The effect of the photoperiod on the serotonergic system of the thymus and its role in the ­implementation of the effects of exogenous melatonin

Elena M. Luzikova; Лузикова Елена Михайловна; Valentina E. Sergeeva; Сергеева Валентина Ефремовна; Alexander V. Moskovsky; Московский Александр Владимирович; Pavel V. Sergeev; Сергеев Павел Владимирович; Ivan A. Lukachev; Лукачев Иван Александрович; Olesya I. Moskovskaya; Московская Олеся Игоревна

doi:10.17816/KMJ2022-788

Влияние фотопериода на серотонинергическую систему вилочковой железы и его роль в реализации эффектов экзогенного мелатонина

Авторы: Лузикова Е.М.¹, Сергеева В.Е.¹, Московский А.В.¹, Сергеев П.В.¹, Лукачев И.А.¹, Московская О.И.¹
Учреждения:
1. Чувашский государственный университет им. И.Н. Ульянова
Выпуск: Том 103, № 5 (2022)
Страницы: 788-796
Раздел: Экспериментальная медицина
Статья получена: 06.10.2021
Статья одобрена: 01.09.2022
Статья опубликована: 03.10.2022
URL: https://kazanmedjournal.ru/kazanmedj/article/view/82705
DOI: https://doi.org/10.17816/KMJ2022-788
ID: 82705

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Актуальность. Считалось, что функционирование иммунных органов фотонезависимо, но существует ряд работ, свидетельствующих о влиянии сдвига фотопериода на работу иммунных органов. Мы предположили, что отсутствие фотопериода при постоянном освещении или постоянном затемнении повлияет на серотонинергическую систему вилочковой железы (тимуса), а также на направление и интенсивность воздействия мелатонина.

Цель. Изучение серотонин-содержащих клеток тимуса в условиях экспериментального десинхроноза и роль фотопериода в реализации эффектов экзогенного мелатонина.

Материал и методы исследования. Проведено сравнительное исследование серотонин-содержащих клеток тимуса 8-недельных крыс линии Wistar, которые были разделены на шесть групп: первую и вторую группы содержали в условиях естественного фотопериода, третью и четвёртую — в условиях постоянного затемнения, пятую и шестую группы — в условиях постоянного освещения в течение 4 нед. Мелатонин ad libitum в концентрации 4 мг/л с питьевой водой в течение 4 нед получали животные второй, четвёртой и шестой групп. Для определения уровня серотонина в клетках использовали моноклональные антитела к 5-HT. Выводы о содержании серотонина в клетках делали путём измерения оптической плотности вещества в 100 клетках по каждому животному с помощью программы SigmaScan Pro5. Описательная статистическая обработка произведена с использованием программы Statisticа 17. Полученные данные по каждой группе животных усредняли, вычисляли стандартную ошибку и стандартное отклонение.

Результаты. Искусственное затемнение снижает содержание серотонина в 5-НТ-иммунореактивных клетках коркового вещества в 2,4 раза (p=0,001), а постоянное освещение увеличивает этот показатель в 1,9 раза (p=0,001). При введении мелатонина животным, находившимся в затемнённых условиях в течение 4 нед, оптическая плотность серотонина возрастает в 3,6 раза (p <0,0001). Введение мелатонина животным, находившимся в условиях постоянного освещения, приводит к увеличению оптической плотности серотонина в клетках диффузной эндокринной системы на границе коркового и мозгового вещества долек в 1,5 раза (p=0,002).

Вывод. Клетки диффузной эндокринной системы тимуса чувствительны к изменению фотопериода, а введение мелатонина оказывает разнонаправленное действие на количество и оптическую плотность серотонина в разных световых условиях.

Ключевые слова

мелатонин, тимус, серотонин, фотопериод

Полный текст

Актуальность

Исследование влияния световых режимов на функционирование иммунной системы чрезвычайно актуально. Человек создал ноосферу, в которой многие древние биологические механизмы нарушаются, например естественная смена дня и ночи. Круглосуточное освещение, ночные дежурства, клубный образ жизни — всё это вызывает изменения на клеточном уровне [1]. Нарушение циркадных ритмов приводит к повышению риска развития опухолей [2, 3], снижению регенеративной активности [4, 5], иммуносупрессии [6, 7], ожирению [8], быстрому старению организма [9, 10], а также к нарушению психоэмоционального статуса [11–13].

Вилочковая железа (тимус) — первичный лимфоидный орган, ответственный за созревание Т-лимфоцитов, которое регулируется эндокринными и паракринными механизмами. Цитохимически выделяют три различных популяции эндокринных клеток тимуса: аргентафинные, аргирофильные и биоамин-содержащие клетки [14]. Эти клетки служат частью периферического звена диффузной эндокринной системы (ДЭС), к которому относят клетки, расположенные на границе коркового и мозгового вещества дольки тимуса и проявляющие свойства местных серотонин-продуцентов, а также стромальные клетки коркового вещества долек вилочковой железы, обладающие серотонин-поглотительными свойствами и создающие биоаминное микроокружение лимфоцитов тимуса [15, 16].

Граница коркового и мозгового вещества долек тимуса (кортико-медуллярная зона) содержит серотонин-позитивные клетки в один-два ряда. В люминесцентно-гистохимических исследованиях тимуса 1970–2000-х годов показано, что в клетках, расположенных на границе коркового и мозгового вещества долек, содержатся катехоламины, серотонин, гистамин. Известно, что клетки кортико-медуллярной зоны проявляют свойства местных биоаминопродуцентов и сочетают в себе свойства макрофагов и клеток АРUD-серии [17–19].

В эксперименте с введением вегетотропных веществ было установлено, что гранулярные люминесцирующие клетки коркового вещества долек и тимоцитарная паренхима обладают аминопоглотительными свойствами [17, 20] и способностью связывать нейромедиаторы. Связывание серотонина может происходить на поверхности кортико-медуллярных, субкапсулярных макрофагов и тучных клеток с помощью мембранных фосфолипидов. Обратный захват серотонина из межклеточного вещества возможен с помощью моноаминового переносчика 5-НТТ (SERT), находящегося в плазматической мембране макрофагов, дендритных и тучных клеток [21]. Транспортёр серотонина сначала связывает ион натрия, затем серотонин, а затем ион хлорида, таким образом, благодаря мембранному потенциалу он может переворачиваться внутри клетки, освобождая все ранее связанные элементы. Сразу после высвобождения серотонина в цитоплазме ион калия связывается с переносчиком, который может переключаться обратно, возвращаясь в своё активное состояние [22].

Тимус крысы содержит все компоненты серотонинергической системы: серотонин-продуцирующие клетки, серотонин-поглощающие клетки, рецепторы, ферменты синтеза и мембранные транспортёры. Экспрессия рецепторов предполагает возможность прямого влияния серотонина на развитие и функционирование вилочковой железы [16, 23].

Ранее считали, что серотонинергическая система тимуса фотонезависима, как и всё периферическое звено ДЭС, но ряд исследований [9, 10, 24–26] опровергает это утверждение. Среди исследований, посвящённых влиянию сдвига фотопериода на иммунные органы, есть работы, показывающие различия в воздействии мелатонина на показатели клеточного иммунитета при нормальном фотопериоде и непрерывном освещении [25]. Мы предположили, что отсутствие фотопериода при постоянном освещении или постоянном затемнении повлияет на серотонинергическую систему тимуса, а также на направление и интенсивность воздействия мелатонина.

Цель

Целью нашего исследования было изучение влияния фотопериода на серотонинергическую систему тимуса и его роль в реализации эффектов экзогенного мелатонина.

Задачи исследования: определить количество серотонин-позитивных клеток тимуса и содержание серотонина в них в условиях отсутствия фотопериода, в условиях постоянного освещения (исключение выработки эндогенного мелатонина) и при введении мелатонина в вышеназванных условиях.

Материал и методы исследования

В эксперименте использованы крысы-самцы линии Wistar (n=60) в возрасте 8 нед с массой тела 150–200 г. Животные были разделены на шесть групп по 10 крыс (~~~~~~~~табл. 1): первую и вторую группы содержали в условиях естественного фотопериода, третью и четвёртую — в условиях постоянного затемнения, пятую и шестую группы — в условиях постоянного освещения в течение 4 нед. Мелатонин получали животные второй, четвёртой и шестой групп в форме препарата мелаксен ad libitum в концентрации 4 мг/л с питьевой водой в течение 4 нед. Данные о морфологической реакции серотонинергической системы тимуса на изменение световых условий получали, сравнивая первую, вторую и третью группы. Данные о различиях в реакции серотонин-содержащих клеток на поступление мелатонина в организм в разных световых условиях получали, сравнивая первую, вторую, третью и четвёртую, пятую и шестую группы.

Таблица 1. Дизайн экспериментального исследования влияния фотопериода и мелатонина на серотонин-содержащие клетки тимуса

Условия эксперимента	Естественные условия освещения		Постоянное затемнение		Постоянное освещение
	Группы экспериментальных мышей
	Первая	Вторая	Третья	Четвёртая	Пятая	Шестая
Продолжительность светового дня, ч	8–9	8–9	—	—	24	24
Освещённость утром, лк	50–150	50–150	0−0,5		55
Освещённость пасмурным днём, лк	до 500	до 500
Освещённость ясным днём, лк	до 1000	до 1000
Освещённость вечером, лк	100–200	100–200
Концентрация мелатонина в питьевой воде «Сестрица», мг/л	—	4	—	4	—	4
Физиологическая доза для крысы без учёта 15% усвояемости, мг	—	0,01	—	0,01	—	0,01
Доза для крысы с учётом 15% усвояемости, мг	—	0,09	—	0,09	—	0,09

Экспериментальные исследования осуществляли в соответствии с протоколом, утверждённым этическим комитетом ФГОУ ВПО «Чувашский государственный университет им. И.Н. Ульянова» от 01.03.2013.

Мелатонин вводили перорально [(мелаксен, Unipharm, Inc., США) ad libitum в концентрации 4 мг/л с питьевой в течение 4 нед], поскольку он легко проникает через кишечный и гематоэнцефалический барьеры, после экзогенного введения присутствует в крови и мозге в высоких концентрациях [27].

Тимус у животных извлекали после удушающего действия диоксида углерода на 28-е сутки эксперимента во второй половине дня (15:00–17:00) и фиксировали в 10% формалине с последующей заливкой в парафин для общегистологических и иммунологических методов исследования. Производили депарафинизацию препаратов в ксилоле и регидратацию в спиртах снижающейся концентрации с последующей промывкой в дистиллированной воде 5 мин. Затем блокировали эндогенную пероксидазу в 3% водном растворе перекиси водорода 10 мин при комнатной температуре. Затем промывали в дистиллированной воде 4 мин и переносили стекла в 0,01 М фосфатно-солевой буфер (рН=7,4) на 7 мин.

Инкубацию производили в 5% растворе бычьего сывороточного альбумина, фракция V по Кону (Serva, Германия, Fluka, США) на фосфатно-солевом буфере — 10 мин при комнатной температуре. Затем удаление бычьего сывороточного альбумина без промывки, инкубация с первичными моноклональными антителами (клон 5-HT-H209, DAKO, Дания) 30 мин, во влажной камере при 38 °C, с последующей промывкой в фосфатно-солевом буфере 7 мин. Инкубацию осуществляли с вторичными биотинилированными антителами из набора LSAB2 (Dako, Дания) с добавкой 1–2% нормальной сыворотки крысы в течение 30 мин при комнатной температуре, затем осуществляли промывку в фосфатно-солевом буфере 7 мин. Инкубация со стрептавидин-пероксидазой из набора LSAB2 (Dako, Дания) длилась 15 мин при комнатной температуре. Производили промывку в фосфатно-солевом буфере (5 мин) и в заключение инкубацию с раствором 3,3-диаминобензидинтетрагидрохлорида («DAB+», Dako, Дания) под визуальным контролем (3 мин), промывку в дистиллированной воде 5 мин [28].

Иммуноцитохимическую реакцию на серотонин (5-гидрокситриптамин, 5-HT) использовали для выявления серотонина в клетках, способных синтезировать или накапливать этот моноамин [22], в частности в клетках стромы и паренхимы тимуса [24]. Подсчёт клеток был произведён с использованием программы SigmaScan Pro5 и микроскопа Carl Zeiss Axio Scope A1 при увеличении ×400. Выводы о содержании серотонина в клетках делали путём измерения оптической плотности вещества в 100 клетках по каждому животному с помощью программы SigmaScan Pro5.

Описательная статистическая обработка произведена с использованием программы Statisticа 17 (США). Данные по экспрессии белков-маркёров по каждой группе животных усредняли и вычисляли стандартную ошибку и стандартное отклонение.

Результаты

В тимусе контрольных животных (первая экспериментальная группа) серотонин-позитивные клетки выявлены в корковом и мозговом веществе долек, а также на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса. На микропрепаратах, обработанных моноклональными антителами к 5-HT, позитивную реакцию дают плазма крови, эндотелий сосудов и тучные клетки. Серотонин-содержащие клетки ДЭС на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса немногочисленны, расположены небольшими группами, среднее их количество 7,29±1,2 в 1 мм². Средняя оптическая плотность серотонина в них 0,27±0,01, а средняя оптическая плотность серотонина в межклеточном веществе вокруг исследуемых клеток достигает 0,05±0,004.

По результатам наших исследований, искусственное затемнение (третья экспериментальная группа) не приводит к достоверным изменениям количества серотонин-позитивных клеток границы коркового и мозгового вещества и в корковом веществе тимусных долек. Оптическая плотность серотонина снижается в нейроэндокринных клетках коркового вещества 2,4 раза (p=0,001), а в кортико-медуллярных нейроэндокринных клетках содержание серотонина не меняется (табл. 2). Одновременно происходят уменьшение количества лимфоцитов в корковом и мозговом веществе долек и увеличение содержания серотонина в лимфоцитах коркового вещества (рис. 1).

Таблица 2. Количество и оптическая плотность серотонин-позитивных клеток коркового вещества (ККВ), границы клеток коркового и мозгового вещества (КМВ) долек тимуса в условиях искусственного десинхроноза и введения мелатонина

Показатель	Группы
Показатель	Первая	Вторая	Третья	Четвёртая	Пятая	Шестая
Количество ККВ	1,7±0,92	3,42±0,6 p=0,000003•	3,7±1,4	1,9±0,4 p=0,0006••	2,5±1,2	3,2±0,6
Оптическая плотность серотонина в ККВ	0,15±0,02	0,28±0,07 p=0,001•	0,06±0,08 p=0,000000•1	0,24±0,07 p=0,014••	0,09±0,04	0,29±0,01 p=0,0000001•••
Количество КМВ	7,29±1,2	11,25±1,6	5,21±0,96	6,25±0,75	5,44±0,73	14,7±1,0
Оптическая плотность серотонина в КМВ	0,27±0,01	0,4±0,007 p=0,000001•	0,27±0,004	0,31±0,003 p=0,031••	0,37±0,007 p=0,023•	0,54±0,01 p=0,000005 •••
Оптическая плотность серотонина в микроокружении КМВ	0,05±0,004	0,04±0,002•	0,06±0,01	0,08± 0,003 p=0,000023••	0,05±0,002	0,16±0,001 p=0,026•••

Примечание. Статистическую значимость исследовали в сравнении: • — с первой группой; •• — с третьей группой; ••• — с пятой группой. Подсчёт проводили в участках препарата площадью 13,5 мм2.

Рис. 1. Изменение количества (А) и оптической плотности (Б) серотонина лимфоцитов мозгового и коркового вещества (МВ и КВ) долек тимуса крыс линии Wistar, получавших мелатонин в разных световых условиях: I — животные, содержавшиеся при естественном освещении; II — животные, содержавшиеся при естественном освещении и получавшие мелатонин; III — животные, содержавшиеся в условиях затемнения; IV — животные, содержавшиеся в условиях затемнения и получавшие мелатонин; V — животные, содержавшиеся при постоянном освещении; VI — животные, содержавшиеся при постоянном освещении и получавшие мелатонин в течение 4 нед; *р ≤0,001, **р ≤0,01. Подсчёт проводили в участках препарата площадью 13,5 мм2

Постоянное освещение (пятая экспериментальная группа) не приводит к достоверным изменениям количества и оптической плотности серотонина клеток ДЭС коркового вещества долек тимуса, но вызывает увеличение оптической плотности серотонина в клетках ДЭС на границе коркового и мозгового вещества долек в 1,4 раза (см. табл. 2.). Уровень серотонина в лимфоцитах мозгового вещества долек имеет тенденцию к увеличению, а в лимфоцитах коркового вещества повышается (см. рис. 1). Одновременно происходит снижение количества лимфоцитов как в корковом, так и в мозговом веществе долек (см. рис. 1).

При ежедневном поступлении мелатонина перорально с водой в организм крыс, находившихся в условиях естественного освещения (вторая экспериментальная группа), происходило увеличение оптической плотности серотонин-позитивных клеток ДЭС коркового вещества долек в 1,9 раза (p=0,002), а их количество увеличивалось в 2 раза (p=0,004). Оптическая плотность серотонина в клетках на границе коркового и мозгового вещества повышалось в 1,5 раза, а в их микроокружении значимых изменений не было (см. табл. 2). Содержание серотонина в лимфоцитах коркового и мозгового вещества долек возрастало, но количество лимфоцитов в мозговом веществе снижалось, а в корковом веществе значительно не менялось.

При введении мелатонина животным, находившимся в условиях затемнения (четвёртая экспериментальная группа), количество серотонин-содержащих клеток ДЭС коркового вещества долек снижалось в 2 раза (p=0,02), а оптическая плотность серотонина в них резко возрастало в 3,6 раза (p=0,0005). В нейроэндокринных клетках, расположенных на границе коркового и мозгового вещества долек и в их микроокружении, оптическая плотность серотонина возрастала в 1,2 и 1,3 раза соответственно (см. табл. 2.). Введение мелатонина снижает уровень серотонина в лимфоцитах мозгового вещества и повышает в лимфоцитах коркового вещества (см. рис. 1). Количество лимфоцитов в корковом и мозговом веществе тимуса снижается по сравнению с контрольными показателями и по сравнению с соответствующими показателями у животных, содержавшихся в условиях искусственного затемнения.

Введение мелатонина животным, находившимся в условиях постоянного освещения (шестая экспериментальная группа), приводит к увеличению количества амин-продуцирующих клеток на границе коркового и мозгового вещества долек в 2,7 раза (p=0,007) и оптической плотности серотонина в них в 1,5 раза (p=0,002; см. табл. 2). Количество серотонин-позитивных клеток коркового вещества долек достоверно не меняется, а оптическая плотность серотонина в них увеличивается в 3 раза (p=0,003; см. рис. 1). Количество лимфоцитов в корковом и в мозговом веществе долек увеличивается, оптическая плотность серотонина в лимфоцитах мозгового вещества увеличивается (рис. 2), а в лимфоцитах коркового вещества снижается.

Рис. 2. Серотонин-позитивные клетки (стрелки) на границе коркового и мозгового вещества долек тимуса животных, содержавшихся 4 нед в темноте (А), содержавшихся при постоянном освещении (В) и получавших мелатонин в условиях отсутствия света (Б) и при постоянном освещении (Г). Иммуногистохимическая реакция на серотонин с использованием моноклональных антител (клон 5-HT-H209, DAKO, Дания). Объектив 40, окуляр 10

Обсуждение

В условиях отсутствия света достоверных изменений в серотонин-продуцирующих кортико-медуллярных клетках ДЭС не выявлено, а постоянное освещение усиливает синтез серотонина в них. В клетках ДЭС коркового вещества обратная тенденция: отсутствие света вызывает снижение оптической плотности серотонина, а постоянное освещение не приводит к достоверным изменениям содержания серотонина в вышеназванных клетках. При постоянном освещении уровень серотонина и в аминопродуцирующих клетках границы коркового и мозгового вещества долек, и в аминопоглощающих лимфоцитах повышается, так как, возможно, нарушается превращение серотонина в мелатонин.

В исследованиях, где животные были помещены в условия со смещением фотопериода в сторону длинного светового дня, зарегистрировано уменьшение секреции экстрапениального мелатонина в тимусе, что соотносится с нашими данными [25]. При постоянном затемнении уровень серотонина в клетках коркового вещества долек снижается. Причиной этого могло бы быть усиление экзоцитоза серотонина вышеназванными клетками, но в микроокружении клеток ДЭС коркового вещества уровень серотонина значимо не меняется (см. табл. 2). Следовательно, либо снижается поглощение серотонина, либо усиливается превращение серотонина в мелатонин.

Отсутствие фотопериода (постоянное освещение и постоянное затемнение) приводит к увеличению оптической плотности серотонина в лимфоцитах коркового вещества и уменьшению количества лимфоцитов. Известно, что повышенный уровень серотонина и сниженный уровень мелатонина в лимфоидных тканях сопровождаются снижением пролиферации и активацией апоптоза лимфоцитов [25]. Возможно, что фотопериод модулирует работу серотонинергической системы тимуса, регулируя экспрессию серотониновых рецепторов, так же как модулирует экспрессию мелатониновых рецепторов [29] путём изменения содержания серотонина в тканях.

Введение экзогенного мелатонина в условиях естественной смены дневного и ночного освещения приводит к усилению продукции серотонина нейроэндокринными клетками на границе коркового и мозгового вещества долек и поглощения серотонина тимоцитарной паренхимой и нейроэндокринными клетками коркового вещества. Экзогенный мелатонин, поступающий в организм при постоянном затемнении, стимулирует продукцию серотонина клетками кортико-медуллярных зон тимусных долек, одновременно повышается содержание серотонина в их микроокружении, свидетельствующее об активной секреции серотонина. Увеличение оптической плотности серотонина клетками ДЭС и лимфоцитами коркового вещества долек тимуса может свидетельствовать об активации поглощения серотонина.

Мелатонин, поступающий в организм при постоянном освещении, также стимулирует синтез серотонина в клетках ДЭС кортико-медуллярной зоны долек, одновременно увеличивается содержание серотонина в серотонин-поглощающих клетках ДЭС и тимоцитах коркового вещества. Таким образом, серотонинергическая система тимуса фотозависима.

Продукция серотонина в аминопродуцирующих клетках ДЭС границы коркового и мозгового вещества долек в условиях отсутствия фотопериода достоверно не изменяется, но подавляются серотонин-поглотительные свойства клеток ДЭС коркового вещества долек тимуса.

Условия постоянного освещения не меняют серотонин-поглотительные свойства клеток ДЭС коркового вещества вилочковой железы, но усиливают накопление серотонина в аминопродуцирующих клетках границы коркового и мозгового вещества долек тимуса.

Независимо от фотопериода экзогенный мелатонин повышает содержание серотонина в клетках ДЭС тимуса, что более выражено в условиях постоянного освещения.

Наши результаты вносят вклад в изучение фотозависимых клеточных механизмов функционирования иммунных органов, и их следует учитывать при использовании мелатонина для коррекции иммунных и эндокринных нарушений, возникающих при изменении фотопериода. Также результаты наших исследований можно применять в иммуностимулирующей и геропротективной терапии. Они могут быть использованы при разработке методов, позволяющих замедлить возрастную инволюцию лимфоидных органов.

Вывод

Наши исследования показали, что клетки диффузной эндокринной системы вилочковой железы (тимуса) чувствительны к изменению фотопериода, а введение мелатонина оказывает разнонаправленное действие на количество и оптическую плотность серотонина в разных световых условиях.

Участие авторов. Е.М.Л. — концепция и дизайн исследования, сбор и обработка материала, статистическая обработка данных, анализ и интерпретация данных, написание текста; В.Е.С. — концепция и дизайн исследования; А.В.М. — анализ и интерпретация данных; П.В.С. и И.А.Л. — сбор и обработка материала, статистическая обработка данных; О.И.М. — сбор и обработка материала.
Источник финансирования. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.