизировали в 3 мл фосфатно-цитратного буфера pH 7,2 при 37°С. Нерастворившуюся часть отделяли центрифугированием или фильтрованием через стеклянный фильтр.
Плазму или раствор фибриногена Б подвергали гель-хроматографии на Сефарозе 4В (Pharmacia Fine Chemicals Uppsala, Швеция). Размеры колонки — 2,5 X 90 СМ, объем наносимой пробы — 2 мл, рабочее давление — 30 см вод. ст., скорость тока — 10 мл/час, объем собираемых фракций — 3 мл. Свободный объем колонки, определенный по суспензии Е. coli, равен 81 мл. В качестве элюента использовали фосфатно-цитратный буфер pH 7,2, содержащий 0,05% азида натрия [11].
Анализ фракций проводили по поглощению при 280 нм. Для обнаружения в производных использовали реакцию торможения гемагглютинации таннизированных эритроцитов [18]. Кроличью сыворотку с антителами к фибриногену человека получали по Кискеру и соавт. [16], фибриноген человека для иммунизации — методом Т. В. Варецкой [1]. Количество коагулируемого белка, определенное по методу Атенцио и соавт. [10], составляло 97,6%. В реакции иммунодиффузии в геле агара адсорбированная сыворотка была моноспецифичной (см. рис. 1).
Хроматография на геле агарозы стала распространенным методом выявления высокомолекулярных производных фибриногена и их препаративного выделения. В наших опытах хроматографии в стандартных условиях подвергались: 1) плазма, содержащая фибриноген Б; 2) фибриноген Б, осажденный из этой плазмы; 3) плазма, оставшаяся' после осаждения фибриногена Б; 4) контрольная плазма, не содержащая фибриногена Б. Результаты опытов представлены на рис. 2.
На рис. 2 А отчетливо видно, что исходная плазма больного инфарктом миокарда содержит производные фибриногена с большой молекулярной массой (пик 2), объем элюции которых меньше объема элюции фибриногена (соответственно 120 и 144 мл). Профиль элюции этой плазмы сходен с хроматографической кривой, полученной для
Именно эти производные являются наиболее важным компонентом фибриногена Б, определяющим его пониженную растворимость в присутствии этанола и ß-нафтола. С учетом данных о присутствии мономерного фибрина в составе фибриногена Б, а также об иммунологическом родстве обнаруженных производных с фибриногеном, можно заключить, что фибриноген Б — это растворимые комплексы фибрин-мономера, имеющие олигомерную природу.
В надосадке плазмы, остающемся после отделения фибриногена Б, РКФМ не обнаруживаются (см. рис. 2 В). Количество фибриногена, по данным РТГА, значительно уменьшается, а большая его часть осаждается с фибриногеном Б. Это подтверждает наши данные о вовлечении фибриногена в осадок под действием этанола и ß-нафтола [5]. Важно подчеркнуть, что в ходе реакции происходит полное осаждение РКФМ и только частичное осаждение фибриногена. Это говорит о специфичности пробы с ß-шафтолом по отношению к РКФМ, хотя специфичность эта относительна.
Полученные данные в сочетании с результатами изучения молекулярного состава фибриногена Б позволяют однозначно определить природу фибриногена Б и установить его идентичность с РКФМ. Растворы этих комплексов, имеющих олигомерное строение и большую молекулярную массу, обладают наименьшей термодинамической устойчивостью. При добавлении денатурирующих веществ (этанола, ß-нафтола) в концентрации, не достаточной для осаждения фибриногена и других белков плазмы, РКФМ выпадают в осадок. При этом они увлекают за собой другие плазменные белки, которые взаимодействуют с РКФМ через нековалентные связи. Образование этих связей в условиях гидрофобизации водного раствора и уменьшения его диэлектрической константы существенно облегчается. Это приводит к соосаждению плазменных белков с РКФМ. Таким представляется механизм осаждения фибриногена Б, вытекающий из его олигомерной природы.
About the authors
R. I. Litvinov
Medical Institute. SV Kurashova and the Kazan State Pedagogical University named after V. I. Lenin
Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Кафедра биохимии; кафедра терапии № 1
Russian Federation