Role of O6-methylguanine-DNA methyltransferase and p53 in response of neuroblastoma cells to an alkylating agent temozolomide

Full Text

Нейробластомы — разновидность сόлидных злокачественных новообразований, возникающих из эмбриональных нейро­бластов симпатической нервной системы. Это наиболее частая экстракраниальная солидная бластома, встречающаяся у детей, составляющая до 14% всех новообразований детского возраста [1]. Агрессивный характер роста опухоли и её резистентность к большинству современных химиопрепаратов — главные факторы, определяющие неблагоприятный прогноз заболевания. Выживаемость детей с тяжёлой формой нейробластомы составляет всего 34%, несмотря на применение агрессивных форм лечения [2].

Темозоломид (ТМЗ) — алкилирующий агент, представляющий собой липофильное пролекарство. Служит препаратом выбора для проведения химиотерапии пациентам с некоторыми типами злокачественных новообразований, например мультиформной глиобластомой, а также нейробластомой. Это обусловлено, в частности, способ­ностью препарата проходить через гематоэнцефалический барьер и индуцировать повреждения (алкилирование) молекул дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), в результате чего происходит образование одно- и двунитевых разрывов, приводящих в конечном счёте к запуску программы апоптоза и/или клеточного старения в опухолевых клетках [3].

Внедрение данного препарата в практическую онкологию позволило улучшить прогноз заболевания и повысить медиану выживаемости у пациентов с мультиформной глиобластомой. К примеру, было показано, что медиана выживаемости для пациентов, в отношении которых применяли лучевую терапию в сочетании с ТМЗ, составляла 15 мес, в то время как без лечения данный показатель обычно не превышает 5–6 мес [4, 5]. Аналогичным образом были получены данные, подтверждающие высокую эффективность использования ТМЗ у пациентов с рецидивирующими и рефрактерными формами нейробластом [6, 7].

Тем не менее, неоднородность ответа вышеуказанных злокачественных новообразований на воздействие данного алкилирующего агента, обусловленная отсутствием чётко обозначенных молекулярных диагностических маркёров, определяющих чувствительность/резистентность вышеназванных опухолей в ответ на проведение химиотерапии ТМЗ, продолжает оставаться актуальной проблемой как для экспериментальной, так и для практической онкологии.

В настоящее время существует несколько точек зрения о формировании молекулярных механизмов резистентности нейробластом к действию ТМЗ. Одним из наиболее общепризнанных является уровень экспрессии в опухоли фермента О6-метилгуанин-ДНК-метилтранферазы (MGMT), способной перемещать ТМЗ-индуцированный алкильный радикал с гуанина на остаток цистеина в своём активном центре, тем самым обеспечивая эффективную репарацию вышеуказанных повреждений ДНК [8]. Тем не менее, результаты исследований последних лет показали отсутствие выраженной корреляции между уровнем экспрессии MGMT в опухолевых клетках и их ответом на воздействие алкилирующих агентов, в частности ТМЗ [9].

Другой фактор, способный оказать влияние на формирование резистентности опухолевых клеток к ТМЗ, — функциональная активность системы репарации ошибочно спаренных нуклеотидов ДНК (MMR-mismatch repair), включающей целый спектр белков, в первую очередь MSH2 и MSH6. Данная система репарации повреждений ДНК имеет большое значение для поддержания контроля «правильности» процессов репликации ДНК и активации соответствующих сигнальных путей при повреждении ДНК. В исследованиях некоторых авторов была обнаружена корреляционная ­зависимость между нарушениями в данной системе репарации повреждений ДНК и повышением устойчивости клеток глио­бластом к воздействию ТМЗ [10].

Кроме того, важным диагностическим маркёром, способным, на наш взгляд, определять характер ответа опухолевых клеток на воздействие ТМЗ, служит функциональная активность гена-онкосупрессора ТР53. Белок р53, кодируемый одноимённым геном, является ключевым регулятором множества клеточных процессов, в числе которых апоптоз, активация так называемых «чек-пойнтов» и остановка клеток в одной из фаз клеточного цикла, клеточное старение [11]. К примеру, у пациентов с мультиформной глиобластомой мутации данного онкосупрессора бывают достаточно частой находкой и обнаруживаются более чем у трети пациентов [12], что, на наш взгляд, может являться фактором, определяющим гетерогенность ответа пациентов с данным заболеванием на проведение химиотерапии ТМЗ.

Целью нашего исследования было определение прогностической значимости уровней экспрессии и функционального состояния всех вышеуказанных факторов (МGMT, элементов системы MMR и функционального состояния белка р53) в ответе опухолевых клеток нейробластомы на воздействие алкилирующого агента ТМЗ.

Исследования проведены на клеточной линии SK.N.SH (ATCC, США). Клетки культивировали в стандартных условиях (37 °C и 5% СО2) в культуральной среде DMEM (ПанЭко) с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco) и антибиотиков пенициллина-стрептомицина (Sigma). Клетки подвергали воздействию алкилирующого агента ТМЗ (Sigma) в отдельности, а также в комбинации со специфическим ингибитором MGMT — О6-бензилгуанином (Sigma) и реактиватором р53 — нутлином-3а (Sigma) в концентрациях 30 и 10 мкМ соответственно.

Уровень экспрессии белков определяли методом вестерн-блоттинга. Клеточные экстракты получали посредством лизиса клеток в радиоиммунопреципитационном буфере с добавлением ингибиторов протеаз и фосфатаз. Образцы (30 мкг) разделяли в 7,5 и 12% полиакриламидных гелях и переносили на нитроцеллюлозную мембрану посредством влажного трансфера. Инкубацию с первичными моноклональными антителами к белку р53 (общей и фосфорилированной формах; Santa Cruz Biotechnology), MGMT (Abcam), MSH2, MSH6 и маркёру апоптоза (расщеплённой форме каспазы-3; Cell Signaling) проводили при 4 °C в течение 16 ч. Вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой (Santa Cruz Biotechnology), добавляли в концентрации 1:1000, после чего мембраны инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре и визуализировали с посредством хемилюминесценции (Vilber Lourmat).

Для оценки жизнеспособности клетки засевали в 96-луночный планшет в концентрации 3,2×104 в лунку и через 24 ч подвергали инкубации с вышеуказанными соединениями в отдельности, а также в комбинации с химиопрепаратом ТМЗ. Спустя 48–72 ч культивирования клеток ­проводили колориметрический MTS-тест с использованием реагента CellTiter 96® AQueous MTS Reagent Powder (Promega) на планшетном анализаторе Multiscan FC (Thermo Scientific).

Пролиферативную активность опухолевых клеток оценивали с помощью системы многопараметрического анализа клеточных культур RTCA iCELLigence (ACEA, Biosciences). Для этого клетки в концентрации 5×104 засевали в 8-луночные планшеты и подвергали дальнейшему анализу.

На начальном этапе нашего исследова­ния была проанализирована пролиферативная активность опухолевых клеток в условиях инкубации с вышеуказанными препаратами в отдельности, а также при их комбинированном использовании. Ожидаемо ТМЗ оказывал умеренный ­ингибирующий ­эффект в­ отношении роста опухолевых клеток (рис. 1). Примечательно, что ингибирование MGMT при помощи О6-бензилгуанина приводило к усилению эффекта ТМЗ, при этом сам O6-BG ингибирующего эффекта на пролиферативную активность опухолевых клеток не оказывал (см. рис. 1, А). Было обнаружено значительное подавление скорости пролиферации опухолевых клеток в условиях реактивации белка-онкосупрессора р53 с помощью нутлина-3а (см. рис. 1, Б).

Рис. 1. Пролиферативная активность клеток в условиях преинкубации в течение 2 ч с О6-бензилгуанином (О6BG; А) и нутилином (NTL; Б) и последующим добавлением темозоломида (TMZ) в концентрации 200 мкМ

Результаты колориметрического MTS-­теста подтвердили значительное усиление гибели клеток нейробластомы в условиях реактивации белка р53. Также было ­показано усиление цитотоксического эффекта ТМЗ в отношении клеток нейробластомы на фоне предварительного ингибирования активности MGMT в опухолевых клетках (рис. 2).

Рис. 2. Цитотоксичность алкилирующего агента темозоломида (TMZ) в отдельности и в сочетании с ингибитором О6-метилгуанин-ДНК-метилтранферазы (О6-бензилгуанином — O6BG) и реактиватором р53 (нутилином — NTL)

Следующим этапом исследования было изучение уровней экспрессии вышеуказанных факторов в опухолевых клетках. Результаты иммуноблоттинга выявили значительное увеличение уровня экспрессии общей формы белка р53, что коррелировало с уменьшением скорости пролиферации клеток (рис. 3). Экспрессия белков MGMT, MSH2 и MSH6, напротив, уменьшалась.

Рис. 3.Уровни экспрессии белка О6-метилгуанин-ДНК-метилтранферазы (MGMT), р53 и его фосфорилированной формы (pP53Ser15), белков системы MMR (MSH2 и MSH6), расщеплённой формы каспазы-3 (сl.casp3) в условиях инкубации с темозоломидом (TMZ), нутлином-3а (NTL), О6-бензилгуанином (O6BG), а также их комбинацией в течение 72 ч

Примечательно, что при воздействии химиопрепарата ТМЗ в отдельности и, особенно, на фоне комбинированного воздействия данного химиопрепарата и ингибитора MGMT происходила выраженная активация белка р53, о чём свидетельствовало повышение уровня экспрессии фосфорилированной формы данного белка. При этом различия в уровнях экспрессии выше­указанных факторов не были обусловлены различной «белковой нагрузкой» в исследуемых лизатах опухолевых клеток, что подтверждалось одинаковым уровнем экспрессии белка актина во всех исследованных образцах.

Важно отметить, что нами также было обнаружено значительное усиление гибели опухолевых клеток по механизму апо­птоза в условиях реактивации белка р53
и/или ингибирования MGMT при наличии повреждений ДНК, индуцированных ТМЗ. Об этом свидетельствовало усиление уровня экспрессии расщеплённой формы каспазы-3, служащей общепризнанным маркёром гибели клеток по механизму апоптоза. При этом максимальное усиление гибели клеток происходило в условиях комбинированного воздействия химиопрепарата и реактиватора белка р53 (см. рис. 3).

Полученные нами результаты свидетельствуют о высокой цитотоксической активности нутлина-3а в отношении опухолевых клеток нейробластомы линии SK.N.SH. Важно отметить, что цитотоксический эффект данного препарата был более выражен по сравнению с эффектом алкилирующего агента ТМЗ, рассматриваемого в настоящее время в качестве «золотого стандарта» при проведении химиотерапии больным с некоторыми типами злокачественных ново­образований нервной системы, в частности мультиформной глиобластомой. Более того, нами было обнаружено усиление гибели опухолевых клеток по механизму апоптоза в условиях комбинированного воздействия вышеуказанных препаратов.

Известно, что основным механизмом действия нутлина-3а является реактивация р53, что в условиях повреждений ДНК может приводить к остановке клеточного цикла в фазах G1 и G2. Это, по мнению некоторых авторов, может оказывать цитопротективное действие на нетрансформированные клетки при проведении химио- и радиотерапии [13–15]. При этом одним из механизмов, регулирующих продвижение клеток по фазам клеточного цикла, считается активация ингибитора пан-циклин-зависимой киназы р21 [16].

Кроме того, некоторыми исследователями в опухолевых клетках глиобластом при воздействии ТМЗ были обнаружены признаки активации программы клеточного старения, о чём, в частности, свидетельствовал высокий уровень экспрессии β-галактозидазы, служащей общепризнанным маркёром данного процесса. По мнению большинства исследователей, остановка клеточного цикла и реализация программы клеточного старения в условиях реактивации белка р53 являются наиболее вероятными по сравнению с запуском программы апоптоза [17–18].

Тем не менее, результаты наших исследований показывают отсутствие морфологических признаков, характерных для клеточного старения, в клетках, подвергнутых воздействию алкилирующего агента ТМЗ как в отдельности, так и в условиях реактивации белка р53. Более того, усиление уровня экспрессии расщеплённой формы каспазы-3 свидетельствует об обратном: запуск программируемой клеточной гибели является преобладающим процессом по сравнению с остановкой процессов клеточного деления и старения. Подобные различия могут быть обусловлены молекулярно-фенотипическими особенностями различных клеточных линий глио- и нейробластом, используемых различными исследовательскими группами.

В настоящем исследовании была использована клеточная линия SK.N.SH, которая имеет «дикий» тип р53 и MGMT, что, на наш взгляд, позволило наиболее корректно оценить влияние данных факторов в отношении чувствительности опухолевых клеток к алкилирующему соединению ТМЗ.

Таким образом, в результате прове­дённых исследований были ­получены данные о том, что опухолевые клетки ­нейробластомы линии SK.N.SH в малой степени чувствительны к воздействию ТМЗ. При этом преинкубация клеток со специфическим ингибитором белка MGMT приводила к усилению эффекта химиопрепарата. Важно отметить, что наиболее выраженное подавление роста опухолевых клеток происходило в условиях реактивации белка р53, при которых клетки практически теряли свою пролиферативную активность. Нами также было отмечено значительное снижение уровня экспрессии белка МGMT в данных экспериментальных условиях, что может свидетельствовать об отрицательной обратной связи между данными факторами.

Вывод

Основным выводом, полученным в результате проведённых исследований, следует считать получение доказательств о преобладающей роли оценки функционального статуса белка р53 в качестве предиктора ответа опухолевых клеток нейробластом на воздействие алкилирующего агента темозоломида. В свою очередь уровень экспрессии и функциональную активность фермента О6-метилгуанин-­ДНК-метилтранферазы следует расценивать как менее значимые параметры для оценки восприимчивости нейробластом к действию темозоломида.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

Исследования выполнены при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда (РНФ) №14-15-00342.

About the authors

R R Khusnutdinov

Author for correspondence.
Email: boichuksergei@mail.ru
Kazan, Russia

S V Boychuk

Email: boichuksergei@mail.ru
Kazan, Russia

References

Supplementary files