BACKGROUND: The search for an effective method for the treatment of limbal stem cell deficiency of various etiologies, leading to intense clouding and vascularization of the cornea, followed by a significant decrease in visual acuity, remains an important and relevant topic in ophthalmology. The results of the studies showed that transplantation of buccal epithelial cells could significantly improve the prognosis of treatment in this category of patients.
AIM: To determine the optimal fixation period of a combined bioconstruction with buccal epithelial cells for the treatment of limbal cell deficiency in experiment.
MATERIALS AND METHODS: At the first stage, the corneal epithelium was removed with a scraper in the eyes of experimental animals (12 eyes), and the limb was excised along the entire circumference. Next, to isolate epithelial buccal cells and manufacture a combined bioconstruction consisting of buccal cells, a collagen carrier and a soft contact lens, a flap of the mucous membrane of 5 × 5 mm was taken from the cheeks of rabbits. At the second stage, after the formation of a fibrovascular pannus on the cornea, it was excised to transparent layers of the cornea, a combined bioconstruction was placed on top. Further, one U-shaped suture was applied at the border of the inner and outer third of the eyelids. Temporary blepharorraphia persisted for 3 days (6 eyes) and 5 days (6 eyes), after the specified time, stitches were removed from the eyelids, and bioconstructions were removed. The bioconstructions removed from the eyes were stained with a vital (lifetime) fluorochrome dye based on tripaflavin and acridine orange, followed by analysis in a fluorescent microscope. The structure of cell nuclei, the overall integrity of the cytoplasm, and the presence of secretory vesicles were evaluated. After 7 and 14 days after transplantation of the bioconstruction, the area of erosion, the extent of new vessels and the transparency of the cornea were evaluated. When the observation was completed, the rabbits were removed from the experiment, and the eyes were enucleated and subjected to histological examination.
RESULTS: On the surface of all bioconstructions removed after 5 days, only leukocytes were detected. At the same time, on collagen matrix of bioconstructions removed after 3 days, in addition to leukocytes, there were also buccal epithelial cells with normal nuclear structure and chromatin topography in its composition, as well as with secretory vesicles. On days 7–14, both groups showed a decrease in the area of erosion, while the dynamics of ocular surface recovery processes was more pronounced in the group with fixation of the bioconstruction for 5 days.
CONCLUSIONS: According to the results of in vivo staining with fluorochrome dye of combined bioconstructions removed from the cornea of experimental animals 3 and 5 days after superficial keratectomy, as well as the data of clinical and histological examination, the optimal period for bioconstruction fixation was established to be 5 days.
Актуальность. Поиск эффективного метода лечения недостаточности стволовых клеток лимба различной этиологии, приводящей к интенсивному помутнению и васкуляризации роговицы с последующим значительным снижением остроты зрения, остаётся важной и актуальной темой в офтальмологии. Результаты проведённых исследований показали, что трансплантация буккальных эпителиальных клеток может значительно улучшить прогноз лечения данной категории пациентов.
Цель — в эксперименте определить оптимальный срок фиксации комбинированной биоконструкции с клетками буккального эпителия при лечении лимбально-клеточной недостаточности.
Материалы и методы. На первом этапе на глазах экспериментальных животных (12 глаз) удаляли скребцом эпителий роговицы и по всей окружности лимб. Далее для выделения эпителиальных буккальных клеток и изготовления комбинированной биоконструкции, состоящей из буккальных клеток, коллагенового носителя и мягкой контактной линзы, со щеки кроликов забирали лоскут слизистой оболочки 5 × 5 мм. На втором этапе после формирования на роговице фиброваскулярного паннуса его иссекали до прозрачных слоёв роговицы, сверху размещали комбинированную биоконструкцию. Далее на границе внутренней и наружной трети век накладывали один П-образный шов. Временная блефарорафия сохранялась в течение 3 (6 глаз) и 5 сут (6 глаз), по истечении указанного времени снимали швы с век и удаляли биоконструкции. Удалённые с глаз лабораторных животных биоконструкции окрашивали витальным (прижизненным) флуорохромным красителем на основе трипафлавина и акридинового оранжевого, с последующим анализом во флуоресцентном микроскопе. Оценивали структуру клеточных ядер, общую целостность цитоплазмы, наличие секреторных везикул. Через 7 и 14 сут после трансплантации биоконструкции оценивали площадь эрозии, выраженность новообразованных сосудов и прозрачность роговицы. После завершения наблюдения кроликов выводили из эксперимента, глаза энуклеировали и подвергали гистологическому исследованию.
Результаты. На поверхности всех экспериментальных образцов биоконструкций, удалённых через 5 сут, выявлялись только лейкоциты. В то же время на образцах коллагенового носителя биоконструкций, удалённых через 3 сут, помимо лейкоцитов присутствовали и клетки буккального эпителия с нормальной структурой ядра и топографией хроматина в его составе, а также с секреторными везикулами. На 7-е и 14-е сутки зарегистрировано уменьшение площади эрозии в обеих группах, однако в группе с фиксацией биоконструкции в течение 5 сут отмечалась более выраженная тенденция к восстановлению глазной поверхности.
Заключение. По результатам прижизненного окрашивания флуорохромным красителем комбинированных биоконструкций, удалённых с роговицы экспериментальных животных через 3 и 5 сут после поверхностной кератэктомии, а также клинической картины в послеоперационном периоде и данным гистологического исследования установлен оптимальный срок фиксации биоконструкции равный 5 сут.