Age-related features of activity of free radical oxidation in erythrocyte membranes and blood plasma in postinfarction cardiosclerosis in rats

Full Text

В настоящее время выдвинуто несколько теорий старения, в том числе теория Хармана, согласно которой основной процесс, определяющий возрастные изменения, — усиление свободнорадикального повреждения клеток и их структур [1]. Известно, что оксидативный стресс представляет собой универсальное звено развития как возрастных изменений, так и патогенеза многих заболеваний [2–4]. Обу­словлено это тем, что свободные радикалы легко вступают во взаимодействие с липидами и нуклеиновыми кислотами, карбоксильными, амидными и заряжёнными аминогруппами аминокислотных остатков белков, вызывая их окислительную модификацию [3]. Происходящие окислительные изменения молекул отражаются на активности ферментов, структурной целостности интегральных мембранных белков и липидного бислоя.

В кардиологии насущным вопросом остаётся изучение изменений, происходящих при ишемическом и реперфузионном поражениях сердечной мышцы. Показано, что при развитии инфаркта миокарда создаются условия для неконтролируемого развития перекисных процессов [5]. Считают, что возрастной фактор может иметь существенное влияние на интенсивность оксидативного повреждения при постинфарктном кардиосклерозе (ПИКС).

Цель работы — у крыс разного возраста в интактном состоянии и с развившимся ПИКС определить присутствие продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и белков в мембранах эритроцитов и плазме крови.

Исследования выполнены на трёх возрастных группах самцов крыс линии Wistar:

• 4-месячные крысы с массой тела 200–250 г;
• 12-месячные крысы с массой тела 400–450 г;
• 24-месячные крысы с массой тела 500–550 г.

Работы с животными проводили согласно всем принципам гуманности, содержащимся в директиве Европейского сообщества (86/609/ЕС), и в соответствии с Приказом Минздрава РФ №267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики».

Каждая возрастная группа была представлена 10 интактными крысами и 10 крысами с развившимся ПИКС. Моделирование ПИКС крысам выполняли, вызывая инфаркт ­миокарда методом коронароокклюзии [5]. Окклюзию венечной артерии выполняли в стерильных условиях, под наркозом (телазол® внутримышечно в дозе 0,1 мг/кг). После торакотомии в верхней трети передней венечной (коронарной) артерии накладывали лигатуру. Рану засыпали антибиотиком и зашивали.

Оперированных крыс содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и корму в течение 42 сут. К этому сроку у экспериментальных животных формировался ПИКС, и их одновременно с интактными крысами выводили из эксперимента и производили забор крови.

Кровь забирали в пробирку с гепарином в соотношении 1:10. Для получения плазмы образцы крови центрифугировали при 3000 об./мин в течение 15 мин. Мембраны эритроцитов получали методом гипоосмотического гемолиза клеток по описанной ранее методике [6]. Полученную плазму крови и мембраны эритроцитов аликвотировали и хранили в низкотемпературном морозильнике при –80 °C.

Присутствие продуктов ПОЛ в мембранах эритроцитов и плазме крови оценивали по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой, определяя концентрацию продуктов, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК-РП), при λ=535 нм [5].

Продукты окислительной модификации белков мембран эритроцитов определяли по реакции карбонильных производных аминокислотных остатков белков (КПБ) с 2,4-динитрофенилгидразином по методу R.L. Levine [7]. Метод основан на реакции взаимодействия окисленных до альдегидных и кетоновых группировок (карбонильных групп) аминокислотных остатков с 2,4-динитрофенилгидразином с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов, имеющих максимум поглощения при λ=370 нм. Определение белка в мембранах эритроцитов выполняли микробиуретовым методом [8].

Оценку статистической значимости выявленных различий изучаемых показателей проводили с использованием непараметрического критерия Манна–Уитни для независимых выборок. Статистически значимыми считали различия при значении р <0,05.

В табл. 1 представлены данные, полученные при определении содержания ТБК-РП в мембранах эритроцитов интактных крыс рассматриваемых возрастных групп.

 

Таблица 1. Содержание реагирующих с тиобарбитуровой кислотой продуктов (ТБК-РП) в мембранах эритроцитов и плазме крови крыс разного возраста в интактном состоянии и при моделировании постинфарктного кардиосклероза (ПИКС), М±m

Показатель Группа	ТБК-РП в мембранах эритроцитов, ммоль/мг белка	ТБК-РП в плазме крови, ммоль/л
Интактные крысы 4 мес (n=10), группа 1	11,51±1,12 р1–2=0,002 р1–3=0,141 р1–5=0,013	20,57±2,69 р1–2=0,006 р1–3=0,037 р1–5=0,027
Крысы с ПИКС 4 мес (n=10), группа 2	19,71±1,65 р2–4=0,002 р2–6=0,007	28,23±1,97 р2–4=0,002 р2–6=0,007
Интактные крысы 12 мес (n=10), группа 3	6,23±1,23 р3–5=0,003 р3–4=0,391	24,19±0,88 р3–5=0,112 р3–4=0,004
Крысы с ПИКС 12 мес (n=10), группа 4	6,86±0,97 р4–6=0,00006	12,56±1,67 р4–6=0,003
Интактные крысы 24 мес (n=10), группа 5	17,17±0,71 р5–6=0,0006	23,18±1,75 р5–6=0,071
Крысы с ПИКС 24 мес (n=10), группа 6	27,40±1,23	21,20±1,24

 

Видно, что значение этого показателя у крыс 24-месячного возраста в 1,6 раза превышает аналогичный показатель, полученный у животных 4 мес, и в 3,1 раза — 12-месячного возраста. Сопоставление этих данные свидетельствует о том, что выраженная активация ПОЛ в мембранах эритроцитов происходит при достижении крысами практически максимального для них срока жизни. И напротив, для крыс среднего возраста характерно снижение образования конечного продукта пероксидации липидов в мембранах эритроцитов. Такой результат, возможно, обеспечен высокой активностью антиоксидантных ферментов в ­эритроцитах.

При определении ТБК-РП в плазме крови интактных крыс наименьшее значение получено для группы 4-месячных крыс. Содержание ТБК-РП в пробах 12- и 24-месячных крыс было значительно выше.

Анализ полученных результатов позволяет сказать, что интенсивность процессов ПОЛ в отношении и мембран эритроцитов, и плазмы крови на рассматриваемых этапах онтогенеза крыс имеет свою специфику. У крыс в 12-месячном возрасте происходит активное накопление ТБК-РП в плазме крови, в то время как в мембранах эритроцитов — напротив, снижение их образования. В 24-месячном возрасте у крыс зарегистрировано накопление ТБК-РП как в плазме крови, так и в мембранах эритроцитов. Такое соотношение позволяет сделать вывод о генерализации процесса свободнорадикального окисления липидов и ослаблении антиоксидантной защиты в эритроцитах, а возможно — и в клетках других тканей.

Данные, полученные при определении ТБК-РП в образцах мембран эритроцитов и плазмы крови крыс с ПИКС, представлены в табл. 1. Оказалось, что в мембранах эритроцитов крыс 4- и 24-месячного возраста на фоне ПИКС происходит статистически значимое усиление образования ТБК-РП соответственно в 1,7 и 1,6 раза относительно интактных животных аналогичного возраста. В группе 12-месячных крыс формирование ПИКС не повлияло на интенсивность образования ТБК-РП в мембранах эритроцитов. Полученный результат свидетельствует о том, что именно у 12-месячных крыс антиоксидантная активность в форменных элементах крови сохраняется наиболее полно и способна сдерживать неконтролируемое развитие ПОЛ.

Иное соотношение содержания ТБК-РП на фоне ПИКС получено для плазмы крови (см. табл. 1). Для 4-месячных крыс было характерно статистически значимое увеличение этого показателя в 1,3 раза относительно интактных животных этой возрастной группы. У 12-месячных крыс отмечено значимое уменьшение этого показателя в 1,9 раза в сравнении с показателями у интактных особей соответствующего возраста. В пробах плазмы крови 24-месячных крыс уровень ТБК-РП в условиях ПИКС не отличался от интактных значений у животных этого возраста.

Сопоставление полученных результатов позволяет сделать вывод, что у 4-месячных крыс в ответ на формирование ПИКС происходит активация свободнорадикальных процессов как в мембранах эритроцитов, так и в плазме крови. У крыс 12-месячного возраста такой активации не отмечено. Выявленное различие, вероятно, можно объяснить тем, что к этому возрасту у крыс формируются наибольшие компенсаторные возможности антиоксидантной системы как в мембранах эритроцитов, так и в плазме крови. Формирование ПИКС у крыс 24-месячного возраста сопровождается увеличением интенсивности ПОЛ только в мембранах эритроцитов.

На рис. 1 представлены результаты определения содержания КПБ в мембранах ­эритроцитов (А) и плазме крови (Б). Видно, что в эритроцитах интактных крыс разного возраста этот показатель не имел значимых различий. Стабильность показателя КПБ позволяет предположить, что в процессе онтогенеза у крыс белки эритроцитарных мембран не подвергаются выраженной модификации активными формами кислорода, как это было отмечено при исследовании интенсивности свободнорадикальных процессов в липидах. Напротив, в плазме крови было выявлено значимое увеличение значения КПБ в зависимости от возраста животных. Так, значения КПБ в плазме крови 24-месячных крыс в 1,5 раза (р <0,01) превышало аналогичный показатель у 4-месячных. Значимое увеличение показателя КПБ позволяет говорить о том, что процессе онтогенеза повышается интенсивность окисления активными формами кислорода аминокислотных остатков белков плазмы крови.

 

 

Рис. 1. Содержание карбонильных производных аминокислотных остатков белков в образцах мембран (А) и плазме крови (Б) животных в возрасте 4, 12 и 24 мес в интактном состоянии и при постинфарктном кардиосклерозе (ПИКС). Уровень значимости различий: у интактных животных разных возрастных групп — *р <0,05, **р <0,01; у интактных животных и животных с ПИКС одного возраста — ##р <0,01; у животных с ПИКС между группами в возрасте 4, 12 и 24 мес — @p <0,05, @@p <0,001

 

Содержание карбонильных групп в белках эритроцитарных мембран и плазмы крови рассматриваемых возрастных групп животных с ПИКС изменялось разнонаправленно. В эритроцитарных мембранах животных в возрасте 4 и 12 мес отмечено достоверно значимое увеличение содержания КПБ в 4,5 и 4,4 раза соответственно (см. рис. 1, А). В группе 24-месячных животных с ПИКС показатель КПБ в мембранах эритроцитов достоверно не отличался от показателя у интактных животных.

На рис. 1, Б представлены результаты определения содержания КПБ в плазме крови животных с ПИКС. Развитие ПИКС не привело к значимым изменениям этого показателя в сравнении с группами интактного возрастного контроля. Следует отметить, что в плазме крови животных 24 мес с ПИКС показатель КПБ значимо превышал значения в группах 4- и 12-месячных животных с ПИКС, что было характерно для крыс этой возрастной группы и в интактном состоянии. КПБ обладают большим периодом полураспада и выведения из организма [9], что выражается в их высоком содержании в образцах плазмы крови.

Выводы

1. Интенсивность процессов перекисного окисления липидов мембран эритроцитов и плазмы крови имеет выраженные зависимые от возраста особенности, заключающиеся в снижении интенсивности свободнорадикального окисления липидов у животных 12 мес по сравнению с животными 4 мес и их активации у животных 24 мес. Отмеченные особенности сохраняются в условиях постинфарктного ремоделирования миокарда.

2. Белки мембран эритроцитов в процессе онтогенеза животных подвержены перекисной модификации в меньшей степени, чем белки плазмы крови. При формировании постинфарктного кардиосклероза перекисное повреждение белкового компонента, наоборот, наиболее интенсивно протекает в эритроцитарных мембранах в сравнении с белками плазмы крови. Эта динамика отмечена у молодых животных и животных среднего возраста. У животных в возрасте 24 мес белковый компонент мембран стабилен в условиях патологической активации свободнорадикального окисления при постинфарктном кардиосклерозе.

 

Работа выполнена в рамках темы фундаментальных научных исследований №АААА-А15-115123110026-3.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

About the authors

T Yu Rebrova

Cardiology Research Institute, Tomsk National Research Medical Center of the Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: rebrova@cardio-tomsk.ru
Tomsk, Russia

S A Afanas’ev

Cardiology Research Institute, Tomsk National Research Medical Center of the Russian Academy of Sciences

Email: rebrova@cardio-tomsk.ru
Tomsk, Russia

References

Supplementary files