Effect of pivaloyl-substituted pyrrole containing heterocyclic compounds on DNA repair pathways in Ewing sarcoma cells

Cover Page

Abstract


Aim. To examine deoxyribonucleic acid (DNA) damage repair and cell cycle regulatory mechanisms of Ewing sarcoma cells exposed to pivaloyl-substituted pyrrole containing heterocyclic compounds.

Methods. The study was performed on A673 Ewing sarcoma cell line. The tumor cells were incubated for 48 h in the presence of pivaloyl-substituted pyrrole containing heterocyclic compounds (compounds №20 and №24). Western blot analysis was utilized to examine expression of the markers of DNA single-strand (phosphorylated forms of ATR and Chk1) and double-strand breaks (phosphorylated forms of H2AX, АТМ, DNA-PK, BRCA-1, Chk-2). Analysis of the cell cycle phases was performed by flow cytometry (BD FacsCanto, USA).

Results. Pivaloyl-substituted pyrrole containing heterocyclic compounds substantially increased the expression of histone 2A phosphorylated on serine 138 (γ-H2AX) that indicates DNA damage (double-strand breaks). Under exposure to pivaloyl-substituted pyrrole containing heterocyclic compounds the studied cells increased expression of phosphorylated forms of ATM-kinase and BRCA-1. Also cell cycle disorders leading to substantial G2/M arrest and enhanced apoptosis of tumor cells were observed.

Conclusion. Pivaloyl-substituted pyrrole containing heterocyclic compounds induced DNA double-strand breaks in A673 Ewing sarcoma cell line; in response to DNA damage in tumor cells, the mechanisms of DNA double-strand breaks repair were activated; despite activation of DNA repair mechanisms, A673 cells underwent cell cycle arrest in the G2/M-phase and apoptosis.


Саркома Юинга — одна из наиболее распространённых злокачественных опухолей костной ткани у детей и подростков. Заболевание впервые описал в 1921 г. американский патолог Джеймс Юинг (1866–1943). Саркома Юинга чаще встречается у мальчиков, пик заболеваемости приходится на возраст от 10 до 15 лет [1].

Данная опухоль в основном поражает диафизы длинных трубчатых костей. Кроме того, саркома Юинга может локализоваться в рёбрах, тазовых костях, лопатке и ключице. Клинически данное заболевание, как правило, проявляется болевым синдромом и развитием отёка в области поражённой кости [2]. Опухоль характеризуется весьма агрессивным течением, и у 20–30% пациентов на момент постановки диагноза отмечают метастазы (лёгкие, костная ткань, лимфатические узлы) [3].

Общая стратегия лечения саркомы Юинга включает химиотерапию с последующей оперативной и/или лучевой местной терапией [4]. К основным группам химиопрепаратов, применяемых в лечении саркомы Юинга, относятся алкилирующие агенты (ифосфамид, циклофосфамид), антрациклины (адриамицин, доксорубицин), этопозид, актиномицин D и алкалоиды барвинка (винбластин) [5, 6]. Пациентам с плохим гистологическим ответом на обычные дозы химиотерапии назначают высокие дозы бусульфана и мелфалан. Благодаря комбинации химиотерапии и местного лечения 5-летняя выживаемость больных составляет более 70%. Тем не менее, у ряда больных развиваются рецидивы опухоли, характеризующиеся тяжёлым течением и плохим прогнозом (2-летняя выживаемость после рецидива составляет 20%) [7, 8].

В соответствии с вышеизложенным представляло интерес изучить механизмы активности синтезированных нами пивалоил-замещённых пиррол-содержащих гетероциклических соединений (ПЗПГ) в отношении клеток саркомы Юинга. Ранее нами было установлено, что ПЗПГ вызывают в клетках гастроинтестинальных стромальных опухолей деполимеризацию белка тубулина. В результате этого клетки задерживаются в М-фазе клеточного цикла (митотическая катастрофа) и гибнут по механизму апоптоза [9].

Объектом исследования были опухолевые клетки саркомы Юинга линии А673 (ATCC, США). Клетки культивировали в стандартных условиях (37 °С, 5% CO2) в культуральный среде DMEM («­ПанЭКО») с добавлением L-глутамина («­ПанЭКО»), эмбриональной телячьей сыворотки («HyClone») и антибиотиков («ПанЭКО»). При достижении 70% конфлюентности к клеткам добавляли ПЗПГ №20 (ПЗПГ-20) и №24 (ПЗПГ-24) в количестве 5 ­мкмоль. Через 24 и 48 ч инкубации клетки подвергали лизису. Полученные клеточные лизаты методом электрофореза разделяли по молекулярной массе и детектировали с помощью биохимической реакции «антиген-антитело» методом иммуноблоттинга.

Были исследованы уровни экспрессии маркёров репарации однонитевых (ATR, Chk-1) и двунитевых (γ-H2AX, АТМ, ­DNA-PK, BRCA-1, Chk-2) повреждений дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). В качестве препаратов сравнения были использованы доксорубицин в дозе 0,25 мкг/мл и винбластин в дозе 1 нмоль (Sigma-Aldrich, США).

Доксорубицин является противоопухолевым антибиотиком антрациклинового ряда и по механизму действия относится к ингибиторам ДНК-топоизомеразы II типа.Винбластин относится к митотическим ядам (так же, как и ПЗПГ, деполимеризует тубулин), является алкалоидом барвинка. Оба препарата используют в лечении саркомы Юинга.

Методом проточной цитометрии (BD FacsCanto, США) изучали влияние ­ПЗПГ-20, ПЗПГ-24 и химиопрепаратов на регуляцию фаз клеточного цикла опухолевых клеток линии А673, а также механизмы их гибели. Полученные результаты были подвергнуты статистической обработке с помощью программ Microsoft Excel 2007 и Biostatistica (S.A. Glantz, McGraw Hill, США). Для оценки достоверности различий изучаемых выборок использовали t-критерий Стьюдента. При р <0,05 различия считали статистически значимыми.

Было обнаружено, что ПЗПГ-20 и ­ПЗПГ-24 индуцируют фосфорилирование гистона 2 по серину 139 (γ-Н2AX) в клетках саркомы Юинга линии А673 (рис. 1). Эффект был более выражен через 48 ч инкубации клеток с исследуемыми соединениями. Подобный эффект также отмечен у доксорубицина и, в меньшей степени, у винбластина.

 


Рис. 1. Изучение способности химиопрепаратов (доксорубицина, винбластина) и пивалоил-замещённых пиррол-содержащих гетероциклических соединений (ПЗПГ) индуцировать двунитевые разрывы ДНК в клетках саркомы Юинга линии А673 и их репарацию. Инкубация 24 и 48 ч. γ-H2AX — маркёр двунитевых разрывов ДНК; рАТМ S1981 — маркёр репарации двунитевых разрывов; рВRСА S1524 — маркёр активации гомологичной рекомбинации; Н2АХ, АТМ, ВRСА — общие (неактивированные) формы белков; актин отражает уровень белка в образцах. Доксорубицин (Докс) — 0,25 мкг/мл; винбластин (Вин) — 1 нмоль; ПЗПГ-20 — 5 мкмоль, ПЗПГ-24 — 5 мкмоль

 

Повышенная экспрессия в опухолевых клетках γ-Н2AX свидетельствует о появлении двунитевых разрывов ДНК. В пользу этого также свидетельствует активация соответствующих путей репарации ДНК, в частности белков ATM-киназы, и BRCA1 (см. рис. 1). Увеличение экспрессии фосфорилированной формы BRCA-1 свидетельствует об активации репарации двунитевых разрывов путём гомологичной реком­бинации.

Известно, что появление в клетках однонитевых разрывов ДНК сопровождается активацией соответствующих путей репарации повреждений ДНК, о чём может свидетельствовать гиперэкспрессия фосфорилированных форм ATR- и Chk1-киназы [10]. Результаты проведённых нами исследований показывают, что в клетках саркомы Юинга через 48 ч инкубации с соединениями ПЗПГ-20 и ПЗПГ-24 не повышалась экспрессия активированных (то есть фосфорилированных) вышеуказанных киназ, что свидетельствует о способности соединений ПЗПГ-20 и ПЗПГ-24 индуцировать в клетках линии А673 образование исключительно двунитевых разрывов ДНК.

Методом проточной цитометрии было установлено, что под влиянием ПЗПГ-20 и ПЗПГ-24 в опухолевых клетках линии А673 происходило нарушение регуляции фаз клеточного цикла, что проявлялось в виде накопления клеток в фазах G2/M клеточного цикла (табл. 1). Кроме того, соединения ПЗПГ-20 и ПЗПГ-24 индуцировали гибель опухолевых клеток по механизму апоптоза (отмечалась повышенная экспрессия пропидия йодида, что указывает на наличие фрагментации молекул ДНК).

 

Таблица 1. Изучение влияния доксорубицина, винбластина, ПЗПГ-20 и ПЗПГ-24 на фазы клеточного цикла опухолевых клеток линии А673

Исследуемое вещество

Фазы клеточного цикла

Апоптоз, %

G0/G1, %

S, %

G2/M, %

Контроль

77,1±1,0

4,8±1,6

15,4±1,6

2,1±0,9

Доксорубицин, 0,25 мкг/мл

11,0±0,8*

4,1±1,0

81,8±2,1*

3,0±0,7

Винбластин, 1 нмоль

14,8±0,9*

1,3±0,6

54,0±1,2*

30,0±1,2*

ПЗПГ-20, 15 мкмоль

36,6±1,1*

8,0±0,7*

36,0±1,1*

19,4±1,1*

ПЗПГ-24, 15 мкмоль

40,3±1,2*

9,4±0,7*

33,5±0,9*

16,8±1,0*

Примечание: инкубация 48 ч; полученные результаты представлены в виде среднего арифметического значения ± стандартное отклонение; *различия относительно контроля статистически значимы (р <0,05); ПЗПГ — пивалоил-замещённые пиррол-содержащие гетероциклические соединения.

 

Таким образом, проведённые исследования свидетельствуют о способности ПЗПГ-20 и ПЗПГ-24 индуцировать в клетках саркомы Юинга образование двунитевых разрывов ДНК, что приводит к последующей активации АТМ-опосредованного пути репарации данных повреждений. Несмотря на активацию данной системы репарации повреждений ДНК, в опухолевых клетках происходила остановка клеточного цикла в фазе G2/M, а затем последующая их гибель по механизму апоптоза.

Выводы

1. Клетки саркомы Юинга линии А673 чувствительны к пивалоил-замещённым пиррол-содержащим гетероциклическим соединениям, индуцирующим образование двунитевых разрывов ДНК и последующую гибель опухолевых клеток по механизму апоптоза.

2. Полученные нами результаты свидетельствуют о чувствительности клеток саркомы Юинга линии А673 к пивалоил-замещённым пиррол-содержащим гетероциклическим соединениям in vitro и открывают перспективы для более углублённого изучения механизмов цитотоксического действия данных соединений в отношении опухолевых клеток саркомы Юинга.

 

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований
(грант мол_а №16-34-01005).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

A R Galembikova

Kazan State Medical University

Author for correspondence.
Email: boichuksergei@mail.ru
Kazan, Russia

S V Boychuk

Kazan State Medical University

Email: boichuksergei@mail.ru
Kazan, Russia

P D Dunaev

Kazan State Medical University

Email: boichuksergei@mail.ru
Kazan, Russia

R R Khusnutdinov

Kazan State Medical University

Email: boichuksergei@mail.ru
Kazan, Russia

S S Zykova

Perm Penal Service Institute

Email: boichuksergei@mail.ru
Perm, Russia

  • Delattre O., Zucman J., Melot T. et al. The Ewing-family of tumors - a subgroup of small-round-cell tumors defined by specific chimeric transcripts. N. Engl. J. Med. 1994; 331 (5): 294-299. doi: 10.1056/NEJM199408043310503.
  • Le Deley M.C., Delattre O., Schäfer K.L. et al. Impact of EWS-ETS fusion type on disease progression in Ewing's sarcoma/peripheral primitive neuroectodermal tumor: prospective results from the cooperative Euro-E.W.I.N.G. 99 trial. J. Clin. Oncol. 2010; 28 (12): 1982-1988. doi: 10.1200/JCO.2009.23.3585.
  • Van Doominck J.A., Ji L., Schaub B. et al. Current treatment protocols have eliminated the prognostic advantage of type 1 fusions in Ewing sarcoma: a report from the Children's Oncology Group. J. Clin. Oncol. 2010; 28 (12): 1989-1994. doi: 10.1200/JCO.2009.24.5845.
  • Juergens C., Weston C., Lewis I. et al. Safety assessment of intensive induction with vincristine, ifosfamide, doxorubicin, and etoposide (VIDE) in the treatment of Ewing tumors in the EURO-E.W.I.N.G. 99 clinical trial. Pediatr. Blood Cancer. 2006; 47 (1): 22-29. doi: 10.1002/pbc.20820.
  • Le Deley M.C., Paulussen M., Ian Lewis I. et al. Cyclophosphamide compared with ifosfamide in consolidation treatment of standard-risk Ewing sarcoma: results of the randomized noninferiority Euro-EWING99-R1 trial. J. Clin. Oncol. 2014; 32 (23): 2440-2448. doi: 10.1200/JCO.2013.54.4833.
  • Womer R.B., West D.C., Krailo M.D. et al. Randomized controlled trial of interval-compressed chemotherapy for the treatment of localized Ewing sarcoma: a report from the Children's Oncology Group. J. Clin. Oncol. 2012; 30 (33): 4148-4154. doi: 10.1200/JCO.2011.41.5703.
  • Wagner L.M., McAllister N., Goldsby R.E. et al. Temozolomide and intravenous irinotecan for treatment of advanced Ewing sarcoma. Pediatr. Blood Cancer. 2007; 48 (2): 132-139. doi: 10.1002/pbc.20697.
  • Haeusler J., Ranft A., Boelling T. et al. The value of local treatment in patients with primary, disseminated, multifocal Ewing sarcoma (PDMES). Cancer. 2010; 116 (2): 443-450. doi: 10.1002/cncr.24740.
  • Boichuk S., Galembikova A., Zykova S. et al. Ethyl-2-amino-pyrrole-3-carboxylates are novel potent anticancer agents that affect tubulin polymerization, induce G2/M cell-cycle arrest, and effectively inhibit soft tissue cancer cell growth in vitro. Anti-Cancer Drugs. 2016; 27 (7): 620-634. doi: 10.1097/CAD.0000000000000372.
  • Kumagai A., Lee J., Yoo H.Y., Dunphy W.G. TopBP1 activates the ATR-ATRIP complex. Cell. 2006; 124 (5): 943-955. doi: 10.1016/j.cell.2005.12.041.

Views

Abstract - 108

PDF (Russian) - 74

PlumX


© 2018 Galembikova A.R., Boychuk S.V., Dunaev P.D., Khusnutdinov R.R., Zykova S.S.

Creative Commons License

This work is licensed
under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International License.


Свидетельство о регистрации СМИ ЭЛ № ФС 77-70434 от 20 июля 2017 года выдано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор)