Role of O6-methylguanine-DNA methyltransferase and p53 in response of neuroblastoma cells to an alkylating agent temozolomide

Cover Page

Abstract


Aim. To study the role of p53 and O6-methylguanine-DNA methyltransferase in sensitivity of neuroblastoma cells to temozolomide.

Methods. The study was performed on SK.N.SH neuroblastoma cell line cultured in DMEM medium supplemented with fetal bovine serum and antibiotics penicillin-streptomycin in the standard conditions (37°C and 5% СО2). The cells were cultured with an alkylating agent temozolomide for 48-72 h. For particular experiments, cells were pre-cultured for 2 hours with O6-benzylguanine (a competitive inhibitor of O6-methylguanine-DNA methyltransferase) or nutlin-3a (reactivator of p53). Proliferative activity was evaluated by using a system of multiparametric analysis of cell cultures (RTCA iCELLigence) as well as MTS-based colorimetric assay. Protein expression was measured by Western blotting by using the corresponding monoclonal antibodies.

Results. Reactivation of p53 protein substantially inhibited proliferation rate of SK.N.SH cells. Cytotoxic effect of a medication was more significant compared to temozolomide considered as an agent of choice for chemotherapy for patients with glioblastoma multiform or neuroblastoma. Inhibition of O6-methylguanine-DNA methyltransferase also enhanced the cytotoxic effect of temozolomide, however, cytotoxic effect of a chemotherapeutic agent was less expressed compared to temozolomide, along with p53 reactivation.

Conclusion. Functional state of p53 protein in tumor cells is a more important prognostic marker of neuroblastoma cells’ sensitivity to an alkylating agent temozolomide compared to O6-methylguanine-DNA methyltransferase expression; in addition, reactivation of p53 protein induces the decrease of proliferation rate of neuroblastoma SK.N.SH cells and their death via apoptosis.


Нейробластомы — разновидность сόлидных злокачественных новообразований, возникающих из эмбриональных нейро­бластов симпатической нервной системы. Это наиболее частая экстракраниальная солидная бластома, встречающаяся у детей, составляющая до 14% всех новообразований детского возраста [1]. Агрессивный характер роста опухоли и её резистентность к большинству современных химиопрепаратов — главные факторы, определяющие неблагоприятный прогноз заболевания. Выживаемость детей с тяжёлой формой нейробластомы составляет всего 34%, несмотря на применение агрессивных форм лечения [2].

Темозоломид (ТМЗ) — алкилирующий агент, представляющий собой липофильное пролекарство. Служит препаратом выбора для проведения химиотерапии пациентам с некоторыми типами злокачественных новообразований, например мультиформной глиобластомой, а также нейробластомой. Это обусловлено, в частности, способ­ностью препарата проходить через гематоэнцефалический барьер и индуцировать повреждения (алкилирование) молекул дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), в результате чего происходит образование одно- и двунитевых разрывов, приводящих в конечном счёте к запуску программы апоптоза и/или клеточного старения в опухолевых клетках [3].

Внедрение данного препарата в практическую онкологию позволило улучшить прогноз заболевания и повысить медиану выживаемости у пациентов с мультиформной глиобластомой. К примеру, было показано, что медиана выживаемости для пациентов, в отношении которых применяли лучевую терапию в сочетании с ТМЗ, составляла 15 мес, в то время как без лечения данный показатель обычно не превышает 5–6 мес [4, 5]. Аналогичным образом были получены данные, подтверждающие высокую эффективность использования ТМЗ у пациентов с рецидивирующими и рефрактерными формами нейробластом [6, 7].

Тем не менее, неоднородность ответа вышеуказанных злокачественных новообразований на воздействие данного алкилирующего агента, обусловленная отсутствием чётко обозначенных молекулярных диагностических маркёров, определяющих чувствительность/резистентность вышеназванных опухолей в ответ на проведение химиотерапии ТМЗ, продолжает оставаться актуальной проблемой как для экспериментальной, так и для практической онкологии.

В настоящее время существует несколько точек зрения о формировании молекулярных механизмов резистентности нейробластом к действию ТМЗ. Одним из наиболее общепризнанных является уровень экспрессии в опухоли фермента О6-метилгуанин-ДНК-метилтранферазы (MGMT), способной перемещать ТМЗ-индуцированный алкильный радикал с гуанина на остаток цистеина в своём активном центре, тем самым обеспечивая эффективную репарацию вышеуказанных повреждений ДНК [8]. Тем не менее, результаты исследований последних лет показали отсутствие выраженной корреляции между уровнем экспрессии MGMT в опухолевых клетках и их ответом на воздействие алкилирующих агентов, в частности ТМЗ [9].

Другой фактор, способный оказать влияние на формирование резистентности опухолевых клеток к ТМЗ, — функциональная активность системы репарации ошибочно спаренных нуклеотидов ДНК (MMR-mismatch repair), включающей целый спектр белков, в первую очередь MSH2 и MSH6. Данная система репарации повреждений ДНК имеет большое значение для поддержания контроля «правильности» процессов репликации ДНК и активации соответствующих сигнальных путей при повреждении ДНК. В исследованиях некоторых авторов была обнаружена корреляционная ­зависимость между нарушениями в данной системе репарации повреждений ДНК и повышением устойчивости клеток глио­бластом к воздействию ТМЗ [10].

Кроме того, важным диагностическим маркёром, способным, на наш взгляд, определять характер ответа опухолевых клеток на воздействие ТМЗ, служит функциональная активность гена-онкосупрессора ТР53. Белок р53, кодируемый одноимённым геном, является ключевым регулятором множества клеточных процессов, в числе которых апоптоз, активация так называемых «чек-пойнтов» и остановка клеток в одной из фаз клеточного цикла, клеточное старение [11]. К примеру, у пациентов с мультиформной глиобластомой мутации данного онкосупрессора бывают достаточно частой находкой и обнаруживаются более чем у трети пациентов [12], что, на наш взгляд, может являться фактором, определяющим гетерогенность ответа пациентов с данным заболеванием на проведение химиотерапии ТМЗ.

Целью нашего исследования было определение прогностической значимости уровней экспрессии и функционального состояния всех вышеуказанных факторов (МGMT, элементов системы MMR и функционального состояния белка р53) в ответе опухолевых клеток нейробластомы на воздействие алкилирующого агента ТМЗ.

Исследования проведены на клеточной линии SK.N.SH (ATCC, США). Клетки культивировали в стандартных условиях (37 °C и 5% СО2) в культуральной среде DMEM (ПанЭко) с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco) и антибиотиков пенициллина-стрептомицина (Sigma). Клетки подвергали воздействию алкилирующого агента ТМЗ (Sigma) в отдельности, а также в комбинации со специфическим ингибитором MGMT — О6-бензилгуанином (Sigma) и реактиватором р53 — нутлином-3а (Sigma) в концентрациях 30 и 10 мкМ соответственно.

Уровень экспрессии белков определяли методом вестерн-блоттинга. Клеточные экстракты получали посредством лизиса клеток в радиоиммунопреципитационном буфере с добавлением ингибиторов протеаз и фосфатаз. Образцы (30 мкг) разделяли в 7,5 и 12% полиакриламидных гелях и переносили на нитроцеллюлозную мембрану посредством влажного трансфера. Инкубацию с первичными моноклональными антителами к белку р53 (общей и фосфорилированной формах; Santa Cruz Biotechnology), MGMT (Abcam), MSH2, MSH6 и маркёру апоптоза (расщеплённой форме каспазы-3; Cell Signaling) проводили при 4 °C в течение 16 ч. Вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой (Santa Cruz Biotechnology), добавляли в концентрации 1:1000, после чего мембраны инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре и визуализировали с посредством хемилюминесценции (Vilber Lourmat).

Для оценки жизнеспособности клетки засевали в 96-луночный планшет в концентрации 3,2×104 в лунку и через 24 ч подвергали инкубации с вышеуказанными соединениями в отдельности, а также в комбинации с химиопрепаратом ТМЗ. Спустя 48–72 ч культивирования клеток ­проводили колориметрический MTS-тест с использованием реагента CellTiter 96® AQueous MTS Reagent Powder (Promega) на планшетном анализаторе Multiscan FC (Thermo Scientific).

Пролиферативную активность опухолевых клеток оценивали с помощью системы многопараметрического анализа клеточных культур RTCA iCELLigence (ACEA, Biosciences). Для этого клетки в концентрации 5×104 засевали в 8-луночные планшеты и подвергали дальнейшему анализу.

На начальном этапе нашего исследова­ния была проанализирована пролиферативная активность опухолевых клеток в условиях инкубации с вышеуказанными препаратами в отдельности, а также при их комбинированном использовании. Ожидаемо ТМЗ оказывал умеренный ­ингибирующий ­эффект в­ отношении роста опухолевых клеток (рис. 1). Примечательно, что ингибирование MGMT при помощи О6-бензилгуанина приводило к усилению эффекта ТМЗ, при этом сам O6-BG ингибирующего эффекта на пролиферативную активность опухолевых клеток не оказывал (см. рис. 1, А). Было обнаружено значительное подавление скорости пролиферации опухолевых клеток в условиях реактивации белка-онкосупрессора р53 с помощью нутлина-3а (см. рис. 1, Б).

 


Рис. 1. Пролиферативная активность клеток в условиях преинкубации в течение 2 ч с О6-бензилгуанином (О6BG; А) и нутилином (NTL; Б) и последующим добавлением темозоломида (TMZ) в концентрации 200 мкМ

 

Результаты колориметрического MTS-­теста подтвердили значительное усиление гибели клеток нейробластомы в условиях реактивации белка р53. Также было ­показано усиление цитотоксического эффекта ТМЗ в отношении клеток нейробластомы на фоне предварительного ингибирования активности MGMT в опухолевых клетках (рис. 2).

 


Рис. 2. Цитотоксичность алкилирующего агента темозоломида (TMZ) в отдельности и в сочетании с ингибитором О6-метилгуанин-ДНК-метилтранферазы (О6-бензилгуанином — O6BG) и реактиватором р53 (нутилином — NTL)

 

Следующим этапом исследования было изучение уровней экспрессии вышеуказанных факторов в опухолевых клетках. Результаты иммуноблоттинга выявили значительное увеличение уровня экспрессии общей формы белка р53, что коррелировало с уменьшением скорости пролиферации клеток (рис. 3). Экспрессия белков MGMT, MSH2 и MSH6, напротив, уменьшалась.

 


Рис. 3.Уровни экспрессии белка О6-метилгуанин-ДНК-метилтранферазы (MGMT), р53 и его фосфорилированной формы (pP53Ser15), белков системы MMR (MSH2 и MSH6), расщеплённой формы каспазы-3 (сl.casp3) в условиях инкубации с темозоломидом (TMZ), нутлином-3а (NTL), О6-бензилгуанином (O6BG), а также их комбинацией в течение 72 ч

 

Примечательно, что при воздействии химиопрепарата ТМЗ в отдельности и, особенно, на фоне комбинированного воздействия данного химиопрепарата и ингибитора MGMT происходила выраженная активация белка р53, о чём свидетельствовало повышение уровня экспрессии фосфорилированной формы данного белка. При этом различия в уровнях экспрессии выше­указанных факторов не были обусловлены различной «белковой нагрузкой» в исследуемых лизатах опухолевых клеток, что подтверждалось одинаковым уровнем экспрессии белка актина во всех исследованных образцах.

Важно отметить, что нами также было обнаружено значительное усиление гибели опухолевых клеток по механизму апо­птоза в условиях реактивации белка р53
и/или ингибирования MGMT при наличии повреждений ДНК, индуцированных ТМЗ. Об этом свидетельствовало усиление уровня экспрессии расщеплённой формы каспазы-3, служащей общепризнанным маркёром гибели клеток по механизму апоптоза. При этом максимальное усиление гибели клеток происходило в условиях комбинированного воздействия химиопрепарата и реактиватора белка р53 (см. рис. 3).

Полученные нами результаты свидетельствуют о высокой цитотоксической активности нутлина-3а в отношении опухолевых клеток нейробластомы линии SK.N.SH. Важно отметить, что цитотоксический эффект данного препарата был более выражен по сравнению с эффектом алкилирующего агента ТМЗ, рассматриваемого в настоящее время в качестве «золотого стандарта» при проведении химиотерапии больным с некоторыми типами злокачественных ново­образований нервной системы, в частности мультиформной глиобластомой. Более того, нами было обнаружено усиление гибели опухолевых клеток по механизму апоптоза в условиях комбинированного воздействия вышеуказанных препаратов.

Известно, что основным механизмом действия нутлина-3а является реактивация р53, что в условиях повреждений ДНК может приводить к остановке клеточного цикла в фазах G1 и G2. Это, по мнению некоторых авторов, может оказывать цитопротективное действие на нетрансформированные клетки при проведении химио- и радиотерапии [13–15]. При этом одним из механизмов, регулирующих продвижение клеток по фазам клеточного цикла, считается активация ингибитора пан-циклин-зависимой киназы р21 [16].

Кроме того, некоторыми исследователями в опухолевых клетках глиобластом при воздействии ТМЗ были обнаружены признаки активации программы клеточного старения, о чём, в частности, свидетельствовал высокий уровень экспрессии β-галактозидазы, служащей общепризнанным маркёром данного процесса. По мнению большинства исследователей, остановка клеточного цикла и реализация программы клеточного старения в условиях реактивации белка р53 являются наиболее вероятными по сравнению с запуском программы апоптоза [17–18].

Тем не менее, результаты наших исследований показывают отсутствие морфологических признаков, характерных для клеточного старения, в клетках, подвергнутых воздействию алкилирующего агента ТМЗ как в отдельности, так и в условиях реактивации белка р53. Более того, усиление уровня экспрессии расщеплённой формы каспазы-3 свидетельствует об обратном: запуск программируемой клеточной гибели является преобладающим процессом по сравнению с остановкой процессов клеточного деления и старения. Подобные различия могут быть обусловлены молекулярно-фенотипическими особенностями различных клеточных линий глио- и нейробластом, используемых различными исследовательскими группами.

В настоящем исследовании была использована клеточная линия SK.N.SH, которая имеет «дикий» тип р53 и MGMT, что, на наш взгляд, позволило наиболее корректно оценить влияние данных факторов в отношении чувствительности опухолевых клеток к алкилирующему соединению ТМЗ.

Таким образом, в результате прове­дённых исследований были ­получены данные о том, что опухолевые клетки ­нейробластомы линии SK.N.SH в малой степени чувствительны к воздействию ТМЗ. При этом преинкубация клеток со специфическим ингибитором белка MGMT приводила к усилению эффекта химиопрепарата. Важно отметить, что наиболее выраженное подавление роста опухолевых клеток происходило в условиях реактивации белка р53, при которых клетки практически теряли свою пролиферативную активность. Нами также было отмечено значительное снижение уровня экспрессии белка МGMT в данных экспериментальных условиях, что может свидетельствовать об отрицательной обратной связи между данными факторами.

Вывод

Основным выводом, полученным в результате проведённых исследований, следует считать получение доказательств о преобладающей роли оценки функционального статуса белка р53 в качестве предиктора ответа опухолевых клеток нейробластом на воздействие алкилирующего агента темозоломида. В свою очередь уровень экспрессии и функциональную активность фермента О6-метилгуанин-­ДНК-метилтранферазы следует расценивать как менее значимые параметры для оценки восприимчивости нейробластом к действию темозоломида.

 

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

Исследования выполнены при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда (РНФ) №14-15-00342.

R R Khusnutdinov

Kazan State Medical University

Author for correspondence.
Email: boichuksergei@mail.ru
Kazan, Russia

S V Boychuk

Kazan State Medical University

Email: boichuksergei@mail.ru
Kazan, Russia

  • Schwab M., Westermann F., Hero B., Berthold F. Neuroblastoma: biology and molecular and chromosomal pathology. Lancet Oncol. 2003; 4 (8): 472-480. doi: 10.1016/S1470-2045(03)01166-5.
  • Brodeur G.M. Neuroblastoma: biological insights into a clinical enigma. Nat. Rev. Cancer. 2003; 3 (3): 203-216. doi: 10.1038/nrc1014.
  • Günther W., Pawlak E., Damasceno R. et al. Temozolomide induces apoptosis and senescence in glioma cells cultured as multicellular spheroids. Br. J. Cancer. 2003; 88 (3): 463-469. doi: 10.1038/sj.bjc.6600711.
  • Johnson D.R., O’Neill B.P. Glioblastoma survival in the United States before and during the temozolomide era. J. Neuro-Oncol. 2012; 107 (2): 359-364. doi: 10.1007/s11060-011-0749-4.
  • Krex D., Klink B., Hartmann C. et al. Long-term survival with glioblastoma multiforme. Brain. 2007; 130 (Pt. 10): 2596-2606. doi: 10.1093/brain/awm204.
  • De Sio L., Milano G.M., Castellano A. et al. Temozolomide in resistant or relapsed pediatric solid tumors. Pediatr. Blood Cancer. 2006; 47 (1): 30-36. doi: 10.1002/pbc.20516.
  • Rubie H., Chisholm J., Defachelles A.S. et al. Société Françaisedes Cancers de l’Enfant, United Kingdom Children Cancer Study Group-New Agents Group Study: Phase II study of temozolomide in relapsed or refractory high-risk neuroblastoma: a joint Société Française des Cancers de l’Enfant and United Kingdom Children Cancer Study Group-New Agents Group Study. J. Clin. Oncol. 2006; 24: 5259-5264. doi: 10.1200/JCO.2006.06.1572.
  • Pegg A.E. Properties of mammalian O6-alkylguanine-DNA transferases. Mutat. Res. 1990; 233: 165-175. doi: 10.1016/0027-5107(90)90160-6.
  • Ramalho-Carvalho J., Pires M., Lisboa S. et al. Altered Expression of MGMT in high-grade gliomas results from the combined effect of epigenetic and genetic aberrations. PLoS One. 2013; 8 (3): e58206. doi: 10.1371/journal.pone.0058206.
  • Goellner E.M., Grimme B., Brown A.R. et al. Overcoming temozolomide resistance in glioblastoma via dual inhibition of NAD+ biosynthesis and base excision repair. Cancer Res. 2011; 71 (6): 2308-2317. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-10-3213.
  • Itahana K., Dimri G., Campisi J. Regulation of cellular senescence by p53. Eur. J. Biochem. 2001; 268: 2784-2791. doi: 10.1046/j.1432-1327.2001.02228.x.
  • Chin L., Meyerson M., The Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 2008; 455: 1061-1068. doi: 10.1038/nature07385.
  • Ingeborg M.M. van Leeuwen, Bhavya Rao, Marijke C.C. Sachweh, Laín S. An evaluation of small-molecule p53 activators as chemoprotectants ameliorating adverse effects of anticancer drugs in normal cells. Cell Cycle. 2012; 11 (9): 1851-1861. doi: 10.4161/cc.20254.
  • Apontes P., Leontieva O.V., Demidenko Z.N. et al. Exploring long-term protection of normal human fibroblasts and epithelial cells from chemotherapy in cell culture. Oncotarget. 2011; 2: 222-233. doi: 10.18632/oncotarget.248.
  • Carvajal D., Tovar C., Yang H. et al. Activation of p53 by Mdm2 antagonists can protect proliferating cells from mitotic inhibitors. Cancer Res. 2005; 65: 1918-1924. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-04-3576.
  • Xiong Y., Hannon G.J., Zhang H. et al. p21 is a universal inhibitor of cyclin kinases. Nature. 1993; 366 (6456): 701-704. doi: 10.1038/366701a0.
  • Tovar C., Rosinski J., Filipovic Z. et al. Small-molecule MDM2 antagonists reveal aberrant p53 signaling in cancer: Implications for therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006; 103 (6): 1888-1893. doi: 10.1073/pnas.0507493103.
  • Villalonga-Planells R., Coll-Mulet L., Martínez-Soler F. et al. Activation of p53 by nutlin-3a induces apoptosis and cellular senescence in human glioblastoma multiforme. PLoS One. 2011; 6 (4): e18588. doi: 10.1371/journal.pone.0018588.

Views

Abstract - 316

PDF (Russian) - 203

PlumX


© 2018 Khusnutdinov R.R., Boychuk S.V.

Creative Commons License

This work is licensed
under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International License.


Свидетельство о регистрации СМИ ЭЛ № ФС 77-70434 от 20 июля 2017 года выдано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор)