Antiimmunosuppressive action of 3d-metal gluconates in experimental immunodeficiency

Cover Page

Abstract


Aim. Evaluation of the effect of 3d-metal gluconates on complement-fixing function of immunoglobulin G and functional activity of complement.

Methods. The study was conducted in vivo on 2.5-3 month-old white laboratory mice weighing 25-28 g with secondary immunodeficiency, which was induced by a single intraperitoneal injection of cyclophosphamide, as well as in vitro in a test system using sensitized sheep erythrocytes. Immunological studies were performed in intact animals, and before and after the administration of Mn, Co, Cu, and Zn gluconates to mice with induced immunodeficiency. The content of immunoglobulin G and its complexes with subcomponent of the complement first component C1q was determined in serum by ELISA using specific monoclonal antibodies.

Results. Two-week oral administration of 3d-metal gluconates (Mn, Co, Cu, Zn) in a dose of 1/10 LD50 to immunodeficient mice was shown to cause a significant increase in the level of immunoglobulin G and its complexes with C1q. The greatest increase in concentration was observed with the introduction of zinc gluconate. Also by means of sensitized sheep erythrocytes in vitro, cobalt and, to a lesser extent, manganese gluconates were shown to increase the functional activity of C1q.

Conclusion. 3d-metal gluconates (Mn, Co, Cu, Zn) demonstrate immunocorrecting properties: increase the content of immunoglobulin G and its complexes with C1q, significantly decreasing as a result of cyclophosphamide effect; cobalt and manganese gluconates have a stimulating effect on the functional activity of complement by its classical pathway, which indicates different mechanisms of immunocorrection action of studied metal gluconates and requires further studies.


Иммуносупрессивное действие химио­терапевтических препаратов — весьма существенный негативный фактор, снижающий эффективность их применения. В связи с этим изучение действия иммуномодуляторов различной природы при восстановлении резистентности организма после приёма экзотоксикантов является актуальной задачей медицины и биохимии.

Одним из широко применяемых в онкологии препаратов служит цитостатик алкилирующего действия циклофосфамид, представляющий собой фосфорилированное циклическое производное иприта [1, 2]. Известно, что при его попадании в организм млекопитающих ­развивается выраженная супрессия пролиферации В-лимфоцитов и, как следствие, снижение уровня иммуноглобулинов, а также нарушения в системе комплемента, который служит важным звеном врождённого гуморального иммуни­тета [3, 4].

В качестве корректоров иммунных нарушений в данной работе были рассмотрены глюконаты 3d-элементов, обладающие способностью корректировать иммунные нарушения [5]. Соединения 3d-металлов характеризуются многообразием направлений взаимодействия с биологическими мишенями [6]. Введение этих металлов в организм в виде неорганических солей проявляется выраженной токсичностью [7–10], поскольку они воспринимаются иммунной системой слизистой оболочки тонкой кишки как гаптены, активирующие моноцитарно-макрофагальную систему по механизму незавершённого фагоцитоза [11]. В результате происходит индуцирование перекисных процессов, которые приводят к повреждению клеточных мембран. Однако в составе координационных соединений с рядом хелатирующих лигандов 3d-элементы в значительной степени теряют токсичность и способны проявлять иммунокорригирующие свойства [6, 12, 13].

В этом плане представляет интерес изу­чение комплексных соединений 3d-металлов с полиоксикислотами, в частности с D-глюконовой кислотой. Было показано, что эти соединения имеют более низкую токсичность по сравнению с неорганическими соединениями [12]. Возможно, хелатирующий эффект D-глюконовой кислоты препятствует реализации индуцирования перекисных процессов, и 3d-элементы могут формировать стабильный ­биодоступный пул, не оказывающий ­выраженного цитотоксического действия.

Инициация классического пути системы комплемента начинается с взаимодействия субкомпонента первого фактора комплемента C1q, который находится в сыворотке крови в виде мультимолекулярного комплекса C1q-2C1r-2C1s с активатором, которым является главным образом иммуноглобулин G (IgG) в составе комплекса антиген-антитело. Комплексы C1q-IgG-антиген формируются постоянно в результате иммунного ответа организма, так как они запускают каскад биохимических реакций системы комплемента по классическому пути и стимулируют активацию натуральных киллеров, привлекающих фагоциты и лимфоциты [14].

Целью настоящей работы было изучение влияния глюконатов 3d-металлов на комплемент-фиксирующую функцию IgG и функциональную активность комплемента.

Эксперимент проведён на 2,5–3-месячных белых беспородных мышах с массой тела 25–28 г, самцах. Иммунодефицит индуцировали путём однократного внутрибрюшинного введения цитостатика циклофосфамида (эндоксана; Бакстер АГ, Швейцария) в дозе 50 мг/кг. Контролем служили две группы: интактные и иммунодефицитные животные («без лечения»), которым вводили дистиллированную воду.

Влияние глюконатов Mn, Co, Cu, Zn, синтезированных по методике, описанной в [12], изучали в сравнении с двумя группами: (1) введение препарата ликопид — [4-O-(2-ацетиламино-2-дезокси-β-D-глюкопиранозил)-N-ацетилмурамил]-L-аланил-D-α-глутамиламид, который относится к фармакотерапевтической группе иммуностимулирующих средств, являясь синтетическим аналогом бактериальных гликопептидов, и (2) глюконата кальция (CaGl).

Дозы обоих препаратов рассчитывали по инструкциям: ликопид — 0,17 мг/кг (0,14–0,28 мг/кг), глюконат кальция — 50 мг/кг (28–71 мг/кг). Пероральное введение всех препаратов начинали через 24 ч после инъекции циклофосфамида и далее ежедневно в течение 2 нед в дозе 1/10 полулетальной дозы (LD50) [12]. На 15-е сутки у животных забирали кровь и отделяли сыворотку, в которой методом иммуноферментного анализа с помощью специфических мышиных моноклональных антител против C1q и поликлональных кроличьих антител против IgG мыши, конъюгированных с пероксидазой (ГНЦ НИИ ОЧБ, Санкт-Петербург), определяли уровень IgG и комплексов C1q-IgG.

Оценку влияния глюконатов металлов на функциональную активность комплемента по классическому пути выпо­лняли с использованием сенсибилизированных гемолитической сывороткой (ФГУП НПО «Микроген» МЗ России) эритроцитов барана. В качестве источника комплемента использовали донорскую сыворотку в разведении от 1:2 до 1:128. Глюконаты 3d-металлов в изотоническом растворе натрия хлорида (10–2 М) по 50 мкл вносили в 96-луночный планшет и инкубировали в течение 30 мин при 4 °C. После этого добавляли сенсибилизированные эритроциты барана в вероналовом буферном растворе (по 50 мкл) и инкубировали при 37 °C в течение часа.

Оптическую плотность надосадочной жидкости, перенесённой в новый планшет, измеряли в той же последовательности при длине волны 450 нм (иммуноферментный анализатор Stat Fax-2100, США). Фиксацию комплемента (С%) сенсибилизированными эритроцитами в присутствии глюконатов металлов рассчитывали по формуле:

С%=(Ео–Ек)/Ео×100%,

где Ео — оптическая плотность в присутствии препарата; Ек — оптическая плотность контрольной пробы.

Манипуляции с лабораторными мышами проводили в соответствии с положением Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным, которое соответствует положениям, принятым в Российской Федерации (МЗ РФ от 19 июня 2003 г. №267).

Результаты статистически обрабатывали с помощью программ Microsoft Excel и Statistica 10,0. Для описания количественных признаков в малых выборках применяли медиану (Ме) и интерквартильный размах (Q1–Q3). Для расчёта статистической значимости различий между группами использовали непараметрический критерий Манна–Уитни для двух независимых групп. Статистически значимыми считали значения при р <0,05.

Представленные результаты исследования (табл. 1, 2) показывают, что введение циклофосфамида вызывает у мышей снижение уровня IgG на 53%, а комплексов C1q-IgG — на 31,5% относительно группы интактных мышей, что указывает на побочное действие цитостатика, который вызывает изменения в системе лимфопоэза, вследствие чего происходит угнетение синтеза IgG. С другой стороны, препарат в результате своего цитотоксического действия неселективно угнетает митотическую активность клеток различных тканей, способствуя их дискомплексации, дистрофическим и дегенеративным изменениям, приводящим к гибели по пути некроза, или же потенцируя апоптоз. Образующиеся вследствие этого «осколки» и метаболиты распада, которые не могут полностью инактивироваться угнетённой макрофагально-фагоцитарной системой, связываются с Fc-фрагментами IgG, конкурируя с C1q, тем самым снижая долю связывания C1q с IgG. Кроме того причиной снижения образования комплексов может быть гепатотоксическое действие циклофосфамида, которое обусловливает недостаточный синтез компонентов комплемента или их некомпетентность [1].

 

Таблица 1. Влияние глюконатов 3d-металлов на уровень иммуноглобулинов G (IgG) в сыворотке крови иммунодефицитных мышей

Статистический
показатель

IgG, мг/мл

1 —
интактные

(n=12)

2 —
ИД без лечения

(n=12)

3 —
ИД + ликопид

(n=12)

4 —
ИД + CaGl

(n=12)

5 —
ИД + MnGl

(n=12)

6 —
ИД + CoGl

(n=12)

7 —
ИД + CuGl

(n=12)

8 —
ИД + ZnGl

(n=12)

M±σ

1,48±0,23

0,69±0,09

0,84±0,12

0,7±0,09

0,94±0,11

1,07±0,16

1,02±0,15

1,16±0,14

Me

1,51

0,71

0,86

0,72

0,96

1,09

1,04

1,18

[Q1–Q3]

[1,34–1,72]

[0,63–0,76]

[0,74–0,93]

[0,63–0,78]

[0,89–0,99]

[0,98–1,21]

[0,92–1,12]

[1,07–1,24]

p

p1,2=0,00003

p2,3=0,003

p2,4=0,00729

p3,4=0,0130

p2,5=0,0004

p3,5=0,00003

p4,5=0,0005

p2,7=0,00006

p3,7=0,0009

p4,7=0,00006

p2,8=0,0002

p3,8=0,0066

p4,8=0,0002

p2,9=0,00003

p3,9=0,00005

p4,9=0,00003

Примечание: IgG — иммуноглобулин G; ИД — иммунодефицит.

 

Таблица 2. Влияние глюконатов 3d-металлов на уровень комплексов C1q-IgG в сыворотке крови иммунодефицитных мышей

Статистический показатель

C1q-IgG, ед. экстинкции

1 —
интактные

(n=12)

2 —
ИД без лечения

(n=12)

3 —
ИД + ликопид

(n=12)

4 —
ИД + CaGl

(n=12)

5 —
ИД + MnGl

(n=12)

6 —
ИД + CoGl

(n=12)

7 —
ИД + CuGl

(n=12)

8 —
ИД + ZnGl

(n=12)

M±σ

1,99±0,31

1,34±0,20

1,65±0,24

1,41±0,18

1,86±0,20

1,69±0,23

1,76±0,19

1,93±1,36

Me

2

1,37

1,66

1,43

1,87

1,74

1,77

1,95

[Q1–Q3]

[1,72–2,24]

[1,28–1,42]

[1,54–1,77]

[1,31–1,53]

[1,73–2,02]

[1,6–1,83]

[1,65–1,87]

[1,94–1,44]

p

p1,2=0,0002

p2,3=0,0093

p2,4=0,2726

p3,4=0,011

p2,5=0,0001

p3,5=0,0282

p4,5=0,0002

p2,7=0,0038

p3,7=0,4357

p4,7=0,0051

p2,8=0,0005

p3,8=0,2040

p4,8=0,0011

p2,9=0,00003

p3,9=0,00005

p4,9=0,00003

Примечание: IgG — иммуноглобулин G; ИД — иммунодефицит.

 

Введение глюконатов 3d-металлов в течение 2 нед приводило к существенному повышению концентрации IgG в сыворотке крови (см. табл. 1) по сравнению с животными контрольной группы «без лечения» (p <0,05). При введении глюконата цинка зарегистрировано наибольшее повышение концентрации IgG — на 31%, далее в порядке убывания следуют кобальт — на 25%, медь — на 22%. В меньшей степени эффект проявлялся под действием глюконата марганца — на 17%.

Аналогичная картина отмечена и в содержании комплексов C1q-IgG (см. табл. 2). Здесь выраженное увеличение было отмечено в группах мышей, получавших глюконат цинка (на 28,5%), глюконат марганца (на 25%) и глюконат меди (на 20%), в меньшей степени — при введении глюконата кобальта (на 18,5%). Не исключено, что такое действие глюконатов 3d-металлов может быть связано со стимулированием дополнительного синтеза IgG, а также, возможно, с конкурирующим взаимодействием этих соединений с метаболитами распада, смещающим равновесие реакции C1q с IgG в сторону увеличения доли образования комплексов.

Поскольку в группе животных, получавших глюконат кальция, зафиксировано лишь незначительное повышение уровня IgG (на 0,4%) и комплексов C1q-IgG (на 3%) относительно группы «без лечения», можно предположить, что определяющее влияние на изменение приведённых показателей оказывают 3d-элементы.

Из указанных в таблицах данных также видно, что глюконаты 3d-металлов превосходят по корректирующему действию препарат сравнения ликопид (p <0,05).

 

Таблица 3. Влияние глюконатов 3d-металлов на фиксацию комплемента в тесте с сенсибилизированными эритроцитами барана

Показатель

Контроль

(n=12)

CaGl

(n=12)

MnGl

(n=12)

CoGl

(n=12)

CuGl

(n=12)

ZnGl

(n=12)

E450

0,92±0,09

0,95±0,1

1,13±0,13

1,89±0,2

0,85±0,09

0,91±0,09

Фиксация
комплемента (С%), %

0

3,2±0,3

18,6±1,9

51,3±5,2

–8,2±0,9

1,1±0,12

 

Результаты определения влияния глюконатов 3d-металлов на функциональную активность субкомпонента C1q по гемолизу сенсибилизированных эритроцитов барана представлены в табл. 3. Из них видно, что способностью активировать комплемент обладают CoGl и (в меньшей степени) MnGl. Узнавание C1q субкомпонентом активаторов патологического процесса — ключевое событие в запуске каскада реакций классического пути комплемента, приводящего к образованию мембраноатакующего комплекса и уничтожению опознанных клеток.

Выводы

1. Глюконаты 3d-металлов (Mn, Co, Cu, Zn) обладают иммунокорригирующими свойствами: повышают содержание иммуноглобулинов G и их комплексов с субкомпонентом первого фактора комплемента C1q, значительно снижающееся в результате действия циклофосфамида.

2. Глюконаты кобальта и марганца оказывают стимулирующее действие на функциональную активность комплемента по классическому пути, что свидетельствует о различных механизмах иммунокорригирующего действия исследуемых глюконатов металлов и требует дальнейшего изучения.

 

Все авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

O A Knyazeva

Author for correspondence.
olga_knyazeva@list.ru
Bashkir State Medical University Ufa, Russia

S I Urazaeva

olga_knyazeva@list.ru
Bashkir State Medical University Ufa, Russia

I G Konkina

olga_knyazeva@list.ru
Ufa Institute of Chemistry of the Russian Academy of Sciences Ufa, Russia

L M Saptarova

olga_knyazeva@list.ru
Bashkir State Medical University Ufa, Russia

L M Gazdalieva

olga_knyazeva@list.ru
Bashkir State Medical University Ufa, Russia

Yu I Murinov

olga_knyazeva@list.ru
Ufa Institute of Chemistry of the Russian Academy of Sciences Ufa, Russia

  • Anwer F., Yun S., Nair A. et al. Severe refractory immune thrombocytopenia successfully treated with high-dose pulse Cyclophosphamide and Eltrombopag. Case Reports in Hematology. 2015; 2015: 583451. doi: 10.1155/2015/583451.
  • Huang R., Zhang J., Liu Y. et al. Immunomodulatory effects of polysaccharopeptide in immunosuppressed mice induced by cyclophosphamide. Mol. Med. Rep. 2013; 8 (2): 669–675. doi: 10.3892/mmr.2013.1542.
  • Lebedinskaya E.A., Troynich Ya.N., Malykina A.E., Godovalov A.P. Change in phagocytic activity of neutrophils and monocytes of peripheral blood of healthy donors under the influence of cyclophosphamide. Vestnik ural'skoy meditsinskoy akademicheskoy nauki. 2011; 2/2: 36–37. (In Russ.)
  • Hodge J.W., Garnett C.T., Farsaci B. et al. Chemotherapy-induced immunogenic modulation of tumor cells enhances killing by cytotoxic T lymphocytes and is distinct from immunogenic cell death Chemotherapy-induced immunogenic modulation of tumor cells enhances killing by cytotoxic T lymphocytes and is distinct from immunogenic cell death. Int. J. Cancer. 2013; 133 (3): 624–636. doi: 10.1002/ijc.28070.
  • Knyazeva O.A., Usachev S.A., Urazaeva S.I. The role of gluconic acid compounds with 3d metals in the correction induced immunodeficiency in mice. Zhurnal nauchnykh statey Zdorov'e i obrazovanie v XXI veke. 2016; 18 (4): 88–93. (In Russ.)
  • Kudrin A.V., Gromova O.A. Mikroelementy v immunologii i onkologii. (Microelements in immunology and oncology.) Moscow: GEOTAR-Media. 2007; 544 р. (In Russ.)
  • Lebedeva S.A., Babaniyazova Z.H., Radionov I.A., Skal'nyy A.A. Metal complexes of zinc and cobalt in the rehabilitative treatment of hypoxic conditions. Vestnik vosstanovitel'noy meditsiny. 2013; (2): 67–69. (In Russ.)
  • Skal'naya M.G., Skal'nyy A.V. Trace elements: the biological role and significance for medical practice. Communication 1. Copper. Voprosy biologicheskoy, meditsinskoy i farmatsevticheskoy khimii. 2015; (1): 15–31. (In Russ.)
  • Calabro A.R., Gazarian D.I., Barile F.A. Effect of metals on β-actin and total protein synthesis in cultured human intestinal epithelial cells. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 2011; 63 (1): 47–58. doi: 10.1016/j.vascn.2010.04.012.
  • Yu S., Wang X.-H., Chen Y.-G. et al. In vitro and in vivo evaluation of effects of Mg-6Zn alloy on tight junction of intestinal epithelial cell. Transactions of Nonferrous Metals Society of China. 2015; 25 (11): 3760–3766. doi: 10.1016/S1003-6326(15)64014-6.
  • Саптарова Л.М., Камилов Ф.Х., Князева О.А., Когина Э.Н. Накопление тяжёлых металлов в печени крыс в процессе хронической интоксикации медно-цинковой колчеданной рудой. Вестн. Башкирского ун-та. 2017; 22 (1): 90–91. [Saptarova L.M., Kamilov F.Kh.,
  • Knyazeva O.A., Kogina E.N. Accumulation of heavy metals in the liver of rats in the process of chronic intoxication by copper-zinc sulfade ore. Vestnik Bashkirskogo universiteta. 2017; 22 (1): 90–91. (In Russ.)]
  • Konkina I.G., Ivanov S.P., Knyazeva O.A. et al. Physico-chemical properties and pharmacological activity of Mn, Fe, Co, Cu and Zn gluconates. Khimiko-farmatsevticheskiy zhurnal. 2002; 36 (1): 18–21. (In Russ.)
  • Tripathi K. Can metal ions be incorporated into drugs? Asian J. Research Chem. 2009; 2 (1): 14–18.
  • Cheremnykh E.G., Ivanov P.A., Faktor M.I. et al. A new method to assess functional activity of serum complement system. Meditsinskaya immunologiya. 2015; 5: 479–488. (In Russ.)

Views

Abstract - 20

PDF (Russian) - 8


© 2018 Knyazeva O.A., Urazaeva S.I., Konkina I.G., Saptarova L.M., Gazdalieva L.M., Murinov Y.I.

Creative Commons License

This work is licensed
under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International License.


Свидетельство о регистрации СМИ ЭЛ № ФС 77-70434 от 20 июля 2017 года выдано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор)