Effects of heterogeneous collagen-based formulation on growth and metastasis of B16-F1 melanoma in mice: an experimental, cohort, controlled study

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Меланома кожи остаётся одной из наиболее актуальных проблем современной онкологии, что подтверждается глобальной статистикой. Так, по данным Всемирной организации здравоохранения, в 2022 г. в мире было зарегистрировано свыше 330 тыс. новых случаев этого заболевания [1]. Статистика по Российской Федерации за 2023 г. так же отражает серьёзность ситуации: было диагностировано 11 923 новых случая [2].

Особую сложность представляет меланома кожи головы и шеи. Данная локализация встречается, по разным оценкам, у 20–46% пациентов и требует особого подхода из-за высокой эстетической и функциональной значимости этой анатомической области [3, 4]. Золотым стандартом лечения меланомы кожи в том числе кожи век, является хирургическое иссечение опухоли. Основные методики — широкое иссечение и микрографическая хирургия по Мосу (Mohs) — направлены на достижение радикальности вмешательства, но часто приводят к образованию обширных тканевых дефектов [5, 6].

Существующие методы реконструкции, такие как аутодермопластика расщепленным трансплантатом, пластика местными или свободными микрохирургическими лоскутами, имеют ряд ограничений. Они могут быть технически сложными, сопряжёнными с риском осложнений, требовать дополнительных разрезов в донорских зонах и не всегда позволяют достичь оптимального эстетического результата. В итоге многие пациенты сталкиваются с проблемой остаточных пострезекционных дефектов, вызывающих психологический дискомфорт и снижающих качество жизни, и, нередко, создающих угрозу снижения зрительных функций [7, 8].

В поиске малоинвазивных методов коррекции таких дефектов наше внимание привлекли инъекционные коллагенсодержащие материалы, в частности, гетерогенная коллагенсодержащая композиция (ГКСК). Данные материалы зарекомендовали себя как биосовместимые и биодеградируемые, что подтверждено в доклинических исследованиях [9, 10]. Они находят применение в челюстно-лицевой хирургии, стоматологии и косметологии для регенерации мягких тканей и коррекции костных структур, а также используются для коррекции возрастных изменений [11–13].

Несмотря на изученные свойства ГКСК, вопрос их онкологической безопасности при введении в зону, где ранее была удалена меланома, остаётся открытым. Отсутствие данных в научной литературе по этой теме определило актуальность оценки онкологической безопасности применения коллагенсодержащих материалов для коррекции пострезекционных дефектов мягких тканей и век.

Цель исследования

Оценить взаимодействие и влияние ГКСК на меланому кожи B16-F1 в эксперименте.

МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Проведено контролируемое нерандомизированное открытое экспериментальное исследование на животных (in vivo).

Условия проведения исследования

В работе использовали иммунокомпетентных самок мышей линии C57Bl/6 категории SPF (Specific Pathogen Free) с перевитой меланомой B16-F1. Животные были получены из питомника «Пущино» — филиала ФГБУН «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН.

Исследование проводили в виварии Московского научно-исследовательского онкологического института им. П.А. Герцена в соответствии с ГОСТ Р 56701–2015 «Лекарственные средства для медицинского применения…», Директивой Европейского парламента 2010/63/ЕС «О защите животных, использующихся для научных целей» и Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств¹ [16]. Все эксперименты на животных выполняли с соблюдением принципов гуманности согласно заключению комиссии по биоэтическому контролю ФГБУ «НМИЦ радиологии» (протокол № 2-ДИ-00057).

Период проведения исследования: июнь 2024 г. – август 2024 г.

Мышей содержали в условиях вивария при постоянном температурном режиме (24°C), относительной влажности воздуха 50–60% и свободном доступе к воде и стандартному корму.

Описание вмешательства

В качестве исследуемого материала использовали ГКСК Сферо^®гель (регистрационное удостоверение № ФСР 2012/13033). Применяли две формы геля: «Long» с размером микрочастиц сшитого коллагена 150–300 мкм и «Medium» с размером микрочастиц 70–150 мкм.

Животные были разделены на 8 экспериментальных групп в зависимости от наличия хирургического вмешательства и варианта вводимого вещества (табл. 1).

 

Таблица 1. Распределение групп экспериментальных животных (мыши) в эксперименте с меланомой B16-F1 Table 1. Groups of experimental animals (mice) in the B16-F1 melanoma experiment
Номер группы	Количество животных в группах	Вариант вводимого вещества	Однократная доза / суммарная доза	Кратность введения
Группы без хирургического вмешательства
1	8	Гель «Medium»	0,3 мл / 0,3 мл	1
2	8		0,1 мл / 0,3 мл	3
3	8	Гель «Long»	0,3 мл / 0,3 мл	1
4	8		0,1 мл / 0,3 мл	3
5	10	0,9% NaCl	0,3 мл / 0,3 мл	1
Группы с хирургическим вмешательством
6	8	Гель «Medium»	0,3 мл / 0,3 мл	1
7	8	Гель «Long»	0,3 мл / 0,3 мл	1
8	8	0,9% NaCl	0,3 мл / 0,3 мл	1

 

Культивирование клеток и инокуляция опухоли

Клеточную линию меланомы мыши B16-F1 культивировали в среде DMEM (Gibco, США) в CO₂-инкубаторе при 37°C и 5% CO₂. После достижения 75–80% конфлюентности клетки снимали с поверхности флаконов раствором Версена. Прививочная доза составляла 1,0×10⁶ клеток в 0,1 мл суспензии. В день 0 эксперимента суспензию инокулировали подкожно в правую боковую поверхность туловища каждой мыши.

С 1-го дня после инокуляции проводили ежедневный осмотр животных. В группах с хирургическим вмешательством (группы 6–8) при достижении опухолью объёма 100±20 мм³ (на 5–8-е сутки) проводили резекцию примерно половины первичного узла. Рядом с оставшейся частью опухоли формировали подкожный паратуморальный карман, в который однократно вводили 0,3 мл соответствующего геля или 0,9% раствора натрия хлорида.

В группах без хирургического вмешательства (группы 1–5) гель или 0,9% раствор натрия хлорида вводили подкожно паратуморально. Введение осуществляли либо однократно в дозе 0,3 мл, либо трёхкратно через день в дозе 0,1 мл.

Наблюдение за животными продолжали до гибели первого животного, после чего остальные лабораторные мыши подвергали эвтаназии. Гибель началась на 20-е сутки.

Исходы исследования

Основной исход исследования

Динамика роста первичной опухоли (объём, время удвоения) и частота метастазирования в регионарные лимфатические узлы и лёгкие.

Дополнительные исходы исследования

Итоговая масса опухолевого узла; гистологическая структура опухоли и окружающих тканей.

Методы регистрации исходов

Объём опухолей измеряли каждые 4 дня цифровым штангенциркулем и рассчитывали по формуле для эллипсоида: V=ab×2×0,52, где a и b — наибольший и наименьший перпендикулярные диаметры опухоли.

После эвтаназии лабораторных животных в CO₂-камере, проводили аутопсию с забором первичных опухолей, регионарных лимфатических узлов и лёгких. Биологический материал фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине, проводили стандартную гистологическую обработку и заключали в парафин. Срезы толщиной 4–5 мкм, полученные на ротационном микротоме (Leica RM 2125 RTS, Германия), окрашивали гематоксилином и эозином. Микроскопическое исследование проводили на световом микроскопе (BX 51, Olympus, Япония) для оценки типа опухолевого роста, наличия метастазов и морфологических изменений, связанных с введением ГКСК.

Статистические процедуры

Запланированный размер выборки

Расчёт размера выборки предварительно не проводили.

Статистические методы

Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения Statistica 7.0, статистическую значимость различий между группами оценивали с помощью методов параметрической (t-критерий Стьюдента) статистики. Рассчитывались торможение роста опухоли и торможение метастазирования. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимали p <0,005.

Торможение роста опухоли (ТРО). Рассчитывали на конечном этапе по формуле: ТРО=[(V_к–V_оп)/V_к]×100%, где V_оп и V_к — средний объём опухоли в опытной и контрольной группах соответственно.

Торможение метастазирования (ТМ). Оценивали по массе метастазов и рассчитывали по формуле: ТМ=[M_к–М_оп]/М_к×100%, где М_оп и M_к — средняя масса метастазов на одну мышь в опытной и контрольной группах.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Формирование выборки

Последовательность формирования выборки представлена в графическом варианте (рис. 1).

 

Рис. 1. Последовательность формирования выборки исследования.

Fig. 1. Study sampling sequence.

 

Характеристики выборки

Исходно все животные были сопоставимы по массе тела и общему состоянию.

Основные результаты исследования

Были проанализированы следующие параметры: размер (объём) и масса опухолевых узлов, наличие метастазов в лёгких и лимфатических узлах, а также морфологические изменения в окружающих тканях.

Измерение размеров и массы опухоли

При анализе динамики роста опухолевых узлов меланомы B16-F1 не было выявлено статистически значимых различий в объёме и итоговой массе опухолей между опытными группами, получавшими ГКСК в двух формах, и контрольной группой, получавшей 0,9% раствор натрия хлорида (p >0,05) (рис. 2). Расчёт показателя «торможение роста опухоли» также подтвердил отсутствие значимого влияния ГКСК на рост первичного очага (табл. 2). Полученные данные свидетельствуют, что в рамках данной экспериментальной модели ГКСК не стимулируют и не угнетают рост первичной опухоли.

 

Рис. 2. Динамика роста первичной опухоли; a — в группах без хирургического вмешательства; b — в группах с хирургическим вмешательством.

Fig. 2. Primary tumor growth pattern; a, in groups without surgical intervention; b, in groups with surgical intervention

 

Таблица 2. Расчёт торможения роста опухоли в различных группах (в процентах) в день вывода из эксперимента Table 2. Calculation of tumor growth inhibition (%) in different groups on the sacrificing day
Показатель	Номер группы
	без хирургического вмешательства					с хирургическим вмешательством
	1	2	3	4	5	6	7	8
Торможение роста опухоли, %	9	8	8	4	–	3	3	–
Примечание. Различия между опытными и контрольными группами по всем показателям незначимы, p >0,05. Note. Differences between the experimental and control groups across all parameters are not significant, p > 0.05.

 

Гистологические исследования

Морфологическое исследование опухолевых узлов во всех группах выявило картину плотных новообразований с выраженным инвазивным ростом и обширными полями спонтанного некроза в центральных отделах (рис. 3, а, b). Статистически значимых различий в гистологическом строении опухолей между опытными и контрольными группами не обнаружено.

 

Рис. 3. Морфологическая картина первичной опухоли меланомы кожи B16-F1 при введении 0,9% NaCl: a — в группе без хирургического вмешательства; b — в группе с хирургическим вмешательством. Окрашивание гематоксилином и эозином.

Fig. 3. Primary B16-F1 melanoma morphology after 0.9% NaCl administration: a, unoperated group; b, surgery group. Hematoxylin-eosin staining.

 

В образцах тканей из групп без хирургического вмешательства были обнаружены остаточные фрагменты геля, окружённые сформированной соединительнотканной капсулой, что указывает на процесс инкапсуляции материала (рис. 4, а). В то же время в группах, где проводилось хирургическое вмешательство, введённый коллагеновый материал при гистологическом исследовании не визуализировался (рис. 4, b).

 

Рис. 4. Морфологическая картина первичного опухолевого узла меланомы кожи при введении гетерогенной коллагенсодержащей композиции: a — в группе без хирургического вмешательства; b — в группе с хирургическим вмешательством. Окрашивание гематоксилином и эозином.

Fig. 4. Primary melanoma nodule morphology after administration of heterogeneous collagen-based formulation: a, unoperated group; b, surgery group. Hematoxylin-eosin staining.

 

Оценка метастазирования

В ходе эксперимента метастатического поражения регионарных лимфатических узлов и лёгких не было обнаружено ни в одной из исследуемых групп, включая контрольную. Это указывает на то, что ГКСК не оказывает влияния на диссеминацию клеток меланомы B16-F1.

Нежелательные явления

В ходе проведения исследования нежелательных явлений, связанных с введением исследуемых материалов, у лабораторных животных зарегистрировано не было.

ОБСУЖДЕНИЕ

Интерпретация результатов исследования

Проведена оценка онкологической безопасности ГКСК на агрессивной модели меланомы мыши B16-F1. Основной задачей было определить, влияет ли материал на рост первичной опухоли и процесс метастазирования, что является ключевым вопросом для его потенциального применения в реконструктивной хирургии у онкологических пациентов.

Полученные данные показали, что ГКСК обеих фракций (Long и Medium) являются онкологически нейтральными по отношению к росту первичного узла меланомы B16-F1. Отсутствие как стимуляции, так и ингибирования роста опухоли — ключевой показатель безопасности имплантата. Кроме того, материал не способствовал развитию метастазов, что подтверждает его безопасность в контексте опухолевой диссеминации.

Интересным наблюдением стало отсутствие видимых остатков геля в группах с хирургическим вмешательством. Это может свидетельствовать об ускоренной биодеградации или иной реакции тканей на материал в условиях постоперационных репаративных процессов, что требует отдельного изучения. В целом, результаты свидетельствуют об онкологической безопасности ГКСК в рамках исследованной модели.

Ограничения исследования

• Ограничения, связанные с моделью. Исследование проводилось на перевиваемой линии меланомы мыши B16-F1, которая может не полностью отражать биологические особенности и гетерогенность меланомы человека.
• Краткосрочный период наблюдения. Наблюдение за животными продолжалось 20 дней, что не позволяет сделать выводы о долгосрочных эффектах ГКСК и риске отсроченного метастазирования.
• Небольшой размер выборки. Относительно небольшое количество животных в группах (n=8–10) могло повлиять на статистическую достоверность исследования для выявления малых, но потенциально значимых различий.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Экспериментальное исследование было направлено на оценку онкологической безопасности ГКСК при её потенциальном использовании для коррекции пострезекционных дефектов. На модели меланомы B16-F1 было установлено, что ГКСК не оказывает статистически значимого влияния на динамику роста, объём и массу первичного опухолевого узла. Применение материала, в том числе после моделирования хирургического вмешательства, не стимулировало процесс метастазирования в регионарные лимфатические узлы и лёгкие и не вызывало патологических изменений в морфологической структуре опухолевой ткани. Полученные результаты свидетельствуют об онкологической инертности ГКСК в рамках исследованной модели, что позволяет рассматривать данный материал как потенциально безопасный для дальнейшего изучения и применения в реконструктивной хирургии у онкологических пациентов.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Д.В. Давыдов — определение концепции; М.О. Карпечкин — проведение исследования, работа с данными, анализ данных, написание черновика рукописи; Н.Б. Морозова — определение концепции, работа с данными, анализ данных, проведение исследования; В.А. Хохлова — проведение исследования; Н.В. Перова — обеспечение исследования; А.О. Немечкина — написание черновика рукописи. Все авторы одобрили рукопись (версию для публикации), а также согласились нести ответственность за все аспекты настоящей работы, гарантируют надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой её части.

Этическая экспертиза. Исследование одобрено комиссией по биоэтическому контролю ФГБУ «НМИЦ радиологии» (протокол № 2-ДИ-00057 от 28.03.2024). Исследование и его протокол не регистрировали.

Источники финансирования. Отсутствуют.

Раскрытие интересов. Авторы заявляют об отсутствии отношений, деятельности и интересов за последние три года, связанных с третьими лицами (коммерческими и некоммерческими организациями), интересы которых могут быть затронуты содержанием статьи.

Оригинальность. При проведении исследования и создании настоящей статьи авторы не использовали ранее полученные и опубликованные сведения (данные, текст, иллюстрации).

Доступ к данным. Все данные, полученные в настоящем исследовании, представлены в статье.

Генеративный искусственный интеллект. При создании настоящей статьи технологии генеративного искусственного интеллекта не использовали.

Рассмотрение и рецензирование. Настоящая работа подана в журнал в инициативном порядке и рассмотрена по обычной процедуре. В рецензировании участвовали один внешний рецензент, член редакционной коллегии и научный редактор издания.

ADDITIONAL INFO

Author contributions: D.V. Davydov: conceptualization; M.O. Karpechkin: investigation, data curation, formal analysis, writing—original draft; N.B. Morozova: conceptualization, data curation, formal analysis, investigation; V.A. Khokhlova: investigation; N.V. Perova: resources; A.O. Nemechkina: writing—original draft. All the authors approved the version of the manuscript to be published and agreed to be accountable for all aspects of the work, ensuring that questions related to the accuracy or integrity of any part of the work are appropriately investigated and resolved.

Ethics approval: The study was approved by an on bioethical control of the National Medical Research Radiological Center (protocol No. 2-ДИ-00057 от March 28 2024). The study and its protocol were not registered.

Funding sources: No funding.

Disclosure of interests: The authors have no relationships, activities, or interests for the last three years related to for-profit or not-for-profit third parties whose interests may be affected by the content of the article.

Statement of originality: No previously obtained or published material (text, images, or data) was used in this study or article.

Data availability statement: All data obtained in this study are available in this article.

Generative AI: No generative artificial intelligence technologies were used to prepare this article.

Provenance and peer-review: This paper was submitted unsolicited and reviewed following the standard procedure. The peer review process involved one external reviewer, a member of the Editorial Board, and the in-house science editor.

 

¹  ГОСТ Р 56701–2015. Лекарственные средства для медицинского применения. Руководство по планированию доклинических исследований безопасности с целью последующего проведения клинических исследований и регистрации лекарственных средств. Москва. 2015; Директива Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22 сентября 2010 г. № 2010/63/ЕС «О защите животных, использующихся для научных целей» // Официальный журнал Европейского Союза. 2010. L 276.

About the authors

Dmitry V. Davydov

National Medical Research Radiological Center

Email: d-davydov3@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-5506-6021
SPIN-code: 1368-2453

MD, Dr. Sci. (Medicine), Professor; P. Hertsen Moscow Oncology Research Institute

Russian Federation, Moscow

Maksim O. Karpechkin

National Medical Research Radiological Center

Author for correspondence.
Email: maxim.karpechkin@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8817-2736
SPIN-code: 9058-4420

P. Hertsen Moscow Oncology Research Institute

Russian Federation, Moscow

Natalya B. Morozova

National Medical Research Radiological Center

Email: maxim.karpechkin@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7159-805X
SPIN-code: 1286-6518

MD, Cand. Sci. (Biology); P. Hertsen Moscow Oncology Research Institute

Russian Federation, Moscow

Varvara A. Khokhlova

National Medical Research Radiological Center

Email: nostocus@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-0339-2068
SPIN-code: 9647-7576

P. Hertsen Moscow Oncology Research Institute

Russian Federation, Moscow

Nadezhda V. Perova

Biomir-Service

Email: maxim.karpechkin@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2215-8944
SPIN-code: 7121-0988

MD, Dr. Sci. (Biology)

Russian Federation, Krasnoznamensk

Anna O. Nemechkina

National Medical Research Radiological Center

Email: maxim.karpechkin@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0006-0382-5675
SPIN-code: 9387-5218

P. Hertsen Moscow Oncology Research Institute

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files