DNA-cytometric characteristics of recurrent soft tissue sarcomas

Cover Page

Abstract


Aim. To determine the content of deoxyribonucleic acid (DNA) and distribution of cells in mitotic phases in patients with recurrent soft tissue sarcomas for the assessment of malignancy of the process.

Methods. Tumor tissues of patients with recurrent soft tissue sarcomas were studied. Research methods included histological, DNA-cytometric and statistical methods.

Results. Proliferative activity and proliferative index of recurrent sarcomas differed depending on the tumor grade and stage. Differences in the number of diploid, aneuploid and polyploid cells were determined in each group and between the groups depending on the cell cycle phases. Cell cycle parameters were as following: 100% of G1 (well-differentiated) cancer were diploid, as well as 33.3% of G2 (moderately differentiated) and 15% of G3 (poorly differentiated) tumors. Aneuploid tumors prevailed in G2 and G3, the ratio of which was 66.7 and 85%, respectively. The analysis of kinetic parameters of the cell cycle allowed establishing a decrease in the number of cells in G1/G0 phase of the cell cycle from G1 to G3, which was accompanied by a statistically significant increase in the proportion of cells in S-phase (p ˂0.05).

Conclusion. The DNA-cytometric study of cell cycle parameters showed high biological potential of recurrent soft tissue sarcomas, which was determined by two indices - the proportion of cells in G2+M-phase and the cell loss factor; 100% of well-differentiated (G1) tumors, 33.3% of moderately differentiated (G2) and 15% of poorly differentiated (G3) tumors were diploid; aneuploid tumors prevailed in G2 and G3.


Саркомы мягких тканей (СМТ) относят к числу наиболее злокачественных и наименее изученных опухолей: на них приходится приблизительно 15% всех злокачественных новообразований. СМТ занимают 4-е место среди причин смертности при онкологических заболеваниях [1]. Это обстоятельство свидетельствует о низкой эффективности лечения.

Наиболее яркая клиническая черта СМТ — их способность к рецидивированию [2]. Многие авторы склонны считать развитие рецидивов после эксцизии опухоли скорее правилом, чем исключением, и, несмотря на значительные успехи в лечении СМТ, частота возникновения локальных рецидивов после иссечения первичной опухоли сопоставима с данными полувековой давности [3].

Во всех значительных исследованиях, посвящённых злокачественным опухолям мягких тканей, указывают на высокую ­частоту рецидивов, варьирующую в широких пределах — от 25 до 60%. В зависимости от характера лечения первичной опухоли и особенностей течения заболевания этот показатель может достигать 90% [4]. Более 80% всех рецидивов развиваются в первые 2 года после лечения первичной опухоли [5].

Склонность к частому рецидивированию обусловлена биологическими свойствами сарком: мультицентрическим характером роста, формированием псевдокапсулы опухоли без чётких границ со здоровыми окружающими тканями. Последнее обстоятельство затрудняет выполнение радикальных операций, так как опухоль в связи с инфильтративным ростом распространяется по межмышечным и периневральным пространствам [2]. Возникновение локального рецидива не является показателем неадекватности проведённого лечения.

Изменение структуры и биологических свойств, характера роста, чувствительности к различным методам терапии, а также высокий риск возникновения местных рецидивов после хирургического и комбинированного лечения определяют важность поиска принципиально новых методик.

Скорость роста вторичных очагов рассматривают как производное сочетания двух параметров: доли клеток паренхимы опухоли в состоянии митоза и процента клеточных потерь — фактора клеточных потерь (ФКП). Высокая скорость роста рецидивных и метастатических очагов СМТ может быть обусловлена низкими показателями ФКП. Митотическая активность этого вида опухолей в среднем невысокая. Однако сочетание этих двух показателей (доли клеток, находящихся в митозе, и ФКП) определяет высокую скорость роста данного вида опухолей [6].

Локальный рецидив развивается из клеток паренхимы опухоли, которые переместились из периферии опухолевого очага в окружающие опухоль ткани. Периферию опухоли составляют наиболее пролиферативно активные клетки [7].

Известно, что при различных патологических состояниях, в том числе злокачественных процессах, количество дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) не бывает одинаковым (диплоидным) и отклоняется от нормального содержания (анеуплоидия) в сторону уменьшения или увеличения.

В настоящее время исследуют способ прогнозирования течения ­опухолево­го процесса при различных новообра­зо-
ва­ниях с использованием метода лазерной ДНК-проточной цитометрии [8–10]. В результате выявлено, что диплоидные опухоли имеют более благоприятное течение, чем анеуплоидные. Анеуплоидия — неблагоприятный признак, у таких больных выше частота рецидивов, короче период клинической ремиссии.

Методом ДНК-проточной цитометрии изучали содержание ДНК в опухолевых клетках при раке различных локализаций [11, 12]. Данный метод позволяет определить плоидность опухолевых клеток, количество анеуплоидных клеток в опухоли, распределение по фазам клеточного цикла и индекс пролиферации. Сопоставление с клиническими данными, а также известными факторами прогноза позволяет рассматривать данный показатель как независимый прогностический признак [10, 13]. Содержание ДНК в клетках и интенсивность клеточной пролиферации, темп деления опухолевых клеток являются важными составляющими, которые характеризуют агрессивность злокачественного процесса, биологические свойства опухоли и определяют течение заболевания [13].

Таким образом, изучение ДНК-цитометрических параметров опухоли перспективно в оценке прогноза заболевания, а также способствует индивидуализации лечения больных.

Ранее нами были изучены ДНК-цитометрические показатели первичных СМТ [14], поэтому целью данного исследования было определение содержания ДНК и распределения клеток по фазам митотического цикла у больных с рецидивными СМТ методом проточной цитометрии.

Изучено и проанализировано содержание ДНК в опухолевой ткани 30 пациентов с рецидивами СМТ. Поскольку для каждого гистологического подтипа сарком тенденция к метастазированию и рецидиву напрямую зависит от размера и степени злокачественности первичной опухоли, изначально было проведено распределение по гистологическому типу и локализации первичной опухоли. Сроки возникновения рецидивов составляли от 3 мес до 3 лет.

Основным методом лечения служил хирургический. В последующем его дополняли лучевой терапией в суммарной очаговой дозе от 40 до 50 Гр. В наблюдениях с низкодифференцированными и недифференцированными саркомами применяли курсы химиотерапии по общепринятым стандартам.

ДНК-исследование проводили на проточном цитометре FACS Canto II (Becton Dickinson, USA) с использованием Cycle TESTTMPLUS DNA ReagentKit. С помощью компьютерной программы ModFit LT обрабатывали полученные данные, анализируя плоидность и распределение клеток опухоли по фазам клеточного цикла.

Долю клеток с различным содержанием ДНК на гистограмме вычисляли как процент от общего числа исследованных клеток. Опухоль считали диплоидной, если выявлялся один пик, который соответствовал нормальному содержанию ДНК в ядрах клеток. При наличии пиков, отличающихся от диплоидного, опухоль расценивали как анеуплоидную. Для оценки степени анеуплоидии определяли индекс ДНК (ИДНК), который представляет собой соотношение между значением канала пика G0/G1 опухолевого образца и значением канала пика G0/G1 нормального (диплоидного) образца. ИДНК диплоидных клеток соответствовал 1,0, следовательно, ИДНК анеуплоидных клеток был больше или меньше 1,0. Индекс пролиферации вычисляли как суммарное число клеток опухоли, находящихся в S- и G2+М-фазах клеточного цикла. Верификацию опухолей осуществляли с помощью гистологического метода на светооптическом уровне.

Статистический анализ результатов исследования выполнен с помощью программы Statistica 10.0 (StatSoft, США), определяли t-критерий Стьюдента для независимых выборок.

По гистологическому типу первичных опухолей преобладали пациенты с липосаркомой — 12 (40%) человек. Плеоморфная саркома диагностирована у 9 (30%), лейомиосаркома — у 4 (13,3%), синовиальная саркома — у 3 (10%), злокачественная мезенхимома — у 2 (6,7%) человек. Распределение по локализации было следующим: у 20 (66,7%) пациентов первичная опухоль встречалась на нижних конечностях, у 9 (30%) — на верхних конечностях, у 1 (3,3%) — на туловище.

Изучение ДНК-цитометрических параметров в рецидивах СМТ выявило преобладание анеуплоидных опухолей в данной группе в 70% случаев (21 из 30 опухолей) — против 30% диплоидных (9 из 30). Среднее содержание анеуплоидных клеток в рецидивных опухолях составило 39,9±5,3%. В среднем ИДНК был равен 2,3±0,2. Отмечено отсутствие опухолей с ИДНК менее 1,0. Анеуплоидия в пределах митотического цикла (ИДНК=1,1–1,84) была выявлена в 52,4% случаев (11 из 21), в 19% отмечены тетраплоидные (ИДНК=1,85–2,15) опухоли (4 из 21), в 28,6% случаев — многоклоновые (6 из 21).

В целом для рецидивных опухолей характерными были высокое содержание доли клеток в G2+M-фазе клеточного цикла (5,2±1,1%), умеренные темпы пролиферации и индекс пролиферации (12,6±2,4 и 17,9±3,7% соответственно). Доля клеток в фазе G0/G1 составила 82,2±3,6%.

Достоверных различий значений параметров клеточного цикла диплоидных и анеуплоидных рецидивных СМТ выявлено не было, однако по темпам пролиферации и индексу пролиферации анеуплоидные опухоли в 1,3 и 1,6 раза превосходили диплоидные. Полученные данные представлены в ~~~~~~~~табл. 1.

 

Таблица 1. Распределение клеток по фазам клеточного цикла рецидивных диплоидных
и анеуплоидных сарком мягких тканей (%)

Тип опухоли

G0/G1-фаза клеточного цикла

G2+M-фаза клеточного цикла

S-фаза клеточного цикла

Индекс пролиферации

Диплоидные опухоли

88,9±4,5

1,8±0,5

10,1±4,3

11,9±4,1

Анеуплоидные опухоли

81,1±4,1

5,4±2,2

13,5±2,7

19,1±3,4

 

Проведённый анализ параметров клеточного цикла рецидивных СМТ в зависимости от степени дифференцировки выявил в 100% случаев диплоидные опухоли при высокой степени дифференцировки (G1; 4 из 4). На долю диплоидных опухолей при G2 приходилось 33,3%, при G3 — 15%. При G2 и G3 преобладали анеуплоидные опухоли, которые составляли 66,7 и 85% соответственно. Среди анеуплоидных опухолей многоклоновые выявлены при G2 в 50% (2 из 4), при G3 — в 23,5% случаев (4 из 17). Тетраплоидные опухоли при G2 составляли 25% (1 из 4), при G3 — 17,6% (3 из 17).

Достоверных различий значений среднего содержания анеуплоидных клеток в рецидивных опухолях в зависимости от степени дифференцировки выявлено не было. При G2 они составили 36,9±5,9%, при G3 — 43,4±6,3%.

Анализ кинетики клеточного цикла позволил выявить ряд достоверных отличий в зависимости от степени дифференцировки рецидивных СМТ. Полученные результаты представлены в ~~~~~~~~табл. 2.

 

Таблица 2. Распределение клеток по фазам клеточного цикла рецидивных сарком мягких тканей в зависимости от различной степени дифференцировки (%)

Степень дифференцировки опухоли

G0/G1-фаза клеточного цикла

G2+M-фаза клеточного цикла

S-фаза клеточного цикла

Индекс пролиферации

G1

95,6±6,4

2,03±0,9

2,39±1.2

4,42±1,6

G2

95,7±4,2

0,31±0,2

4,1±3,9

4,3±2,2

G3

81,9±3,9°↓

2,1±0,8°↑

16,2±3,8°↑*↑

18,4±3,7°↑*↑

Примечание: *различия показателей достоверны по отношению к G1 (p <0,001); °различия показателей достоверны по отношению к G2 (p <0,001).

 

При распределении клеток по фазам клеточного цикла в рецидивных СМТ высокой и умеренной степени дифференцировки не выявлено достоверных различий показателей, тогда как при G3 отмечены достоверные различия по всем проанализированным показателям. Так, рецидивные СМТ низкой степени дифференцировки (G3) ­характеризовались увеличением в 6,8 раза (р <0,001) и 4 раза (р <0,001) темпов пролиферации опухоли, повышением в 4,2 раза (р <0,001) и 4,3 раза (p <0,001) индекса пролиферации по сравнению с опухолями G1 и G2. Отмечено достоверно значимое снижение доли клеток в фазе G0/G1 (р <0,001) и повышение доли клеток в G2+M-фазе (р <0,001) по сравнению с рецидивными опухолями умеренной степени дифференцировки.

При анализе содержания ДНК в опухолевых клетках рецидивных СМТ в зависимости от стадии выявлено снижение доли диплоидных опухолей от IIa к III стадии. Так, опухоли с ИДНК=1,0 при IIa стадии составили 50%, при IIb стадии — 28,6%, при III стадии — 26,3%. При IIa стадии анеуплоидные опухоли составили 50% (2 из 4) и находились в пределах митотического цикла (ИДНК=1,1–1,84). На долю анеуплоидных опухолей при IIb стадии приходилось 71,4% (5 из 7), из которых 40% (2 из 5) соответствовали многоклоновым; при III стадии — 72,7% (14 из 19), из них 28,6% случаев приходилось на тетраплоидные (ИДНК=1,85–2,15) и многоклоновые опухоли (7 из 16).

Анеуплоидные рецидивные СМТ характеризовались достоверно значимым повышением среднего содержания анеуплоидных клеток в опухоли при IIb стадии (36,9±4,6; р <0,001) и III стадии (41,5±4,3; р <0,001) по сравнению со стадией IIa (15,64±3,9).

Повышение пролиферативной активности рецидивных СМТ сопровождалось снижением количества клеток в G0/G1-фазе клеточного цикла, что наиболее выражено при III и IIb стадиях. Так, при снижении доли клеток в фазе G0/G1 при IIb и III стадиях в 1,2 раза по сравнению с IIa стадией выявлено достоверно значимое увеличение индекса пролиферации в 3,9 и 4,2 раза соответственно (р <0,001). Результаты полученных изменений представлены в табл. 3.

 

Таблица 3. Распределение клеток по фазам клеточного цикла рецидивных сарком мягких тканей различных стадий (%)

Стадия заболевания

G0/G1-фаза клеточного цикла

G2+M-фаза клеточного цикла

S-фаза
клеточного цикла

Индекс ­пролиферации

IIа

95,7±2,4

0,9±0,2

3,5±1,3

4,6±1,4

IIb

82,1±6,4*↓

1,1±0,2

16,9±4,1*↑

17,9±5,4*↑

III

81,7±5,9*↓

7,8±2,8*↑°↑

11,4±4,3

19,2±3,7*↑

Примечание: *различия показателей достоверны по отношению к стадии IIa (p <0,001); °различия показателей достоверны по отношению к стадии IIb (p <0,001).

 

Таким образом, максимальная доля клеток в G2+M-фазе митотического цикла выявлена при III стадии, результат достоверно отличается от стадий IIa и IIb. Темпы пролиферации клеток опухоли (доля клеток в S-фазе клеточного цикла) при IIb стадии достоверно значимо превышали аналогичный показатель IIa стадии (р <0,001). При этом различия значений темпов пролиферации IIb и III стадий не имели достоверных различий.

Проведённое ДНК-цитометрическое исследование рецидивных СМТ позволяет определить их особенности и может служить одним из дополнительных методов углублённой диагностики. Нам представляется, что изменения содержания ДНК при рецидивных СМТ вписываются в ­модель кинетики популяции опухолевых клеток, описанную Р. Гут и соавт. (2009) [15].

Выводы

1. Проведённое ДНК-цитометрическое исследование параметров клеточного цикла показало высокий биологический потенциал рецидивных опухолей.

2. В зависимости от степени дифференцировки сарком мягких тканей параметры клеточного цикла были следующими: при высокой степени дифференцировки (G1) опухоли были диплоидными в 100% наблюдений, при умеренной (G2) — в 33,3%, при низкой (G3) — в 15%. Преобладали при G2 и G3 анеуплодные опухоли.

3. Изучение ДНК-цитометрических параметров сарком мягких тканей можно считать перспективным дополнительным методом в оценке рецидивирования и степени злокачественности процесса.

 

В представленной статье конфликт интересов отсутствует.

E M Nepomnyashchaya

Rostov Scientific Research Institute of Oncology

Author for correspondence.
Email: iftrnioi@yandex.ru
Rostov-on-Don, Russia

E P Ul'yanova

Rostov Scientific Research Institute of Oncology

Email: iftrnioi@yandex.ru
Rostov-on-Don, Russia

I A Novikova

Rostov Scientific Research Institute of Oncology

Email: iftrnioi@yandex.ru
Rostov-on-Don, Russia

O N Selyutina

Rostov Scientific Research Institute of Oncology

Email: iftrnioi@yandex.ru
Rostov-on-Don, Russia

E Yu Zlatnik

Rostov Scientific Research Institute of Oncology

Email: iftrnioi@yandex.ru
Rostov-on-Don, Russia

T A Aliev

Rostov Scientific Research Institute of Oncology

Email: iftrnioi@yandex.ru
Rostov-on-Don, Russia

L N Vashchenko

Rostov Scientific Research Institute of Oncology

Email: iftrnioi@yandex.ru
Rostov-on-Don, Russia

T V Ausheva

Rostov Scientific Research Institute of Oncology

Email: iftrnioi@yandex.ru
Rostov-on-Don, Russia

E A Andreyko

Rostov Scientific Research Institute of Oncology

Email: iftrnioi@yandex.ru
Rostov-on-Don, Russia

E I Zolotareva

Rostov Scientific Research Institute of Oncology

Email: iftrnioi@yandex.ru
Rostov-on-Don, Russia

E S Bondarenko

Rostov Scientific Research Institute of Oncology

Email: iftrnioi@yandex.ru
Rostov-on-Don, Russia

  • Siegel R.L., Miller K.D., Jemal A. Cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 2016; 66 (1): 7–30. doi: 10.3322/caac.21332.
  • Zinov'ev G.V., Gafton G.I., Bus'ko E.A. et al. Locally recurrent soft tissue sarcomas of extremities: detection and treatment. Sarkomy kostey, myagkikh tkaney i opukholi kozhi. 2017; (1): 32–41. (In Russ.)
  • Zinov'ev G.V., Gafton G.I., Bus'ko E.A. et al. Detection of recurrencies soft tissue sarcomas of the extremities. Sibirskiy onkologicheskiy zhurnal. 2017; 16 (2): 82–89. (In Russ.)
  • Aliev M.D., Men' T.Kh. The incidence of soft tissue sarcomas in Russia. Sarkomy kostey, myagkikh tkaney i opukholi kozhi. 2013; (3): 3–9. (In Russ.)
  • Stojadinovic A., Leung D.H., Hoos A. et al. Analysis of the prognostic significance of microscopic margins in 2,084 localized primary adult soft tissue sarcomas. Ann. Surg. 2002; 235: 424–434. doi: 10.1097/00000658-200203000-00015.
  • Bazanov K.V. Research of growth rate of recurrent and metastatic sarcomas of soft tissues. Sovremennye problemy nauki i obrazovaniya. 2014; (6): 1227. (In Russ.)
  • Kolobov A.V., Polezhaev A.A. Influence of random malignant cell motility on growing tumor front stability. Komp'yuternye issledovaniya i modelirovanie. 2009; 1 (2): 225–232. (In Russ.)
  • Nerodo G.A., Novikova I.A., Nikitina V.P. et al. Clinical value of DNA flow cytometry in ovarian cancer. Sovremennye problemy nauki i obrazovaniya. 2016; (3): 35. (In Russ.)
  • Tevryukova N.S., Bogatyrev V.N. Significance of DNA-flow laser cytometry in a differential cytological diagnosis and prostate cancer prognosis. Rossiyskiy onkologicheskiy zhurnal. 2013; (1): 10–19. (In Russ.)
  • Abdalla F., Buhmeida A., Alshrad M. et al. Prognostic significance of DNA image cytometry in libyan breast cancer. Oncology. 2012; 83: 165–176. doi: 10.1159/000339788.
  • Gazic B., Pizem J., Bracko M. et al. S-phase fraction determined on fine needle aspirates is an independent prognostic factor in breast cancer — a multivariate study of 770 patients. Cytopathology. 2008; 19 (5): 294–302. doi: 10.1111/j.1365-2303.2007.00528.x.
  • Kravets O.A., Bogatyrev V.N. The value of laser flow DNA-cytofluorometry in radiation therapy of cervical cancer. Effektivnaya farmakoterapiya. 2012; (2): 42–47. (In Russ.)
  • Susini T., Olivieri S., Molino C. et al. DNA ploidy is stronger than lymph node metastasis as prognostic factor in cervical carcinoma: 10-year results of a prospective study. Int. J. Gynecol. Cancer. 2011; 21 (4): 678–684. doi: 10.1097/IGC.0b013e3182126f85.
  • Novikova I.A., Nepomnyashchaya E.M., Ul'yanova E.P. et al. DNA-cytometric characteristics of primary soft tissue sarcomas. Kazanskiy meditsinskiy zhurnal. 2017; 98 (4): 509–513. (In Russ.)
  • Gut R., Zharinov G.M., Yakubov E. A simplified model for kinetics of a tumor cells' population. Voprosy onkologii. 2009; 55 (1): 83–88. (In Russ.)

Views

Abstract - 75

PDF (Russian) - 94

PlumX


© 2018 Nepomnyashchaya E.M., Ul'yanova E.P., Novikova I.A., Selyutina O.N., Zlatnik E.Y., Aliev T.A., Vashchenko L.N., Ausheva T.V., Andreyko E.A., Zolotareva E.I., Bondarenko E.S.

Creative Commons License

This work is licensed
under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International License.


Свидетельство о регистрации СМИ ЭЛ № ФС 77-70434 от 20 июля 2017 года выдано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор)