Comparison of topical antifungal agents in the treatment of fungal keratitis: an experimental study

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Среди инфекционных поражений роговицы грибковый кератит характеризуется тяжёлым и резистентным течением, даже при условии грамотной противогрибковой терапии. Начиная с 50-х годов ХХ века, отмечают устойчивую тенденцию к увеличению числа случаев, в особенности в последние десятилетия [1, 2].

В отличие от бактериальных и вирусных кератитов, для лечения которых доступны определённые местные лекарственные препараты, терапия грибковых инфекций существенно затруднена вследствие практически полного отсутствия одобренных специализированных местных противогрибковых препаратов в большинстве стран, включая Россию [3].

Именно поэтому чаще всего специалисты вынуждены использовать лекарственные средства, не предназначенные для местного применения в офтальмологии, представляющие лиофилизат для приготовления раствора для внутривенного введения. Одними из наиболее часто применяемых классов противогрибковых препаратов в офтальмологии являются средства из группы полиенов, в частности амфотерицин В и натамицин [4].

Амфотерицин В, несмотря на свою токсичность, долгое время остаётся препаратом выбора, что обусловлено его широким спектром действия и доступностью, в свою очередь, местная форма натамицина в большинстве стран остаётся недоступной.

Препараты из группы азолов отличаются широким спектром активности и вызывают меньше побочных эффектов, чем полиены [5]. К классу азолов относят вориконазол, который демонстрирует лучшие результаты по сравнению с другими триазолами, что обусловлено низкими минимальными ингибирующими концентрациями. Это обеспечивает его эффективность в отношении нитчатых грибов. Кроме того, он рекомендован в качестве препарата первой линии для лечения кератита, склерита и эндофтальмита, а также в целях профилактики после пересадки роговицы [6].

Кроме специфических противогрибковых препаратов, при лечении грибковых инфекций эффективны антисептики из группы бигуанидов. Антисептики возможно использовать в составе комбинированной терапии, что позволяет охватить широкий спектр возбудителей. Их преимуществом является низкая устойчивость микроорганизмов к ним, широкая доступность и низкая стоимость препаратов [7].

Помимо широко используемой концентрации 0,02% водного раствора хлоргексидина биглюконата, показана возможность и эффективность его концентраций 0,05, 0,1 и 0,2% с прямо пропорциональным ростом как фунгицидной активности, так и токсичности с местным раздражающим действием, при этом концентрация в 0,2% согласно отдельным исследованиям по эффекту может быть аналогична местному применению натамицина [8, 9].

Несмотря на широкий спектр предложенных схем применения, в реальной клинической практике их использование существенно ограничено вследствие отсутствия данных препаратов на фармацевтическом рынке. В связи с этим возникает необходимость рационального использования всех доступных терапевтических возможностей. Именно поэтому сравнение эффективности различных схем лечения остаётся актуальной и важной задачей.

Цель

Сравнить эффективность местного применения различных противогрибковых препаратов при лечении грибкового кератита в условиях эксперимента.

МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Проведено одноцентровое экспериментальное исследование.

Условия проведения исследования

Исследование проводили на базе кафедры офтальмологии Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова. Подготовку грибковых изолятов и культуральное исследование проводили сотрудники Научно-исследовательского института медицинской микологии им. П.Н. Кашкина.

Изготовление гистологических препаратов, а также морфологическую и морфометрическую оценку срезов роговицы выполняли на кафедре патологической анатомии Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова.

Исследование проводили в период с 2023 по 2026 год.

Критерии соответствия

Критерии включения:

• лабораторные животные, кролики породы «шиншилла»;
• женский пол;
• масса тела от 3 до 5 кг;
• отсутствие видимых признаков воспалительных заболеваний, травм глаз, дегенераций и дистрофий роговицы.

Критерии невключения: наличие видимых признаков воспалительных заболеваний, травм глаз, дегенераций и дистрофий роговицы.

Критерии исключения: воспаление роговицы негрибковой этиологии.

Моделирование грибкового кератита

Непосредственный этап моделирования осуществляли на лабораторных животных — кроликах породы «шиншилла» в условиях операционной вивария университета. Для проведения исследования использовали модель стромального грибкового кератита, разработанную А.Н. Давлетшиной и соавт.¹ [10].

Животных вводили в состояние нейролептанальгезии при помощи внутримышечного введения раствора ксилазина гидрохлорида в расчёте 10 мг на 1 кг массы тела и дополнительной эпибульбарной анестезии 0,4% раствором оксибупрокаина.

Для предварительной стерилизации глазной поверхности на роговицу накладывали гемостатическую губку, смоченную в 5% спиртовом растворе формалина, затем на сутки надевали мягкую контактную линзу с последующим подтверждением стерильности путём посева на грибковую и бактериальную флору. В дальнейшем в течение трёх суток инстиллировали 0,1% раствор дексаметазона 4 раза в день, после чего производили контаминацию роговицы заранее подготовленной суспензией питательной среды Сабуро с 5-суточной культурой грибов Fusarium solani, гомогенизированной и смешанной с изотоническим раствором натрия хлорида с конечной плотностью микроорганизмов 1,0 × 10⁶ клеток/мл.

Заражали путём скарификации эпителия с орошением раневой поверхности суспензией и её интрастромального введения иглой 29 G с дополнительным закапыванием 99% концентрата димексида для улучшения адгезии грибковых клеток. Затем поверхность роговицы покрывали мягкой контактной линзой. Процедуру повторяли 4–5 раз через день до формирования чёткой картины грибкового кератита, выраженность которой оценивали с помощью биомикроскопии с фотофиксацией и подтверждали с использованием шкалы оценки раздражения слизистой глаза кролика по степени гиперемии и отёка, а также количеству отделяемого по балльной системе, предложенной А. Majda и соавт. [11] (табл. 1).

 

Таблица 1. Оценка повреждающего действия химических веществ на слизистые оболочки глаза кролика по A. Majda и соавт. [11]

Table 1. Assessment of the damaging effects of chemical substances on the rabbit eye mucous membranes according to Majda et al. [11]

Баллы	Характеристика
Гиперемия конъюнктивы и роговицы
1	Сосуды инъецированы
2	Отдельные сосуды трудно различимы
3	Диффузное глубокое покраснение
Отёк век
1	Слабый отёк
2	Выраженный отёк с частичным выворачиванием век
3	В результате отёка глаз закрыт наполовину
4	В результате отёка глаз закрыт больше, чем на половину
Выделения
1	Минимальное количество в углу глаза
2	Количество выделений увлажняет веки
3	Количество выделений увлажняет веки и окружающую кожу

 

После культурального подтверждения грибкового кератита, приступали к этапу лечения. При отрицательном результате посева продолжали контаминацию с последующим повторным проведением исследования до получения чёткого положительного результата.

Анализ в группах

В зависимости от лекарственного препарата, используемого для лечения грибкового кератита, животных разделили на 4 группы:

• 1-я группа — вориконазол по 10 мг/мл;
• 2-я группа — хлоргексидина биглюконат по 2 мг/мл;
• 3-я группа — амфотерицин В по 1,5 мг/мл;
• 4-я группа — хлоргексидина биглюконат по 0,2 мг/мл в сочетании с вориконазолом в дозе 10 мг/мл.

Препараты инстиллировали в правый (опытный) глаз 6 раз в сутки, в левый глаз (контрольный) — стерильный физиологический раствор [12–14].

Основной исход исследования

Оценка динамики клинических проявлений и эффективности различных противогрибковых препаратов при лечении грибкового кератита.

Методы регистрации исхода

Оптическая когерентная томография

Оптическую когерентную томографию (ОКТ) выполняли перед формированием грибкового кератита, затем на 1, 4 и 8-е сутки исследования. Оценивали с использованием следующих критериев:

• центральной толщины роговицы;
• коэффициента Kr (толщина в центре патологического очага по отношению к толщине здоровой стромы по его краям) (рис. 1);
• коэффициента изменения площади среза роговицы по данным ОКТ (рис. 2–4).

 

Рис. 1. Расчёт центральной толщины в центре язвы и коэффициента Kr (толщина в центре патологического очага по отношению к толщине здоровой стромы по его краям).

Fig. 1. Calculation of central corneal thickness at the ulcer center and the Kr coefficient (ratio of stromal thickness at the center of the pathological focus to stromal thickness at its peripheral margins).

 

Рис. 2. Расчёт площади среза роговицы в ограниченном диаметре с захватом инфильтрата по данным оптической когерентной томографии.

Fig. 2. Calculation of the corneal cross-sectional area within a limited diameter including the infiltrate, based on optical coherence tomography data.

 

Рис. 3. Расчёт площади по данным оптической когерентной томографии: a — интактной роговицы до формирования инфильтрата; b — роговицы в ограниченном диаметре с центром в середине инфильтрата на 8-е сутки эксперимента.

Fig. 3. Calculation of area based on optical coherence tomography data: a, intact cornea before infiltrate formation; b, cornea within a limited diameter centered on the middle of the infiltrate on day 8 of the experiment.

 

Рис. 4. Схема расчёта индекса изменения площади среза роговицы по данным оптической когерентной томографии. ОКТ — оптическая когерентная томография.

Fig. 4. Schematic of the calculation of the corneal cross-sectional area change index based on optical coherence tomography data. OCT, optical coherence tomography.

 

Площадь среза рассчитывали с помощью программного обеспечения Adobe Acrobat Reader^® (Adobe Systems Inc., CША) в пикселях (см. рис. 2). После этого рассчитывали поправки с учётом коэффициента для изображения ОКТ с переводом в мм².

Затем рассчитывали площадь среза роговицы по данным ОКТ (в мм²) в пределах 8 мм диаметра с захватом инфильтрата/язвы (см. рис. 3, b). Показатели сравнивали с площадью среза роговицы на том же участке до формирования грибкового кератита (см. рис. 3, a).

После этого рассчитывали отношение площади поражённой роговицы к интактной, в результате чего получали показатель — индекс изменения площади среза роговицы по данным ОКТ (см. рис. 4).

Гистологическое исследование

После выведения животных из эксперимента на 8-е сутки удаляли глазные яблоки, из них выкраивали корнеосклеральный лоскут с захватом 3–4 мм склеры и конъюнктивы, которые затем фиксировали в 10% растворе забуференного нейтрального формалина в течение 24 ч. Далее выполняли ручную проводку материалов со спиртами возрастающей концентрации, затем осуществляли вырезку нужной части роговицы — линейного участка ткани, захватывающего центр грибкового инфильтрата. Полученные части заливали в парафиновые блоки, из которых в последующем формировали срезы тканей толщиной 3 мкм, окрашивали гистологический материал гематоксилином и эозином по стандартным гистотехническим протоколам. Микроскопическое и морфометрическое исследование по гистотопограммам проводили с использованием программного обеспечения Aperio AT2^® (Leica Biosystems, Германия).

Толщину эпителия роговицы измеряли во множестве точек через каждые 200 мкм для наиболее точной усреднённой оценки дегенеративных изменений слоёв (рис. 5).

 

Рис. 5. Расчёт средней толщины эпителия роговицы путём произведения множества измерений на всём его протяжении через равные промежутки (микрофотография, увеличение ×400).

Fig. 5. Calculation of mean corneal epithelial thickness by performing multiple measurements along the entire epithelial length at uniform intervals (micrograph, ×400 magnification).

 

Инфильтрацию оценивали в семи унифицированных зонах стромы каждой роговицы путём фотофиксации области в намеченной зоне при увеличении ×400. Затем изображения загружали в стандартный пакет Adobe Photoshop CS5^® (Adobe Systems Inc., США) с последующей оценкой цветового процентного соотношения пикселей структур, окрашенных базофильно (ядра иммунных клеток, тканевой детрит, клеточные элементы гриба) относительно всего остального изображения, с получением результата в объективных числовых значениях (рис. 6).

 

Рис. 6. Алгоритм количественной оценки инфильтрации в ткани роговицы: a — электронный скан гистологического микропрепарата роговицы с разметкой зон в семи участках среза на равном расстоянии друг от друга; b, c — ткань роговицы в размеченной зоне в увеличении ×400, участок с низкой степенью инфильтрации стромы (b) и с высокой степенью инфильтрации (c); d, e — выравнивание контрастных цветов по унифицированным параметрам для каждого скана; f, g — подсчёт пикселей цветов, соответствующих окраске гематоксилином (зелёный, красный, жёлтый — ядра воспалительных клеток, тканевой детрит, ядра грибковых клеток, ядра кератоцитов) относительно всех пикселей на изображении, включая синий (коллагеновые волокна).

Fig. 6. Algorithm for quantitative assessment of corneal tissue infiltration: a, electron scan of a histological corneal specimen with segmentation of seven regions of the section located at equal distances from each other; b, c, corneal tissue in the marked region at ×400 magnification, area with low stromal infiltration (b) and high infiltration (c); d, e, normalization of contrast colors using standardized parameters for each scan; f, g, pixel counting of colors corresponding to hematoxylin staining (green, red, and yellow indicate nuclei of inflammatory cells, tissue debris, nuclei of fungal cells, keratocyte nuclei) relative to the total number of pixels in the image, including blue (collagen fibers).

 

Этическая экспертиза

Исследование одобрено локальным этическим комитетом Северо-Западный государственного медицинского университет им. И.И. Мечникова (протокол № 10 от 11.10.2023).

Исследования проводили в соответствии с надлежащей лабораторной практикой², с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей^{3, 4}.

Статистический анализ

Расчёт размера выборки. Количество животных, минимально необходимое для исследования, рассчитали с использованием формулы с учётом редкости случаев грибкового кератита и неизвестным количеством в генеральной совокупности:

n = t² × p × q / ∆², (1)

где t² — критическое значение критерия Стьюдента, равное 0,05 [15]; p — доля случаев, в которых наблюдали исследуемое событие, равная 0,32 [16]; q — доля случаев, в которых наблюдали исследуемое событие, равная 99,68; Δ — предельно допустимая ошибка (5%). Таким образом, результат составил 5 единиц.

При этом допустимое число подопытных по ресурсному уравнению Mead [17] рассчитывали следующим образом:

$E=n-T$, (2)

где Е — ошибка степени свободы (должна быть от 10 до 20); n — количество животных; Т — общее число групп. Таким образом, максимальная точность результатов будет достигнута при использовании в эксперименте 24 животных с равным распределением по четырём группам.

Статистический анализ. Для анализа двух связных выборок по отдельности в двух группах сравнения использована система Statistica^® for Windows, версия 12 (StatSoft, Inc., США). Поскольку в выборках было малое количество наблюдений, использовали непараметрические методы. Количественные данные представлены в виде Ме [Q₁; Q₃], где Me — медиана, а Q₁ и Q₃ — 1-й и 3-й квартиль соответственно.

Сравнение опытных глаз в двух несвязанных группах по количественному показателю, распределение которого отличалось от нормального, выполняли с помощью U-критерия Манна–Уитни. Сравнение двух парных групп [правые глаза (опытные) и левые глаза (контрольные)] по количественному показателю, распределение которого отличалось от нормального, выполняли с помощью теста знаков.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Характеристики выборки

В зависимости от лекарственного средства, используемого для лечения грибкового кератита, животных разделили на 4 группы по 6 животных в каждой.

На 9-е сутки после начала контаминации удалось добиться формирования чёткой биомикроскопической картины кератита в 100% случаев, суммарные признаки раздражения глазной поверхности варьировали от 4 до 7 баллов (табл. 2), лабораторное подтверждение грибковой этиологии кератита получили на всех глазах.

 

Таблица 2. Суммарные показатели раздражения глазной поверхности

Table 2. Mean values for ocular surface irritation

Группа	Глаз	Суммарный средний балл
		1-й день	4-й день	8-й день
1	Правый	6,67	7	4,67
	Левый	6,66	7	5,16
2	Правый	5,17	7,17	5,67
	Левый	4,84	7,67	5,66
3	Правый	4,33	6,54	5,33
	Левый	4,67	7,51	5,5
4	Правый	5,83	5,17	4,67
	Левый	5,5	5,66	5,66

 

Основные результаты исследования

При оценке толщины роговицы в центральной зоне инфильтрата и коэффициента Kr не выявлено статистически значимого различия ни между опытными и контрольными глазами, ни между группами. Однако при оценке индекса изменения площади среза роговицы по данным ОКТ на 8-е сутки выявлено различие в структуре контрольных и опытных роговиц в 1-й и 4-й группах (p = 0,045 и p = 0,02 соответственно), при этом статистически значимого различия в показателях между указанными группами достигнуть не удалось, тем не менее в 4-й группе роговица менее всего отличалась от её исходной структуры (рис. 7).

 

Рис. 7. Сравнение коэффициентов изменения площади роговицы на 8-й день между опытными и контрольными глазами в группах. ОКТ — оптическая когерентная томография.

Fig. 7. Comparison of corneal area change coefficients on day 8 between experimental and control eyes across treatment groups. OCT, optical coherence tomography.

 

При гистологической оценке статистически значимое превышение толщины эпителия в опытных по отношению к контрольным глазам выявлено лишь в 1-й и 4-й группах (p = 0,001) (рис. 8), однако не было статистически значимой разницы в толщине эпителия между указанными группами (p > 0,05).

 

Рис. 8. Толщина эпителия (мкм) на 8-й день лечения.

Fig. 8. Corneal epithelial thickness (µm) on day 8 of treatment.

 

Статистически значимое снижение доли инфильтрации стромы выявлено только в 4-й группе (p = 0,001) (рис. 9).

 

Рис. 9. Доля инфильтрации стромы роговицы (%) на 8-й день лечения.

Fig. 9. Proportion of corneal stromal infiltration (%) on day 8 of treatment.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Резюме основного результата исследования

Установлена высокая эффективность местного лечения как в виде монотерапии 1,0% вориконазолом, так и при его применении в составе комбинированного лечения с 0,02% раствором хлоргексидина биглюконата. При этом комбинированная терапия продемонстрировал более выраженные преимущества по сравнению с монотерапией: отмечена тенденция к лучшему восстановлению структуры роговицы по данным ОКТ (p > 0,05), а также статистически значимое снижение инфильтрации слоёв стромы (p < 0,05).

Интерпретация результатов исследования

В нашем исследовании тщательная подготовка роговицы к инокуляции грибковых клеток по схеме, разработанной Н.И. Давлетшиной и соавт. [10], позволила преодолеть естественные защитные механизмы, характерные для глаз кроликов, что подтверждает высокую эффективность данной экспериментальной модели.

Критерии оценки локального статуса позволили определить чёткую клиническую картину грибкового кератита на 7–9-е сутки. Однако в настоящем исследовании в связи с важностью оценки именно переднего отдела глаза более глубокие структуры не оценивали.

Мы впервые оценили количественные критерии при грибковых кератитах, а именно центральную толщину роговицы с динамикой её изменения в микрометрах и коэффициент Kr. Однако нам не удалось выявить различий между данными показателями, как при оценке опытных и контрольных глаз между собой, так и при сравнении групп. Это может быть связано с низкой чувствительностью данных критериев в отношении грибкового кератита, который не так эффективно поддаётся лечению как бактериальные поражения, для которых эти критерии применяли Е.В. Яни и соавт. [18].

Помимо этого, при грибковых язвах уменьшение толщины роговицы не всегда является признаком положительной динамики и может указывать на риск перфорации, поэтому важен критерий, свидетельствующий о степени изменения толщины роговицы как в бóльшую, так и в меньшую сторону.

Для этого мы использовали индекс изменения площади среза роговицы по данным ОКТ, который позволил объективно оценить изменения толщины роговицы по сравнению с её физиологичным состоянием. Следует отметить, что он обладал большей чувствительностью к минимальным изменениям стромы.

Повышение индекса указывало на утолщение, что обусловлено увеличением отёка и инфильтрацией стромы, а уменьшение — истончением и риском перфорации. Таким образом, наиболее благоприятным результатом считали значение индекса, максимально приближённое к 1. Данный критерий может быть полезен при расчёте эффективности терапии в экспериментальных моделях, требующих более высокую чувствительность к изменениям при ОКТ.

Используемые методы морфометрического исследования позволили объективно и количественно оценить критерии, которые ранее в литературных источниках оценивали преимущественно полуколичественно в баллах [19, 20].

Наблюдаемые гистологические изменения ранее описывали в исследованиях, где анализировали состояние роговицы по критериям структуры эпителия, стромальных слоёв, интенсивности инфильтрации, миграции иммунных клеток из лимбальных сосудов в строму. Так, эпителий оценивали по количеству слоёв, их истончению, форме клеток, отёчности стромы, а учёт производили в баллах [19].

T.T. Aung и соавт. [20] оценивали «грибковую нагрузку» роговицы в баллах по градации:

• незначительное снижение;
• значительное снижение;
• заметное подавление грибковой нагрузки.

В настоящей работе расчёт средней толщины эпителия роговицы в микрометрах напрямую зависел от дегенеративных изменений и уменьшения количества эпителиальных слоёв, поэтому увеличение показателя может свидетельствовать о более благоприятном влиянии препарата на эпителизацию поверхности роговицы и о меньшей токсичности препарата.

Степень инфильтрации стромы определяли количеством иммунных и грибковых клеток в строме, а также накоплением тканевого детрита. При этом уменьшение процентного соотношения инфильтрации может говорить о благоприятном влиянии лечения.

Это соответствует данным литературы, демонстрирующим высокую эффективность вориконазола в клинической практике и на экспериментальных моделях, сопоставимую с натамицином, считающимся препаратом первой линии [21], а также с кросслинкингом коллагена [22].

Ранее отмечали, что он может уступать по силе фунгицидному действию препаратам из группы полиенов [20], однако это не выявлено в нашем исследовании. Это может быть обусловлено большей токсичностью и меньшей проникающей способностью амфотерицина В по сравнению с вориконазолом, что ограничивает его широкое применение при глубоких кератомикозах, хотя к нему и наблюдается чувствительность среди нитчатых грибов, в том числе у некоторых представителей рода Fusarium [19, 23].

Аналогичные данные наблюдали при применении хлоргексидина биглюконата в концентрации 0,2% в качестве монотерапии. Он также не показал заметного отличия при сравнении опытных и контрольных глаз. Это не согласуется с данными литературы, что, возможно, обусловлено проведением исследований in vitro, в частности без учёта клинических особенностей грибкового кератита в живых биологических тканях [7–9, 24].

Важность применения комбинированной терапии с использованием противогрибкового препарата и антисептика в реальной клинической практике обусловлена в первую очередь необходимостью усиления и расширения спектра фунгицидного действия в условиях ограниченного наличия противогрибковых препаратов на рынке.

Также значительным преимуществом данной комбинации является возможность подавлении активности акантамёбы, которая может выступать как в качестве сопутствующего агента, так и в качестве основного возбудителя со сходными клиническими проявлениями, что в сочетании с относительно широкой доступностью обоих препаратов делает схему полезной для практического применения [25, 26].

В последние годы наблюдают большой прогресс в области диагностики и лечения грибковых кератитов в отечественной офтальмологии. Значительную пользу в нашем исследовании в отношении подбора оптимальной противогрибковой терапии, в том числе с описанием схем применения противогрибковых препаратов, принёс отечественный справочник по фармакотерапии Ю.С. Астахова и соавт. [27].

Ограничения исследования

Исследование содержит некоторые ограничения, основным из которых является экспериментальный характер, в результате чего остаются неучтёнными особенности иммунного ответа роговицы человека, что может быть исправлено дальнейшими исследованиями в условиях реальной клинической практики.

Индекс изменения площади среза роговицы по данным ОКТ возможно использовать в клинической практике, если в качестве точки отсчёта принимать площадь среза роговицы на момент первичного осмотра пациента. Однако отсутствие при этом исходных параметров здоровой роговицы остаётся значительным ограничением, которое может быть частично компенсировано учётом толщины роговицы здорового парного глаза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Комплексное применение местных инстилляций 1% вориконазола и 0,02% водного раствора хлоргексидина биглюконата продемонстрировало преимущество как в отношении восстановления физиологической структуры стромы роговицы по данным ОКТ, так и по гистологическим критериям (степень инфильтрации стромы и восстановление слоёв эпителия), что свидетельствует о перспективности использования данной схемы терапии в клинической практике.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Э.В. Бойко, Н.В. Васильева, Ю.М. Забродская, Е.М. Трунин — определение концепции, пересмотр и редактирование текста рукописи; Н.В. Щемеров — определение концепции, написание черновика рукописи, сбор и анализ литературных данных, подготовка графических материалов; Ф.О. Касымов, В.В. Татаркин — работа с данными, пересмотр и редактирование текста рукописи; А.В. Титов, И.А. Босак — проведение исследования, пересмотр и редактирование текста рукописи; Е.В. Пресняков — проведение исследования; Н.Г. Зумбулидзе, И.П. Сорочану, П.П. Гришин — проведение исследования, работа с данными, подготовка графических материалов; Э.Р. Зейбель — проведение исследования, работа с данными, написание черновика рукописи; Р.В. Деев — работа с данными, пересмотр и редактирование текста рукописи. Все авторы одобрили рукопись (версию для публикации), а также согласились нести ответственность за все аспекты настоящей работы, гарантируя надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой её части.

Благодарности. Авторы выражают благодарность коллективу кафедры оперативной и клинической хирургии с топографической анатомией им. С.А. Симбирцева, а также участникам студенческого научного общества за вклад в проведение экспериментального исследования.

Этическая экспертиза. Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом Северо-Западный государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова (протокол заседания № 10 от 11.10.2023).

Источники финансирования. Отсутствуют.

Оригинальность. При создании настоящей работы авторы не использовали ранее опубликованные сведения (текст, иллюстрации, данные), в том числе в виде самоцитирования. Все перечисленные материалы являются оригинальными и созданы авторами самостоятельно.

Доступ к данным. Редакционная политика в отношении совместного использования данных к настоящей работе не применима.

Генеративный искусственный интеллект. При создании настоящей статьи, а именно частей на английском языке (резюме, данные авторов, подписи файлов), был использован чат-бот GPT версия 5,1, (OpenAI, USA, https://openai.com/ru-RU/index/chatgpt/) с дальнейшей перепроверкой специалиста по переводу медицинской литературы. Период использования чат-бота — январь 2026 года.

Рассмотрение и рецензирование. Настоящая работа подана в журнал в инициативном порядке и рассмотрена по обычной процедуре. В рецензировании участвовали два члена редакционной коллегии и научный редактор издания.

ADDITIONAL INFO

Author contribution: E.V. Boiko, N.V. Vasilyeva, Yu.M. Zabrodskaya, E.M. Trunin: conceptualization, writing — review & editing; N.V. Shchemerov: conceptualization, writing — original draft, investigation, visualization; F.O. Kasymov, V.V. Tatarkin: data curation, writing — review & editing; A.V. Titov, I.A. Bosak: investigation, writing — review & editing; E.V. Presnyakov: investigation; N.G. Zumbulidze, I.P. Sorochanu, P.P. Grishin: investigation, data curation, visualization; E.R. Zeibel: investigation, data curation, writing — original draft; R.V. Deev: data curation, writing — review & editing. All the authors approved the version of the manuscript to be published and agreed to be accountable for all aspects of the work, ensuring that questions related to the accuracy or integrity of any part of the work are appropriately investigated and resolved.

Acknowledgements: The authors express their gratitude to the staff of the Department of Operative and Clinical Surgery with Topographic Anatomy named after S.A. Simbirtsev, as well as to the members of the Student Scientific Society, for their contribution to the experimental study.

Ethics approval: The study was approved by the local ethics committee of the North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov (Protocol No. 10, dated October 11, 2023). All participants provided written informed consent.

Funding sources: No funding.

Statement of originality: No previously obtained or published material (text, images, or data) was used in this study, including self-citations. All listed materials are original and were created by the authors independently.

Data availability statement: All data obtained in this study are available in this article.

Generative AI: In preparing this article, namely the English-language sections (abstract, author info, figure captions), the GPT chat-bot version 5.1 (OpenAI, USA, https://openai.com/ru-RU/index/chatgpt/) was used, with subsequent verification by a medical literature translation specialist. The chat-bot was used in January 2026.

Provenance and peer-review: This paper was submitted unsolicited and reviewed following the standard procedure. The peer review process involved external reviewer, a member of the editorial board, and the in-house scientific editor.

¹ Патент РФ № 2746647/ 19.04.2021. Бюл. № 11. Самойлов А.Н., Давлетшина Н.И., Шакирова Ф.В., и др. Способ создания экспериментальной модели грибкового кератита у кроликов. Режим доступа: https://www.elibrary.ru/download/elibrary_45810829_43874642.PDF. Дата обращения: 18.04.2026.

² Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации № 199н от 01 апреля 2016 г. «Об утверждении правил лабораторной практики». Режим доступа: https://normativ.kontur.ru/document?moduleId = 1&documentId = 278397. Дата обращения: 18.04.2026.

³ Директива 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях. Санкт-Петербург, 2012. Режим доступа: https://ruslasa.ru/wp-content/uploads/2017/06/Directive_201063_rus.pdf. Дата обращения: 18.04.2026.

⁴ Европейская Конвенция о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 18 марта 1986 г.) № 123. Режим доступа: https://rm.coe.int/168007a6a8. Дата обращения: 18.04.2026.

About the authors

Ernest V. Boiko

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov; Saint Petersburg Branch of the S. Fyodorov Eye Microsurgery Federal State Institution

Email: Ernest.Boiko@szgmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-7413-7478
SPIN-code: 7589-2512

MD, Dr. Sci. (Medicine), Professor

Russian Federation, Saint Petersburg; Saint Petersburg

Nikolay V. Shchemerov

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

Author for correspondence.
Email: Shemerovvv@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-9874-6665
SPIN-code: 2430-6810
Russian Federation, Saint Petersburg

Evgeniy M. Trunin

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

Email: Evgeniy.Trunin@szgmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-2452-0321
SPIN-code: 5903-0288

MD, Dr. Sci. (Medicine), Professor

Russian Federation, Saint Petersburg

Yuliya M. Zabrodskaya

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

Email: Iuliia.Zabrodskaia@szgmu.ru
ORCID iD: 0000-0001-6206-2133
SPIN-code: 8571-3190

MD, Dr. Sci. (Medicine), Professor

Russian Federation, Saint Petersburg

Natalia V. Vasilyeva

P.N. Kashkin Research Institute of Medical Mycology of North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

Email: Natalya.vasileva@szgmu.ru
ORCID iD: 0000-0003-3693-5468
SPIN-code: 3829-4370

Dr. Sci. (Biology), Professor

Russian Federation, Saint Petersburg

Farkhod O. Kasymov

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

Email: farkkas@yahoo.com
ORCID iD: 0009-0004-4368-143X
SPIN-code: 7778-6309

MD, Cand. Sci. (Medicine)

Russian Federation, Saint Petersburg

Vladislav V. Tatarkin

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

Email: Vladislav.Tatarkin@szgmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-9599-3935
SPIN-code: 5008-4677

MD, Cand. Sci. (Medicine)

Russian Federation, Saint Petersburg

Alexey V. Titov

Saint Petersburg Branch of the S. Fyodorov Eye Microsurgery Federal State Institution

Email: dr.titov.smile@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-6847-4737
SPIN-code: 4845-4430
Russian Federation, Saint Petersburg

Ilya A. Bosak

P.N. Kashkin Research Institute of Medical Mycology of North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

Email: Ilya.Bosak@szgmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-0193-9103
SPIN-code: 5699-5857

MD, Cand. Sci. (Medicine)

Russian Federation, Saint Petersburg

Evgeny V. Presnyakov

Avtsyn Research Institute of Human Morphology of Petrovsky National Research Centre of Surgery

Email: uvpres@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1546-5129
SPIN-code: 4001-4715
Russian Federation, Moscow

Natalia G. Zumbulidze

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

Email: guramovna@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-7729-097X
SPIN-code: 4439-8855

MD, Cand. Sci. (Medicine)

Russian Federation, Saint Petersburg

Emma R. Zeibel

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

Email: zeibel.emma@gmail.com
ORCID iD: 0009-0004-7754-7976
SPIN-code: 5708-8260
Russian Federation, Saint Petersburg

Irina P. Sorochanu

Avtsyn Research Institute of Human Morphology of Petrovsky National Research Centre of Surgery

Email: opeairina@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-6909-8937
SPIN-code: 4072-3845
Russian Federation, Moscow

Platon P. Grishin

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

Email: grishin.platon@gmail.com
ORCID iD: 0009-0004-3871-5324
SPIN-code: 3465-4098
Russian Federation, Saint Petersburg

Roman V. Deev

Avtsyn Research Institute of Human Morphology of Petrovsky National Research Centre of Surgery

Email: romdey@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-8389-3841
SPIN-code: 2957-1687

MD, Cand. Sci. (Medicine)

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files