Biochemical changes in rat muscle tissue with prolonged use of simvastatin

Cover Page

Abstract


Aim. Analysis of biochemical changes in rat muscle tissue after prolonged use of simvastatin.

Methods. The study was conducted on mongrel male rats. Three groups were identified: control group (intact animals), comparison group (animals with induced hypercholesterolemia not reeciving the drugs), and experimental group (animals with induced hypercholesterolemia receiving simvastatin 0.0012 g/100 g of weight once a day for 2 months as an aqueous suspension through the esophageal probe). Metabolite concentration of glycolysis (pyruvic acid and lactate), activity of antioxidant protection enzymes (reduced glutathione, superoxide dismutase, catalase, glutathione reductase, glutathione peroxidase), titin isoforms and proteolytic fragments of titin and nebulin concentration were determined in the muscles of animals.

Results. After administration of simvastatin to animals with induced hypercholesterolemia, a decrease in the concentration of glycolysis metabolites (pyruvic acid and lactate) compared to comparison group was revealed, as well as multidirectional changes in the activity of antioxidant protection enzymes (decrease in activity of superoxide dismutase, glutathione peroxidase, and glutathione reductase, decreased concentration of reduced glutathione, but catalase activity remained unchanged). The analysis of structural changes in animal muscle tissue after administration of simvastatin revealed a decrease in the concentration of NT- and N2A-titin isoforms and practically complete absence of nebulin compared to the animals from the comparison group. At the same time an increase in the concentration of proteolytic fragments of titin (T2) by 1.3 times was recorded.

Conclusion. The study showed that the basis of myotoxicity of statins in their long-term use is disintegration of enzyme antioxidant processes, as well as tissue hypoxia, leading to destruction of muscle fibers and prevalence of proteolytic processes.


Атеросклероз — опасное и коварное забо­левание, так как патологические изменения происходят внутри сосудов, и на ранних стадиях клинические проявления могут отсутствовать. Кроме того, атероскле-
роз — фактор риска развития сложных сердечно-сосудистых заболеваний и нередко представляет угрозу жизни больного.

На сегодняшний день препаратами выбора при лечении нарушений липидного обмена служат статины. Практически все исследователи отмечают высокую гиполипидемическую активность статинов и хорошую их переносимость при длительном лечении. Однако неоднократно были зарегистрированы случаи, когда у больных, получающих статины, резко возникают мышечные боли, иногда даже при повторном приёме одного и того же лекарственного препарата. В данном случае речь идёт о специфическом побочном эффекте данной группы препаратов — статиновой миопа-
тии [1]. Несмотря на различные версии, чёткое понимание её патогенеза до сих пор отсутствует.

В связи с этим целью работы был анализ биохимических изменений в мышечной ткани после длительного приёма симвастатина.

Исследование проведено на беспородных крысах-самцах в возрасте 12–14 мес. Содержание животных соответствовало требованиям Приказа Минздрава РФ №708 от 23.08.2010 «Об утверждении правил лабораторной практики» и санитарным правилам СП 2.2.1.3218-14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)» от 29.08.2014.

В процессе эксперимента животные бы­ли разделены на три группы.

Контрольную группу составили 35 животных, которые содержались на общем рационе вивария и в течение 3 мес получали через пищеводный зонд 0,5 мл дистиллированной воды 1 раз в сутки.

У животных экспериментальной группы индуцировали эссенциальную гиперхолестеринемию путём содержания в течение 3 мес на рационе, обогащённом животными жирами (топлённым сливочным маслом) и легко усваиваемыми углеводами (тростниковым сахаром, манной крупой). По истечении 3 мес у животных определяли уровень общего холестерина на анализаторе «Bayer» (Германия). После подтверждения гиперхолестеринемии животные были разделены на две группы:
– группа 1 (сравнения) — 35 животных, в течение 2 мес получавших рацион без добавления лекарственных веществ и 0,5 мл дистиллированной воды 1 раз в сутки через пищеводный зонд;
– группа 2 (экспериментальная) — 35 животных, получавших в течение 2 мес симвастатин (Zocor, 20 мг) по 0,0012 г/100 г массы тела 1 раз в сутки в виде водной суспензии через пищеводный зонд.

По окончании срока эксперимента животных забивали путём декапитации. Все манипуляции выполняли в соответствии с общепринятыми этическими нормами (протокол ЛНЭК ГБОУ ВПО «Ростовского государственного медицинского университета» МЗ РФ №21/15 от 10.12.2015).

Для исследования отбирали фрагменты скелетных мышц с задней лапы животного. Гомогенат мышечной ткани готовили в соотношении 1 г ткани на 9 мл охлаждённого изотонического раствора натрия хлорида, центрифугировали при 3000 об./мин.

В надосадочной жидкости определяли концентрацию восстановленного глутатиона [2], активность супероксиддисмутазы [2], каталазы [2], глутатионредуктазы [3] и глутатионпероксидазы [3].

Концентрацию пировиноградной кислоты определяли по реакции с 2,4-динитрофенилгидрозином [4]. Концентрацию лактата определяли по реакции уксусного альдегида, образующегося из молочной кислоты в присутствии серной, фосфорной кислот и ионов меди, с параоксидифенилом [4].

Выделение изоформ тайтина и небулина проводили по методике, разработанной в Институте теоретической и экспериментальной биофизики (г. Пущино) [5, 6]. Содержание изоформ тайтина (NT- и N2A-) и небулина определяли в пересчёте на содержание тяжёлых цепей миозина.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием программы Statistica 6.0. Статистически значимыми считали различия, соответствующие оценке ошибки вероятности р <0,05.

Введение симвастатина животным группы 2 (экспериментальной группы) способствовало снижению уровня холестерина в сыворотке крови до 1,637±0,136 ммоль/л, что достоверно отличалось от показателей группы животных, не получавших симвастатин, доказывая гиполипидемическое действие статинов (табл. 1).

 

Таблица 1. Уровень холестерина в сыворотке крови животных исследуемых групп (M±m)

Показатель

Контрольная группа,

n=35

Группа 1 (сравнения),

n=35

Группа 2 (экспериментальная),

n=35

Холестерин, ммоль/л

1,588±0,154

2,785±0,342

p <0,001

1,637±0,136

p1 <0,001

p >0,05

Примечание: р — статистическая значимость различий относительно контрольной группы; р1 — относительно группы сравнения.

 

Косвенным показателем эффективности утилизации молекулярного кислорода при внутриклеточном метаболизме служит уровень пирувата и лактата. Нами было показано, что содержание животных на высокожировом рационе способствует формированию гипоксии, о чём свидетельствует накопление пирувата и лактата в мышечной ткани и эритроцитах [2].

После введения симвастатина в мышцах животных группы 2 (экспериментальной) выявлено снижение концентрации пировиноградной кислоты на 58% (p1 <0,001) и лактата на 32,36% (p1 <0,001) относительно группы 1 (сравнения; табл. 2).

 

Таблица 2. Концентрация метаболитов гликолиза (M±m)

Показатели

Контрольная группа,

n=35

Группа 1 (сравнения),

n=35

Группа 2 (экспериментальная),

n=35

Пировиноградная кислота, мкмоль/мл белка

2,25±0,024

7,81±0,570

p <0,001

3,28±0,269

p1 <0,001

p <0,001

Лактат, мкмоль/мл белка

3,96±0,447

6,86±0,657

p <0,001

4,64±0,491

p1 <0,01

p >0,05

Примечание: р — статистическая значимость различий относительно контрольной группы; р1 — относительно группы сравнения.

 

Полученные данные, с одной стороны, свидетельствуют о снижении тяжести гипоксического повреждения клетки. С другой стороны, можно полагать, что подавление биосинтеза эндогенного холестерина вследствие ингибирования активности 3-гидрокси-3-метилглутарил-кофермент А редуктазы (ГМГ-КоА редуктазы), несмотря на сохраняющийся характер питания, способствовало нивелированию гиперметаболизма глюкозы.

В ранее проведённых нами экспериментах в мышцах животных с экспериментальной гиперхолестеринемией были выявлены разнонаправленные изменения актив­ности ферментов антиоксидантной защиты. У данной группы животных было отмечено значительное увеличение активности глутатионредуктазы, каталазы и содержания восстановленного глутатиона (более чем в 2 раза) по сравнению с животными, находящимися на общем рационе. В то же время активность супероксиддисмутазы достоверно не отличалась от показателей контрольной группы, а глутатионпероксидазы — была снижена на 50% [1] (табл. 3).

 

Таблица 3. Активность ферментов антиоксидантной защиты в мышцах животных с экспериментальной гиперхолестеринемией до и после введения симвастатина

Показатели

Контрольная группа,

n=35

Группа 1 (сравнения),

n=35

Группа 2 (экспериментальная),

n=35

Супероксиддисмутаза, усл.ед./мг белка

0,446±0,049

0,500±0,046

p >0,05

0,219±0,024

p1 <0,001

p <0,001

Каталаза, мКат/мг белка

1,494±0,211

2,729±0,162

p <0,001

2,786±0,438

p1 >0,05

p <0,001

Восстановленный глутатион, мкмоль/мг белка

28,79±4,187

96,55±7,894

p <0,001

48,44±3,213

p1 <0,001

p <0,001

Глутатионпероксидаза, мкмоль/мг белка

13,04±0,892

6,59±0,554

p <0,001

2,43±0,191

p1 <0,001

p <0,001

Глутатионредуктаза, мкмоль/мг белка

0,023± 0,0042

0,048±0,0030

p <0,001

0,030±0,0029

p1 <0,001

p >0,05

Примечание: р — статистическая значимость различий относительно контрольной группы; р1 — относительно группы сравнения.

 

Выявленные нами изменения согласуются с данными литературы, согласно которым длительное содержание животных на высокожировом рационе способствует снижению буферной ёмкости антиоксидантной защиты, нарушению её мобилизации в ответ на повышение активности прооксидантной системы [7].

Введение симвастатина экспериментальным животным (группа 2) способствовало снижению активности супероксиддисмутазы на 56,2% (p1 <0,001), активность каталазы осталась без изменений относительно показателей животных группы сравнения (группы 1; см. табл. 3).

В исследуемой группе выявлены значительные изменения активности глутатионзависимых ферментов: дальнейшее снижение активности глутатионпероксидазы на 63,13% (p1 <0,001), глутатионредуктазы — на 37,5% (p1 <0,001), концентрации восстановленного глутатиона — на 49,83% (p1 <0,001) относительно показателей группы 1.

Анализируя полученные, данные можно отметить, что метаболический ответ мышечной ткани на введение высокой дозы симвастатина проявляется резким снижением активности супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы.

Полученные нами данные согласуются с результатами В.З. Ланкина и соавт. [8], согласно которым статины ­обладают ­прооксидантным действием, о чём свидетельствуют повышение окисляемости биомембран и снижение сократительной активности миокарда в эксперименте при моделировании окислительного стресса путём введения водорода пероксида. В то же время снижение уровня восстановленного глутатиона относительно группы сравнения может быть обусловлено влиянием гипоксии, которая способствует истощению восстановленного глутатиона как в цитозоле, так и в митохондриях, увеличивая оксидативное повреждение [9]. Комплекс биохимических изменений в мышечной ткани способствует её деградации, что подтверждается выявленными структурными изменениями.

У животных экспериментальной группы (группа 2), было зарегистрировано снижение содержания NT-изоформы тайтина до 0,019 и более, N2A-изоформы — до 0,091 и более, практически полное отсутствие небулина по сравнению с животными группы сравнения (группы 1). При этом регистрировали увеличение содержания протеолитических фрагментов тайтина (Т2) в 1,3 раза (рис. 1).

 


Рис. 1. Электрофорез в полиакриламидном геле; ТЦМ — тяжёлые цепи миозина

 

Исследования последних десятилетий показали, что сократительная активность саркомера зависит от полноценности гигантского белка поперечнополосатых мышц тайтина, выполняющего полифункциональную роль в саркомере. Тайтин имеет ключевое значение в обеспечении высокоупорядоченной структуры саркомера поперечнополосатых мышц, регуляции актин-миозинового взаимодействия, внутри­клеточных взаимодействиях [10]. Уменьшение содержания тайтина обусловлено преобладанием процессов протеолиза этого белка над его синтезом, что приводит к нарушению упорядоченной структуры мышечного волокна.

Поскольку нарушение структуры тайтина развивается при различной патологии мышечной ткани [10], можно полагать, что снижение уровня тайтина служит показателем, информативно отражающим наличие дистрофических процессов в мышце, и является критерием диагностики миопатии.

Выводы

1. Анализируя полученные данные, можно полагать, что один из молекулярных механизмов, лежащих в основе миотоксичности статинов при их длительном применении, — дезинтерация ферментов антиоксидантной защиты, что обусловливает усиление прооксидантных процессов, активации протеолиза важнейших макромолекул, лежащих в основе структурно-функциональной деградации мышечного волокна.

2. Полученные результаты дают основание использовать их как теоретическую основу для разработки схем метаболической коррекции при применении высокодозовой терапии статинами для поддержания функционального состояния скелетной мускулатуры. Определение уровня тайтина в биоптатах можно использовать как выявление раннего маркёра мышечной дистрофии.

 

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

E V Vinogradova

Author for correspondence.
mod8792@mail.ru
Rostov State Medical University Rostov-on-Don, Russia

  • Mikashinovich Z.I., Belousova E.S., Vinogradova E.V., Semenets I.A. Еnzymatic antioxidant protection in muscles of rats under long-term administration of simvastatin. Meditsinskiy vestnik Bashkortostana. 2017; 12 (1): 54–57. (In Russ.)
  • Mikashinovich Z.I., Belousova E.S. Impairment of energy-dependant processes in the muscle tissue as a pathogenetic mechanisms of statin-induced myopathy. Byulleten' eksperimental'noy biologii i meditsiny. 2016; 162 (10): 426–430. (In Russ.)
  • Kalinina E.V., Chernov N.N., Aleid R. et al. Current views of antioxidative activity of glutathione and glutathione-depending enzymes. Vestnik RAMN. 2010; 3: 46–54. (In Russ.)
  • Mikashinovich Z.I., Letunovskiy A.V., Volzhin O.O., Belousova E.S. Biokhimicheskie issledovaniya slyuny v klinicheskoy praktike. (Biochemical studies of saliva in clinical practice.) Rostov-na-Donu: Izdatel'stvo RostGMU. 2004; 80 p. (In Russ.)
  • Vikhlyantsev I.M., Podlubnaya Z.A. Titin isoform composition in the muscles in pathological processes. Biofizika. 2008; 53 (6): 1058–1065. (In Russ.)
  • Vikhlyantsev I.M., Podlubnaya Z.A. New titin (connectin) isoforms and their functional role in striated muscles of mammals: facts and suppositions. Uspekhi biologicheskoy khimii. 2012; 52: 239–280. (In Russ.)
  • Dubinina E.E. The role of reactive oxygen species as signal molecules in tissue metabolism under conditions of oxidative stress. Voprosy meditsinskoy khimii. 2001; 47 (6): 561–581. (In Russ.)
  • Lakomkin V.L., Kapel'ko V.I., Lankin V.Z. et al. Effect of β-hydroxy-β-methylglutaryl coenzyme a reductase inhibitor atorvastatin on contractility of the isolated rat heart under normal conditions and during oxidative stress. Byulleten' eksperimental'noy biologii i meditsiny. 2007; 143 (4): 383–385. (In Russ.)
  • Kulinskiy V.I., Kolesnichenko L.S. System of glutathione I. Synthesis, transport, glutathione transferases, glutathione peroxidases. Biomeditsinskaya khimiya. 2009; 55 (3): 255–277. (In Russ.)
  • Mikashinovich Z.I., Belousova E.S. Biochemical changes in erythrocytes as a molecular marker of cell damage during long-term simvastatin treatment. Kletochnye tekhnologii v biologii i meditsine. 2016; 2: 122–126. (In Russ.)

Views

Abstract - 151

PDF (Russian) - 96

PlumX


© 2018 Vinogradova E.V.

Creative Commons License

This work is licensed
under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International License.


Свидетельство о регистрации СМИ ЭЛ № ФС 77-70434 от 20 июля 2017 года выдано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор)