Применение лизата тромбоцитов для увеличения ростстимулирующего эффекта амниотической мембраны in vitro

Полный текст

АКТУАЛЬНОСТЬ

Амниотическую мембрану (АМ) широко используют в офтальмохирургии в качестве раневого покрытия при лечении дефектов роговицы [1, 2]. Показано, что АМ обладает репаративным, противовоспалительным, противовирусным действием, биологической кондуктивностью (стимулирует миграцию клеток), также АМ может быть использована в качестве матрикса для культивированных клеток при получении биоконструкций [3–6]. Во многом репаративный эффект АМ достигается благодаря наличию в клетках АМ большого числа факторов репарации. Однако в процессе процедур консервирования значительная часть биологически активных веществ АМ может быть утрачена. Неоднократно показано, что коллагеновые матриксы могут быть эффективно использованы в сочетании с тромбоцитными препаратами [7–9]. Тромбоциты человека содержат большое количество факторов роста и дифференцировки [10, 11], поэтому можно предположить, что комбинация АМ и тромбоцитных препаратов позволит добиться ростстимулирующего, репаративного и регенеративного эффекта.

Цель исследования — отработать методику насыщения консервированной амниотической мембраны (АМ) лизатом тромбоцитов и оценить ростстимулирующий эффект комбинации АМ и лизата тромбоцитов in vitro.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Совместное исследование проводили на базе отделения биотехнологий и трансфузиологии НИИ СП им. Н.В. Склифосовского. Исследовали образцы АМ, консервированные тремя способами: силиковысушивание на поверхности силикатных гранул по стандартной методике [3]; криоконсервирование в среде Борзенка – Мороз [12]; лиофилизация в вакууме (для изготовления лиофилизированных АМ использовали АМ, которые изначально криоконсервировали, размораживали и отмывали от криопротектора средой DMEM/F12).

В качестве источника тромбоцитов использовали кровь здоровых добровольцев. Для получения богатой тромбоцитами плазмы (БоТП) использовали двухэтапное центрифугирование: сначала исходную кровь центрифугировали при 300 g, выделяли первичную плазму с тромбоцитами, которую центрифугировали при 700 g с целью концентрирования тромбоцитов. После 700 g формировался осадок тромбоцитов и бедная тромбоцитами плазма. Большую часть объёма бедной тромбоцитами плазмы (65–75 %) удаляли, в оставшемся объёме проводили ресуспендирование осадка тромбоцитов до полного исчезновения визуально различимых конгломератов. В готовой БоТП общая концентрация тромбоцитов составляла 1200–1600 тыс./мкл, концентрация тромбоцитов с гранулами (биологически полноценные тромбоциты) — 400–800 тыс./мкл. Для получения лизата тромбоцитов БоТП замораживали при –80 °C с последующей медленной разморозкой при 0–4 °C. Для удаления фрагментов разрушенных клеток БоТП после разморозки центрифугировали при 3000 g и отбирали супернатант, который представляет готовый лизат тромбоцитов.

Для отработки методики насыщения консервированных АМ лизатом БоТП образцы амниона площадью 0,25 см² помещали в чашки Петри, взвешивали на аналитических весах, наносили на образцы 100–200 мкл лизата БоТП, экспонировали при комнатной температуре в течение 1–15 мин, затем повторно взвешивали с периодичностью 1–5 мин. Определяли массу АМ (в мг) до и после экспозиции с лизатом БоТП, рассчитывали изменение массы АМ (в процентах), оценивали средний объём лизата БоТП, который может адсорбировать 1 см² АМ каждого типа.

Оценку биосовместимости и ростстимулирующего эффекта АМ проводили в культуре клеток буккального эпителия человека 3–5-го пассажа. Исследовали следующие группы: контроль 1 — без АМ и без лизата БоТП; контроль 2 — лизат БоТП без АМ; 1-я опытная группа — АМ без лизата БоТП; 2-я опытная группа — АМ, совмещённые с лизатом БоТП. Площадь трансплантатов АМ во всех случаях составляла 0,25 см². В контрольные и опытные лунки вносили по 10 тыс. клеток культуры буккального эпителия. В опытах с лизатом БоТП объём используемого лизата составил 25–60 мкл, исходя из оптимального содержания тромбоцитарных факторов роста в тромбоцитах исходной БоТП (10–15 пикограмм на 10 тыс. высеянных клеток). Динамику роста клеток оценивали через 1, 2 и 3 сут с момента посева. Оценку количества клеток, их жизнеспособности и морфологии проводили с помощью оригинальных методов витального окрашивания флуорохромными красителями трипафлавин-родамином С и трипафлавин-акридиновым оранжевым с последующим исследованием во флуоресцентном микроскопе [8, 9].

Полученные статистические данные обрабатывали с помощью методов вариационной статистики с использованием пакета программ IBM SPSS Statistics 22. Вычисляли среднее значение (M), среднеквадратичное отклонение (σ), для сравнения количественных данных в двух несвязанных между собой выборках использовали t-критерий Стьюдента. Различия между значениями считали достоверными при уровне значимости более 95 % (р < 0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение комбинации АМ и лизата БоТП для клинического использования

При нанесении лизата БоТП на поверхность консервированных АМ во всех случаях масса трансплантатов заметно увеличивалась уже через 1 мин экспозиции. Для силиковысушенных АМ увеличение составило в среднем 4,2 раза, для лиофилизированных АМ — 4,8 раза, для криоконсервированных АМ — 1,8 раза (см. таблицу). При более длительной экспозиции (5–15 мин) изменения массы АМ в присутствии лизата БоТП уже не наблюдалось. Таким образом, продолжительность 5 мин является достаточной для насыщения консервированных АМ лизатом. Объём лизата, адсорбированный лиофилизированными АМ, был достоверно выше, чем при использовании силиковысушенных и криоконсервированных АМ (р < 0,05). В среднем образцы лиофилизированных АМ площадью 0,25 см² адсорбировали 1,60 ± 0,18 мг лизата БоТП, что в пересчёте на 1 см² составляет 6,4 мкл лизата БоТП. Такой объём БоТП содержит оценочно 60–65 пикограмм тромбоцитарного фактора роста PDGF и 50–54 пикограмм эпидермального фактора роста EGF [13]. По нашим данным, концентрация ростовых факторов в лизате тромбоцитов может быть заметно увеличена, если получать лизат в бесплазменной среде [11], поэтому для дальнейших исследований актуальным представляется изучение АМ, комбинированных с лизатом тромбоцитов в бесплазменной среде. Данное исследование показывает, что для насыщения консервированных АМ наиболее оправдано использовать лиофилизированные образцы.

 

Таблица. Эффективность насыщения консервированных амниотических мембран лизатом богатой тромбоцимтами плазмы

Table. Efficacy of saturation of canned AM with PRP lysate

Показатель		Силиковысушенная АМ	Лиофилизированная АМ	Криоконсервированная АМ
Масса образцов АМ, мг (площадь АМ 0,25 см2)	до нанесения лизата	0,42 ± 0,04	0,45 ± 0,11	1,23 ± 0,14
	через 1 мин экспозиции с лизатом	1,75 ± 0,05 *	2,05 ± 0,21 *	2,23 ± 0,05 *
	через 5 мин экспозиции с лизатом	1,72 ± 0,13	2,10 ± 0,27	2,36 ± 0,68
Изменение массы АМ через 5 мин экспозиции с лизатом, %		315,0 ± 25,3	380,3 ± 86,2	82,8 ± 10,7
Объём лизата БоТП, который может адсорбировать 1 см2 АМ, мкл		5,3	6,4	4,4

* р < 0,05 относительно АМ до нанесения лизата. Примечание. АМ — амниотическая мембрана; БоТП — богатая тромбоцитами плазма.

 

Ростстимулирующий эффект АМ и лизата БоТП in vitro

Все образцы амниона без добавления лизата БоТП не вызывали нарушения структурной целостности клеток и снижения их пролиферативной активности в течение всего срока культивирования. При витальном окрашивании в составе АМ, полученных путем силиковысушивания и лиофилизации, не было выявлено жизнеспособных клеток, в то время как в образцах криоконсервированной АМ можно было отчётливо видеть эпителиальные клетки с нормальной структурой ядер и цитоплазмы, секреторные везикулы выявлялись очень слабо или вообще не выявлялись. Независимо от способа консервирования, все образцы АМ не давали ростстимулирующего эффекта в культуре в течение всего срока наблюдения (см. рисунок).

 

Рисунок. Сравнительная характеристика роста клеток буккального эпителия человека в лунках с образцами амниотической мембраны (АМ), консервированными различными способами

Figure. Comparative characteristics of the growth of human buccal epithelial cells in wells with amniotic membrane (AM) samples preserved in various ways

 

В опытах с лизатом БоТП без амниона на дне всех лунок формировалась фибриновая плёнка, что несколько затрудняло рост клеток на 1–2-е сутки и достоверный ростстимулирующий эффект был отмечен только на 3-е сутки.

В опытах, где консервированные образцы АМ совмещали с лизатом БоТП, выраженная стимуляция роста наблюдалась при использовании лиофилизированных АМ. В присутствии комбинации лиофилизированных АМ и лизата БоТП число клеток в 1,3–1,4 раза (p < 0,05) превышало аналогичный параметр в опытах с лизатом без АМ в течение всего срока исследования. Эксперименты в группе силиковысушенного амниона и лизат БоТП показали, что число клеток буккального эпителия было выше, чем в контроле (лизат БоТП без амниона), однако статистически значимым это различие было только на 1-е сутки. В опытах, где лизат БоТП совмещали с криоконсервированным амнионом, число клеток статистически не отличалось от опытов с лизатом без АМ, то есть в данном случае не удавалось получить выраженной стимуляции роста. Таким образом, лиофилизацию можно считать наиболее предпочтительной обработкой амниона для последующего насыщения его лизатом в БоТП (см. рисунок).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Отработана методика насыщения консервированной АМ факторами роста, заключающаяся в пропитывании в течение 5 мин лизатом БоТП. Объём лизата, адсорбированный лиофилизированными АМ, был наибольшим, тогда как при использовании криоконсервированных АМ — наименьшим. В этой связи, для насыщения лизатом БоТП наиболее предпочтительно использовать лиофилизированные образцы АМ.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Вклад каждого автора: Е.В. Ченцова, Н.В. Боровкина — значимое участие в разработке концепции и дизайна исследования, в интерпретации данных; И.Н. Пономарёв — проведение эксперимента, сбор данных и их интерпретация; М.С. Макаров — сбор данных и их интерпретация, написание текста статьи; Д.А. Боженко — проведение эксперимента, сбор данных и их интерпретация, написание текста статьи; М.В. Сторожева — сбор данных и их интерпретация; П.В. Макаров — интерпретация данных.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

ADDITIONAL INFORMATION

Author contribution. Thereby, all authors made a substantial contribution to the conception of the study, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the article, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the study. Contribution of each author: E.V. Chentsova, N.V. Borovkina — significant participation in the development of the concept and design of the study, in the interpretation of data; I.N. Ponomarev — conducting the experiment, data collection and interpretation; M.S. Makarov — data collection and interpretation, writing the text of the article; D.A. Bozhenko — conducting the experiment, data collection and their interpretation, writing the text of the article; M.V. Storozheva — data collection and interpretation; P.V. Makarov — data interpretation.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Об авторах

Дмитрий Андреевич Боженко

Национальный медицинский исследовательский центр НИИ глазных болезней им. Гельмгольца

Email: panacelium@gmail.com

аспирант, офтальмолог

Россия, Москва

Екатерина Валериановна Ченцова

Национальный медицинский исследовательский центр НИИ глазных болезней им. Гельмгольца

Email: chentsova27@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-8394-1038
SPIN-код: 8191-8338

д-р мед. наук, профессор, начальник отдела травматологии и реконструктивной хирургии

Россия, Москва

Наталья Валерьевна Боровкова

Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского

Email: borovkovanv@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-8897-7523
SPIN-код: 9339-2800

д-р мед. наук, заведующая отделением биотехнологий и трансфузиологии

Россия, Москва

Иван Николаевич Пономарев

Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского

Email: rzam@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-2523-6939
SPIN-код: 4705-9314

канд. мед. наук, ст. научн. сотр.

Россия, Москва

Майя Викторовна Сторожева

Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского

Email: Mayya.storozheva@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1927-2404
SPIN-код: 7789-3277

научн. сотр. отделения биотехнологий и трансфузиологии

Россия, Москва

Максим Сергеевич Макаров

Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского

Email: mcsimmc@yandex.ru
SPIN-код: 3543-5800

канд. биол. наук, ст. научн. сотр. отделения биотехнологий и трансфузиологии

Россия, Москва

Павел Васильевич Макаров

Национальный медицинский исследовательский центр НИИ глазных болезней им. Гельмгольца

Автор, ответственный за переписку.
Email: makarovpavel61@mail.ru

д-р мед. наук, вед. научн. сотр.

Россия, Москва

Список литературы

Дополнительные файлы