Morphological characteristics of experimental ischemic wound healing after application of autoand hetero-fibroblasts and dermal equivalent

Full Text

Длительно существующий дефект кожного покрова остаётся актуальной сов­ременной проблемой отечественной и мировой хирургии [1]. Причины утраты кожного покрова бывают разные: нарушение кровоснабжения и иннервации кожи, травмы, в том числе огнестрельные, местное воздействие высоких и низких температур [2], ионизирующего излучения и др. Проблема восстановления кожного покрова не решена, хотя предложено и применяется множество способов: от медикаментозных методов до хирургического пластического закрытия раны [3].

В настоящее время мировые достижения молекулярно-клеточной биологии создали основу для применения клеточных технологий при лечении длительно существующих раневых дефектов [4]. Используют введение в рану аутологических и гетерологических фибробластов, что значительно укорачивает сроки заживления [5, 6]. Несмотря на существующие работы на эту тему [7, 8], перестройки компонентов тканей раны в разные сроки заживления остаются изученными мало.

Цель исследования — изучить морфологическое строение, коллагенообразование и ангиогенез в биоптатах новообразованного эпидермиса и дермы на 19-е сутки их восстановления в экспериментальной ишемизированной ране после введения ауто- и гетерофибробластов, а также после ­трансплантации дермального эквивалента с гетерофибробластами.

Исследование выполнено на 28 белых половозрелых мышах линии С57/В1 в возрасте до 1 года, которые содержались в виварии Медицинской академии им. С.И. Георгиевского. Животные были разделены на контрольную группу в составе 7 особей и три экспериментальные группы по 7 особей в каждой. Эксперименты проводили со следованием всем принципам гуманности, содержащимся в директиве Европейского сообщества (86/609/ЕС), и в соответствии с «Правилами выполнения работ с привлечением экспериментальных животных».

Во всех группах операцию по моделированию кожной раны в лопаточной области производили после внутрибрюшинного введения 2,5% раствора авертина в количестве 0,3–0,4 мл. Кожу однотипно иссекали в виде круга диаметром 12 мм, к краям раны кожно-фасциальными узловыми швами фиксировали силиконовое кольцо с наружным диаметром 12 мм атравматичным шовным материалом «Полипропилен» 5-0 для исключения возможности эпителизации раны и закрытия её мобильной кожей облас­ти спины [9].

Ишемизацию раны проводили путём наложения кисетного шва нитью «Полипропилен» 5-0 на расстоянии 1,0 см латеральнее наружного диаметра раны, что нарушает циркуляцию крови в системе около лопаточных артерий мыши. Артериальный анастомоз вокруг лопаток образован ветвью подмышечной артерии a. circularisscapula и ветвью поперечной артерии шеи a. ramusdescendense, отходящей от подключичного truncus thiriocervicales.

Из иссечённой кожи мышей выделяли фибробласты в условиях стерильного бокса с ламинарным потоком воздуха. Кусочки кожи после ферментативного удаления эпидермиса помещали в среду DMEM F12 (Lonza) и измельчали сосудистыми ножницами до размера 1–2 мм. Затем к кусочкам ткани добавляли равные объёмы растворов коллагеназы I типа (200 ЕД/мл, Sigma) и диспазы (30 ЕД/мл, Gibco). Полученную смесь инкубировали в течение 1 ч при 37 °C и постоянном перемешивании.

После фильтрации суспензии через фильтр диаметром 0,40 мкм и центрифугирования в течение 7 мин при 1000 об./мин фибробласты ресуспендировали и культивировали в среде DMEM F12 (Lonza) с добавлением 10% телячьей сыворотки (HyClone) и 50 ЕД/мл пенициллина-стрептомицина (ПанЭко) в чашках Петри в инкубаторе при температуре 37 °C и концентрации СО2 5% до достижения 100% конфлюента. Для пересева клеток использовали 0,25% трипсин с 0,02% этилендиаминтетрауксусной кислотой.

В первой и второй экспериментальных группах интраоперационно в дно раны и вокруг неё вводили 0,4 мл взвеси фибро­бластов 1-го или 2-го пассажа в ростовой среде DMEM F12 (Lonza) в количестве 1,33 млн клеток. В первой экспериментальной группе вводили гетерофибробласты, во второй — аутофибробласты.

В третьей экспериментальной ­группе в рану трансплантировали дермальный эквивалент с гетерофибробластами, приготовленный на основе коллагена I типа из крысиных хвостов. Стерильный 0,34 М раствор NaOH объединяли с концентрированной (×10) питательной средой 199 в соотношении 1:1. Полученную смесь соединяли с охлаждённым раствором коллагена, после чего добавляли суспензию фибро­бластов в питательной среде DMEM F12, содержащей 10% эмбриональной сыворотки (HyClone). Полученную смесь инкубировали при 37 °C в инкубаторе до полной полимеризации геля [10].

На 19-й день после операции у мышей всех групп интраоперационно иссекали образовавшийся биоптат и фиксировали 10% забуференным формалином для морфологического исследования. Материал заливали в парафин и окрашивали гематоксилином и эозином, а также по Вейгерту–Ван-Гизону для визуализации эластических и коллагеновых волокон.

Морфологическое исследование гистологических препаратов проводили с помощью светооптического микроскопа OLIMPUS СХ-31 с цифровой камерой OLIMPUS 35050Z. Толщину эпидермиса, количество микрососудов в срезах, площадь коллагеновых волокон и микрососудов в дерме биоптатов измеряли с помощью программы «ImageJ» при увеличении объектива 40 и окуляра 10 по 50 замеров в каждой группе. Полученные цифровые данные (выраженные в пикселах) были переведены в микрометры при помощи деления количества пикселов на коэффициенты, специально для этого выведенные: объективы ×10 — 6379251, ×40 — 98911797.

Статистическую обработку ­цифровых данных проводили с использованием лицензионного программного обеспечения Microsoft Office Excell и Statistica 10.0. Сравнение средней толщины эпидермиса, площади, занимаемой коллагеновыми волокнами и сосудами грануляционной ткани, в биоптатах экспериментальных групп проводили в процентах по отношению к контрольной группе.

В ходе заживления экспериментальной раны происходило самопроизвольное отпадение силиконового кольца за счёт постепенной эпителизации раны от краёв к центру и прорезывания удерживающих кольцо швов, что расценивалось как важный признак активности регенеративных процессов. У мышей контрольной группы отпадение силиконового кольца было зафиксировано в среднем на 12,4±0,10 сутки после операции по созданию экспериментальной раны. Под толстыми остатками струпа обнаруживалась полная эпителизация раны.

 

Рис. 1. Биоптаты кожи мыши. Контрольная группа. Окраска гематоксилином и эозином. 1 — эпидермис; 2 — кровеносный сосуд; 3 — остатки шовного материала; 4 — лейкоцитарная инфильтрация; 5 — коллагеновые волокна. Увеличение: окуляр ×10, объектив ×20

 

На 19-е сутки после моделирования раны эпидермис биоптата образован многослойным эпителием толщиной 55,24±0,11 мкм (табл. 1). Видны базальный слой, несколько рядов шиповатых клеток и фрагментарно просматривается зернистый слой. Роговой слой тонкий и находится на начальных стадиях дифференцировки клеток (рис. 1). На срезах просматриваются остатки шовного материала удерживавшего силиконовое кольцо. Они осумковываются эпидермоцитами с лейкоцитарной инфильтрацией вокруг.

 

Таблица 1. Количественные характеристики биоптатов кожи мышей контрольной и экспериментальных групп

Биоптаты кожи	Толщина эпидермиса, мкм	Площадь дермы на срезах, мкм	Площадь сосудов в дерме, %	Площадь коллагеновых волокон в дерме, %
Биоптаты кожи в контрольной группе	55,24±0,11	68 567,77±2,16	1,02±0,01	33,76±0,22
Биоптаты кожи в первой экспериментальной группе	64,29±0,20	47 825,70±1,45	1,19±0,03	55,44±0,17
Биоптаты кожи во второй экспериментальной группе	111,62±0,35	58 820,47±2,15	1,80±0,02	63,14±0,12
Биоптаты кожи в третьей экспериментальной группе	102,74±1,13	54 128,58±2,09	1,68±0,01	60,15±0,37

 

Под эпидермисом расположена грануляционная ткань, выполняющая полость раны. Граница между эпидермисом и будущей дермой чёткая за счёт формирования базальной мембраны и волнистая. Полноценные сосочки не сформированы. Грануляционная ткань образована переплетающимися коллагеновыми волокнами без чёткой ориентации, между которыми присутствуют клетки, представленные пре­имущественно функционально активными фибробластами. Коллагеновые волокна занимают 33,76±0,22% площади дермы.

Эластические волокна отсутствуют. Немногочисленные кровеносные капилляры и венулы расширены, их площадь составляет 1,02±0,01% площади дермы. Имеются вертикально расположенные капилляры различного диаметра. Стенка сосудов состоит из одного ряда эндотелиальных клеток.

У мышей первой ­экспериментальной группы эпителизация раны и отпадение силиконового кольца зафиксированы на 1 день раньше, чем в контроле, а именно на 11,4±0,06 сутки после операции и введения взвеси гетерофибробластов на ростовой среде ДМЕМ F12. При этом толщина эпидермиса была на 14,08% больше, чем в группе контроля, и составляла 64,29±0,20 мкм. Эпидермис сформирован и состоит из четырёх слоёв: базального, шиповатого, зернистого и рогового. Зернистый слой просматривается участками (рис. 2, А). Базальная мембрана ровная, лейкоцитарная инфильтрация отсутствует. Грануляционная ткань под эпидермисом представлена тонкими пучками неориентированных коллагеновых волокон, кровеносными сосудами и клеточными элементами. Коллагеновые волокна занимают в среднем 55,44±0,17% площади дермы, что на 39,11% больше, чем в контрольной группе. Элас­тические волокна отсутствуют во всех участках дермы. Площадь кровеносных капилляров больше на 14,29% по сравнению с группой контроля.

У мышей второй экспериментальной группы на фоне введения взвеси аутофибробластов в ростовой среде ДМЕМ F12 эпителизация раны и отпадение силиконового кольца зафиксированы ещё раньше, чем в контроле и первой экспериментальной группе, — на 11,00±0,01 день после операции. На 19-е сутки регенераторного гистогенеза устранение тканевого дефекта кожи наиболее значительно продвинулось. Толщина эпидермиса зафиксирована на 50,52% больше, чем в контрольной группе. Значительно более дифференцированными были слои эпидермиса. На поверхности заметен выраженный роговой слой (рис. 2, Б). Эпидермис вдаётся в подлежащую грануляционную ткань, формируя сосочки и закладки волос.

 

Рис. 2. Биоптаты кожи мыши. А — первая экспериментальная группа; Б — вторая экспериментальная группа; 1 — эпидермис; 2 — кровеносный сосуд; 3 — сосочки; 4 — фибробласты; 5 — коллагеновые волокна. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение: окуляр ×10, объектив ×20

 

Рис. 3. Биоптаты кожи мыши. А — вторая экспериментальная группа, окраска по Вейгерту–Ван-Гизону; Б — третья экспериментальная группа, окраска гематоксилином и эозином; 1 — эпидермис; 2 — кровеносный сосуд; 3 — сосочки; 4 — волосяной фолликул; 5 — коллагеновые волокна. Увеличение: окуляр ×10, объектив ×20

 

Грануляционная ткань характеризуется во второй группе мощным усилением процессов ангиогенеза и коллагенообразования. Коллагеновые волокна приобрели некоторую регулярную ориентацию параллельную эпидермису, особенно заметную в глубоких слоях (рис. 3, А). Площадь, занятая коллагеновыми волокнами, увеличилась на 46,53% по сравнению с контролем и составила 63,14±0,12% площади грануляционной ткани, а сосудов — на 43,33% и составила 1,73±0,01% (см. табл. 1). Лейкоцитарная инфильтрация отсутствовала. Клеточные элементы фибробластического ряда были представлены крупными и вытянутыми отростчатыми клетками, что свидетельствовало об их функциональной активности. Эластические волокна отсутствовали во всех участках дермы.

У мышей третьей ­экспериментальной группы отпадение силиконового кольца фиксировалось на 12,20±0,11 день после операции. На 19-й день после трансплантации дермального эквивалента с гетерофибробластами рана была покрыта толстым пластом эпидермиса. Эпидермис выглядел более дифференцированным, чем в предыдущих группах. Присутствовали и были хорошо развиты все слои эпидермиса, в том числе и зернистый слой. Толщина эпидермиса составляла 102,74±1,13 мкм, что на 43,87% больше, чем в группе контроля. Эпидермис образовывал выросты в подлежащую грануляционную ткань, являющиеся закладкой волос и сосочкового слоя дермы (рис. 3, Б). В грануляционной ткани дермы видны сформированные закладки волос. Площадь, занятая коллагеновыми волокнами, увеличилась на 43,87% по сравнению с группой контроля и составила 60,15±0,37%, а сосудов — на 39,29% и составила 1,68±0,01% площади грануляционной ткани (см. табл. 1). Тонкие слабо ориентированные пучки коллагеновых волокон заполняли всю дерму биоптата.

Выводы

1. На 19-й день заживления ишемизированной раны кожи раневой процесс находится в процессе перехода от стадии пролиферации с образованием грануляционной ткани в стадию дифференцировки или фиброзирования.

2. Наиболее существенно на регенераторный гистогенез влияет введение аутофибробластов, когда фиксируется наибольшая толщина эпидермиса, наиболее активны ангиогенез и коллагенообразование.

3. Самым дифференцированным эпидермис становится после трансплантации в рану дермального эквивалента с гетерофибробластами за счёт наличия закладок волос в виде сформированных волосяных фолликулов.

4. Благоприятное воздействие дермального эквивалента с гетерофибро­бластами отличается от воздействия взвеси ­аутофибробластов всего на несколько процентов: толщина эпидермиса — на 4,29%, площадь коллагеновых волокон — на 2,66%, площадь кровеносных сосудов — на 4,04%, что делает такие различия недостоверными.

 

Работа поддержана проектом «Сеть академической мобильности “РНИЭМ”» ФГАОУ ВО «КФУ им. В.И. Вернадского» и выполнена с использованием инфраструктуры НУЗ НКЦ ОАО «РЖД» (г. Москва) и ФГБУН «Институт цитологии РАН» (г. Санкт-Петербург).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов по представленной статье.

About the authors

E Yu Shapovalova

Medical Academy named after S.I. Georgievsky, V.I. Vernadsky Crimean Federal University

Author for correspondence.
Email: Shapovalova_L@mail.ru
Simferopol, Russia

T A Boyko

Medical Academy named after S.I. Georgievsky, V.I. Vernadsky Crimean Federal University

Email: Shapovalova_L@mail.ru
Simferopol, Russia

Yu G Baranovskiy

Medical Academy named after S.I. Georgievsky, V.I. Vernadsky Crimean Federal University

Email: Shapovalova_L@mail.ru
Simferopol, Russia

I A Lugin

Medical Academy named after S.I. Georgievsky, V.I. Vernadsky Crimean Federal University

Email: Shapovalova_L@mail.ru
Simferopol, Russia

References

Supplementary files