Some features of musclemetabolic processes changes with prolonged use of simvastatin and thioctic acid in the experiment

Cover Page

Abstract


Aim. To identify biochemical changes in the muscle tissue of rats in long-term comprehensive administration of simvastatin and thioctic acid (lipoic acid).

Methods. The study was conducted on 120 male outbred rats. The animals were divided into 2 groups: group 1 - intact animals fed common vivarium diet, group 2 - with induced essential hypercholesterolemia. The animals of the experimental group were divided into three subgroups: subgroup 1 - animals that received a diet without the additional drugs; subgroup 2 - those who received simvastatin, and subgroup 3 - those who received simvastatin in combination with thioctic (lipoic) acid. At the end of experiment the concentrations of pyruvic acid, lactate, and reduced glutathione, activity of glutathione reductase, glutathione peroxidase, succinate dehydrogenase and cytochrome oxidase were determined in the muscle of experimental animals.

Results. The development of hypercholesterolemia was found to be characterized by the accumulation of pyruvic acid and lactate in the muscles of rats, which may indicate metabolic acidosis formation. The activity of antioxidant enzymes was multidirectional, indicating disorganization of the main mechanisms of antioxidant defense. The dynamics of antioxidant enzymes activity in animal muscles after the administration of simvastatin indicates aggravation of antioxidant defense disorders. The decrease of the concentration of pyruvic acid and lactate indicates a decrease of the severity of hypoxia. At the same time, decrease of the activity of cytochrome oxidase and succinate dehydrogenase indicates the prevalence of anaerobic bioenergetic mechanisms. After administration of simvastatin in combination with thioctic (lipoic) acid, a decrease of the level of pyruvic acid and lactate to the levels in the control group, an increase of the activity of succinate dehydrogenase and cytochrome oxidase, and increase of the reduced activity of glutathione peroxidase and the concentration of reduced glutathione were detected.

Conclusion. Analyzing the data obtained, thioctic (lipoic) acid with the concomitant use of a statin can be assumed to provide reduction of the severity of hypoxia, stabilization of the bioenergetic and antioxidant processes that can be used for targeted impact on certain pathobiochemical violations in muscle tissue with chronic administration of statins.


Статины — группа наиболее эффективных гиполипидемических средств, обычно назначаемых на продолжительный срок. По дан­ным результатов крупных клинических исследований (CARE, LIPID, WOSCOPS, ASCOT-LLA, CARDS, GALAXY), постоянный приём статинов в течение 3–6 лет уменьшает риск развития инфаркта миокарда, нестабильной стенокардии и смертельных исходов на 25–40%, ишемических инсультов — на 25–30% [1, 2].

Применение статинов ­ассоциируется с развитием специфического побочного эффекта — миопатии различной степени тяжести. Согласно данным официальной статистики, частота развития статиновой миопатии составляет не более 1%, однако исследованию патогенеза этого заболевания и способов его профилактики посвящено большое количество исследований. Несмотря на это обстоятельство, отсутствует полноценное представление о комплексе биохимических изменений, лежащих в основе структурно-функциональных нарушений мышечной ткани, что существенно затрудняет разработку эффективных схем профилактики и коррекции патогенетических сдвигов [3].

Согласно результатам проведённых ранее исследований и данным литературы, длительное введение статинов способствует нарушению биоэнергетических процессов в мышечной ткани [4–6].

Накоплен обширный материал по применению тиоктовой (липоевой) кислоты как метаболического корректора при различных видах патологии. При этом корригирующее воздействие липоевой кислоты направлено на нормализацию энергетического метаболизма и процессов антиоксидантной защиты [7].

В связи с этим целью работы был анализ биохимических изменений в мышечной ткани после длительного приёма симвастатина в сочетании с тиоктовой (липоевой) кислотой.

Исследование выполнено на 120 беспородных крысах-самцах в возрасте 12–14 мес (масса теля 300–350 г). Животных кормили натуральными и брикетированными кормами в соответствии с нормами, утверждёнными приказом №755 от 12.08.1977 (приказ Минздравсоцразвития РФ от 23.08.2010 №708н «Об утверждении Правил лабораторной практики»). Все работы проведены согласно принципам гуманного отношения к животным в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных», «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» и «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации» (приказ МЗ РФ №267 от 19.06.2003).

В процессе эксперимента животные были разделены на две группы. В первую (контрольную) группу входили 30 интактных животных, которых содержали на общем рационе вивария. У крыс второй (экспериментальной) группы индуцировали эссенциальную гиперхолестеринемию путём содержания в течение 3 мес на рационе, обогащённом животными жирами (топлённое сливочное масло) и легко усваиваемыми углеводами (тростниковый сахар, манная крупа).

По истечении этого срока животные экспериментальной группы были разделены на три подгруппы:
– подгруппа 1 — 30 животных, получавших рацион без добавления лекарственных веществ;
– подгруппа 2 (сравнения) — 30 животных, получавших в течение 2 мес симвастатин (Zocor, 20 мг) по 0,001 г на 100 г массы тела 1 раз в сутки в виде водной суспензии через пищеводный зонд [8];
– подгруппа 3 (экспериментальная) — 30 животных, получавших в течение 3 мес симвастатин (Zocor, 20 мг) в терапевтической дозе (0,001 г на 100 г массы тела) и липоевую кислоту (Тиоктацид БВ, 600 мг) в терапевтической дозе (0,857 мг на 100 г массы тела) 1 раз в сутки в виде водной суспензии через пищеводный зонд.

По истечении срока эксперимента животных декапитировали под эфирным наркозом. Все манипуляции ­выполняли в соответствии с «Общими этическими принципами экспериментов над животными», утверждёнными І Национальным конгрессом по биоэтике.

Для исследования отбирали с задней лапы животного фрагменты скелетных мышц. Гомогенат мышечной ткани готовили в соотношении 1 г ткани на 9 мл охлаждённого изотонического раствора натрия хлорида и центрифугировали при 3000 об./мин. В гомогенатах определяли концентрацию лактата, пировиноградной кислоты и восстановленного глутатиона [9], а также активность ферментов — глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы [10].

Митохондрии выделяли дифференциальным центрифугированием после гомогенизации в солевом растворе (0,15 М KCl и 10 мМ трис-HCl). Для удаления ядерной фракции гомогенаты центрифугировали 15 мин при 640 g. Фракцию митохондрий выделяли в течение 25 мин при 20 000 g с двукратным промыванием средой выделения. Суспензию митохондрий использовали для определения активности цитохромоксидазы и сукцинатдегидрогеназы [10].

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием программы Statistica 6.0. Статистически значимыми считали различия, соответствующие оценке ошибки вероятности р ≤0,05.

Полученные результаты представлены в табл. 1. В скелетных мышцах испытуемых животных с экспериментальной гиперхолестеринемией (подгруппа 1) обнаружено существенное увеличение уровня пирувата и лактата — на 247% (p <0,001) и 73% (p <0,001) соответственно относительно контрольной группы.

 

Показатель \ Группы животных

 

Первая группа, n=30

Вторая группа, n=90

Подгруппа 1, n=30

Подгруппа 2, n=30

Подгруппа 3, n=30

Контрольная группа

Гипер­холестериновая диета

Гипер­холестериновая диета + симвастатин

Гипер­холестериновая диета + симвастатин + тиоктовая кислота

Пировиноградная кислота, мкмоль/мл плотного осадка

2,25±0,024

7,81±0,570

p <0,001

3,28±0,269

p <0,001

p1 <0,001

2,0±0,22

p >0,05

p1 <0,001

Лактат, мкмоль/мл плотного осадка

3,96±0,447

6,86±0,657

p <0,001

4,64±0,491

p >0,05

p1 <0,001

5,56±0,564

p >0,05

p1 >0,05

Сукцинатдегидрогеназа, мкмоль/г Hb

2,14±0,235

2,44±0,261

p >0,05

0,79±0,066

p <0,001

p1 <0,001

3,83 ±0,43

p <0,001

p1 <0,001

Цитохромоксидаза, мкмоль/г Hb

0,0039±0,0005

0,0036±0,00028

p >0,05

0,0011±0,0001

p <0,001

p1 <0,001

0,0053±0,0008

p <0,001

p1 <0,001

Восстановленный глутатион, мкмоль/г Hb

28,79±4,187

96,55±7,894

p <0,001

48,44±3,213

p <0,001

p1 <0,001

59,41 ±7,754

p <0,001

p1 >0,05

Глутатионпероксидаза, мкмоль/г Hb

13,04±0,892

6,59±0,554

p <0,001

2,43±0,191

p <0,001

p1 <0,001

19,79 ±3,392

p <0,001

p1 <0,001

Глутатионредуктаза, мкмоль/г Hb

0,023±0,0042

0,048±0,0030

p <0,001

0,030±0,0029

p >0,05

p1 <0,001

0,010±0,0015

p <0,001

p1 <0,001

Примечание: статистическая значимость различий р — относительно контрольной группы; р1 — относительно группы сравнения; Hb — гемоглобин.

 

При определении активности ферментов энергетического обмена в митохондриях выявлено, что активность ­цитохромоксидазы и сукцинатдегидрогеназы не отличалась от значений контрольной группы.

Повышение уровня лактата и пировиноградной кислоты можно рассмотреть как показатель увеличения интенсивности окислительного распада глюкозы. С другой стороны, накопление недоокисленных продуктов гликолиза способствует формированию метаболического ацидоза.

Разнонаправленные модификации активности ферментов глутатионового звена антиоксидантной защиты выявлены в мышцах испытуемых животных с экспериментальной гиперхолестеринемией. Активность глутатионпероксидазы снизилась на 49,47% (p <0,001) на фоне существенного увеличения активности показателей глутатионредуктазы (на 109%, p <0,001) и концентрации восстановленного глутатиона (на 235,36%, p <0,001) относительно контрольной группы.

О формировании дисбаланса в организации ферментативной антиоксидантной защиты свидетельствуют разносторонние изменения активности ферментов антиоксидантной защиты. Согласно данным литературы, длительное содержание экспериментальных животных на высокожировом рационе способствует понижению активности антиоксидантных ферментов, что обусловлено усилением продукции активных форм кислорода в процессе митохондриального и пероксисомального окисления жирных кислот, активацией НАДФ(никотинамидадениндинуклеотидфосфат)-оксидазы и усилением окислительной деградации липидов, происходящей под действием свободных радикалов [11].

В гомогенате мышц испытуемых животных подгруппы 2 (с экспериментальной гиперхолестеринемией, получавших симвастатин) было обнаружено снижение концентрации и лактата на 32,36% (p1 <0,001), и пировиноградной кислоты на 58% (p1<0,001) относительно группы сравнения. По отношению к контрольной группе концентрация пировиноградной кислоты увеличилась на 45,8% (p <0,001), а лактата достоверно не отличалась.

Нужно отметить, что, несмотря на сохраняющийся режим питания, применение симвастатина способствовало выравниванию гиперметаболизма глюкозы, о чём свидетельствует снижение показателей лактата и пировиноградной кислоты.

Кроме этого, у экспериментальных животных подгруппы 2 в митохондриях установлено резкое уменьшение активности цитохромоксидазы на 69,44% (p1<0,001) и сукцинатдегидрогеназы на 67,62% (p1<0,001). Также при сравнении полученных результатов с показателями первой (контрольной) группы активность цитохром-
оксидазы и сукцинатдегидрогеназы снизилась на 71,8% (p <0,001) и 63% (p <0,001) соответственно.

В литературе содержатся весьма противоречивые данные о нарушениях биосинтеза убихинона при введении высоких доз статинов. Однако можно предположить, что снижение активности цитохромоксидазы и сукцинатдегидрогеназы может быть связано с дефицитом коэнзима, осуществляющего коллекторную функцию и обеспечивающего полноценное окисление НАД(никотинамидадениндинуклеотид)- и ФАД(флавинадениндинуклеотид)-зависимых субстратов. С другой стороны, эти же модификации, возможно, связаны с ингибирующим влиянием повышенной концентрации лактата, способного вступать в реакции межмолекулярной дегидратации, образовывать комплексы с мембранными фосфолипидами и снижать поступление кислорода в клетку [3].

В ходе эксперимента после введения симвастатина на основании полученных показателей было установлено дальнейшее уменьшение активности глутатионпероксидазы на 63,13% (p1 <0,001), глутатионредуктазы — на 37,5% (p1 <0,001), концентрации восстановленного глутатиона — на 49,93% (p1 <0,001) по отношению к показателям подгруппы 1. Также при сравнении полученных результатов с показателями первой (контрольной) группы была снижена активность глутатионпероксидазы на 81,37% (p1<0,001), а уровень восстановленного глутатиона был повышен на 68,25% (p <0,001), но показатели глутатионредуктазы достоверно не отличались.

Принимая во внимание низкие показатели активности глутатионперксидазы, можно предположить, что основным механизмом, направленным на сохранение внутриклеточной антиокислительной активности, служит окисление SH-групп (тиольных групп) глутатиона.

При исследовании анализируемых показателей в скелетной мышечной ткани ­испытуемых животных с экспериментальной гиперхолестеринемией, получавших симвастатин в сочетании с тиоктовой (липоевой) кислотой (подгруппа 3), установлено снижение уровня пировиноградной кислоты на 61% (p1 <0,001), тогда как уровень лактата достоверно не изменился относительно показателей подгруппы 2. Необходимо отметить, что при введении симвастатина в сочетании с тиоктовой (липоевой) кислотой оба показателя соответствовали таковым в первой (контрольной) группе.

При определении концентраций ферментов, участвующих в энергетическом обмене, было обнаружено существенное увеличение активности сукцинатдегидрогеназы и цитохромоксидазы в 5 раз по отношению к показателям группы сравнения. Необходимо сказать, что повысилась активность сукцинатдегидрогеназы на 179% (p <0,001), а цитохромоксидазы — на 136% (p <0,001) относительно показателей контрольной группы.

Принимая во внимание коферментную роль тиоктовой (липоевой) кислоты в реакциях дегидрирования, можно полагать, что её сочетанное применение с симвастатином способствует нивелированию нарушений энергетического обмена за счёт окисления молочной кислоты в пировиноградную и уменьшения выраженности метаболического ацидоза [3].

В проведённых раннее исследованиях показано, что включение липоевой кислоты (тиактоцида БВ) в комплексную терапию повторного инфаркта миокарда способствовало снижению выраженности метаболического ацидоза, на что указывало снижение концентрации лактата в эритроцитах. При этом соотношение окисленных и резистентных к окислению фракций липопротеинов, уровень суммарных метаболитов азота и снижение активности гранулоцитарной эластазы указывали на уменьшение выраженности воспалительного процесса и интенсивности процессов ремоделирования венечных сосудов и мио­карда [4, 7].

Нами выявлены значительное увеличение активности глутатионпероксидазы (в 8 раз) и тенденция к дальнейшему увеличению содержания глутатиона, тогда как активность глутатионредуктазы была снижена на 33,96% (p1 <0,001) относительно показателей группы сравнения. По сравнению с показателями контрольной группы активность глутатионпероксидазы была увеличена на 51,8% (p <0,001), содержание восстановленного глутатиона — на 106% (p <0,001), а активность глутатионредуктазы была снижена на 56,6% (p <0,001).

Вероятно, повышение активности глутатионпероксидазы может быть связано с устранением ингибирующего влияния лактоацидоза. С другой стороны, липоевая кислота служит эффективным антиоксидантом, связывая ионы железа и способствуя снижению интенсивности свободнорадикального окисления [12].

Вывод

Исходя из полученных данных, можно полагать, что тиоктовая (липоевая) кислота при сочетанном применении с препаратом из группы статинов способствует снижению тяжести гипоксии, стабилизации биоэнергетических и антиоксидантных процессов, что может быть использовано для целенаправленного воздействия на отдельные патобиохимические нарушения в мышечной ткани при длительном приёме статинов.

 

Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

I A Semenets

Author for correspondence.
semenets.i.a@mail.ru
Rostov State Medical University Rostov on Don, Russia

  • Schuster H. The GALAXY Program an update on studies investigating efficacy and tolerability of rosuvastatin for reducing cardiovascular risk. Investigating cardiovascular risk reduction — the Rosuvastatin GALAXY Programme. Expert Rev. Cardiovasc. Ther. 2007; 5: 177–193. doi: 10.1586/14779072.5.2.177.
  • Sever P.S., Dahlof B., Poulter N.R. et al. Prevention of coronary and stroke events with atorvastatin in hypertensive patients who have average or lower-than-average cholesterol concentrations, in the Anglo-Scandinavian Cardiac Outcomes Trial — Lipid Lowering Arm (ASCOT-LLA): a multicenter randomized controlled trial. Lancet. 2003; 361: 1149–1158. doi: 10.1016/S0140-6736(03)12948-0.
  • Storozhuk P.G. Biokhimicheskaya priroda avtomatizma serdtsa, ego svyaz' s nervnoy sistemoy i ekstrapolyatsiya khimicheskikh protsessov na elementy kardiogrammy. (The biochemical nature of automatism of the heart, its connection to the nervous system and extrapolation of chemical processes on the elements of the electrocardiogram.) Krasnodar: Izd-vo GBOU VPO KubGMU. 2011; 104 р. (In Russ.)
  • Gridasova P.A., Mikashinovich Z.I., Belousova E.S., Kovalenko T.D. Estimation of lipoic acid clinical efficacy at patients with postinfarction cardiosclerosis. Zhurnal fundamental'noy meditsiny i biologii. 2012; (1): 57–61. (In Russ.)
  • Mikashinovich Z.I., Belousova E.S. Biochemical changes in erythrocytes as a molecular indicator of cell damage in long-term administration of simvastatin. Kletochnye tekhnologii v biologii i meditsine. 2016; (2): 122–126. (In Russ.)
  • Belousova E.S., Mikashinovich Z.I., Kovalenko T.D. The signs of myopathia development caused by prolonged symvastatin (Zocor) intake. Zhurnal fundamental'nykh issledovaniy. 2014; (5): 1197–1200. (In Russ.)
  • Gridasova P.A. Influence of Thioctacid HR on the parameters of lipid metabolism in patients with ischemic heart disease after myocardial infarction. Materials of Russian National congress of cardiologists. Supplement 1 to the journal «Kardiovaskulyarnaya terapiya i profilaktika». 2011; (6): 82–83. (In Russ.)
  • Belousova E.S., Mikashinovich Z.I., Sarkisyan O.G. et al. A method of modelling myopathy. Patent for invention RF №062632624. Bulletin issued at 06.10.2017. (In Russ.)
  • Spravochnik po laboratornym metodam issledovaniy. (Laboratory methods reference.) Ed. by L.A. Danilova. Saint Petersburg: Piter. 2003; 736 р. (In Russ.)
  • Mikashinovich Z.I., Letunovskiy A.B., Volzhin O.O., Belousova E.S. Biokhimicheskie issledovaniya slyuny v klinicheskoy praktike. (Biochemical analysis of the saliva in clinical practice.) Rostov-on-Don: izd-vo RostGMU. 2004; 80 р. (In Russ.)
  • Mikashinovich Z.I., Belousova E.S., Vinogradova E.V., Semenets I.A. Enzymatic antioxidant protection in muscles of rats under long-term administration of simvastatin. Meditsinskiy vestnik Bashkortostana. 2017; 12 (1): 54–57. (In Russ.)
  • Kalinchenko S.Yu., Vorslov L.O., Kurnikova I.A., Gadzieva I.V. Current view of the possibilities of alpha-lipoic acid use. Effektivnaya farmakoterapiya. Urologiya i nefrologiya. 2012; (1): 54–58. (In Russ.)

Views

Abstract - 28

PDF (Russian) - 58

PlumX


© 2018 Semenets I.A.

Creative Commons License

This work is licensed
under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International License.


Свидетельство о регистрации СМИ ЭЛ № ФС 77-70434 от 20 июля 2017 года выдано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор)