Возможности конфокальной микроскопии при заболеваниях глазной поверхности

Полный текст

Возможности конфокальной микроскопии при заболеваниях глазной поверхности

Конфокальная микроскопия — современный метод, позволяющий изучать клеточное строение роговицы, лимба и конъюнктивы в режиме реального времени in vivo. Большая разрешающая способность даёт возможность не только визуализировать ткани на клеточном уровне, но и измерить толщину слоёв, оценить количество, форму и размер клеток, в частности клеток эпителия, стромы и эндотелия роговицы [1, 2, 10, 12, 13, 17, 18, 20].

В 1955 г. Marvin Minsky разработал модель конфокального микроскопа для визуализации клеток мозга и изучения процесса синаптической передачи в нейронах головного мозга in vivo. Впоследствии оптическая теория конфокальной микроскопии была более подробно изучена в 1980–1990 гг. [2, 15]. Основной принцип конфокальной микроскопии состоит в том, что осветитель и объектив сфокусированы на одной точке исследуемой ткани. Таким образом, мы получаем изображение с очень высоким разрешением, но с ограниченным полем зрения [2, 15].

В рамках данной работы был использован лазерный сканирующий конфокальный микроскоп Rostock Cornea Module (RCM) на базе Heidelberg Retina Tomograph 3 (HRT3, Heidelberg Engineering GmbH, Germany). HRT3-RCM использует гелий-неоновый диодный лазер с длиной волны 670 нм и обеспечивает высокое разрешение до 1 мкм/пиксель. Исследование контактное и выполняется под эпибульбарной анестезией при помощи одноразовых стерильных колпачков из полиметилметакрилата (ПММА). К особенностям прибора относят возможность получения косого среза через все слои роговицы, а также исследование через умеренно непрозрачные ткани (рубцовое помутнение или отёк роговицы).

Появление конфокальных микроскопов ознаменовало начало новой эры в диагностике не только заболеваний роговицы, но и всей глазной поверхности. В последнее время состояние тканей глазной поверхности привлекает внимание многих практикующих врачей. Под тканями глазной поверхности мы понимаем структуру, анатомически объединяющую наружный эпителий роговицы, лимба и конъюнктивы. Синдром сухого глаза (ССГ), проявляющийся у 5–35 % населения развитых стран, является одним из самых распространённых поверхностных заболеваний глаза [5].

Согласно определению The Dry Eye Workshop (DEWS) под ССГ подразумевается нарушение стабильности слёзной плёнки вследствие недостаточной её продукции или избыточного испарения, которое приводит к поражению глазной поверхности. ССГ сопровождается повышением осмолярности слёзной плёнки и воспалением поверхностных тканей [5]. Конфокальная микроскопия может помочь в более детальном понимании патофизиологических механизмов развития ССГ, в выборе лечения, а также в оценке эффективности последнего. Более того, визуализация субклинических проявлений позволяет обнаружить заболевание на ранней стадии.

Эпителий роговицы, являясь многослойным плоским неороговевающим, морфологически состоит из трёх слоёв: поверхностного, промежуточного (крыловидные клетки) и слоя базальных клеток. Средняя толщина всего эпителия составляет приблизительно 50 мкм. Поверхностные клетки полигональной формы, средний диаметр их составляет 40–50 мкм, толщина — 4–5 мкм, имеют чёткие границы, светлое ядро и тёмную цитоплазму (рис. 1, а). Форма и размер промежуточных (крыловидных) клеток вариабельны. Средний их диаметр составляет 30–45 мкм, толщина — около 10 мкм. Плотность промежуточных клеток составляет около 5000 кл/мм2 (рис. 1, b). Базальные клетки имеют чёткие, светлые границы и тёмную цитоплазму. Видимого ядра нет. Диаметр базальных клеток составляет 10–15 мкм, плотность базальных клеток вариабельна и составляет от 3600 до 8996 кл/мм2 (рис. 1, с). Клетки базального слоя обладают митотической активностью. Таким образом, диаметр базальных клеток меньше, а плотность их соответственно выше, чем у промежуточных клеток [1, 2].

 

Рис. 1. Конфокальная микроскопия эпителия роговицы (HRT3-RCM): а — поверхностный слой, b — промежуточный слой эпителия, с — базальный слой эпителия

 

Повышенная рефлективность эпителиальных клеток свидетельствует о снижении в них уровня метаболизма и начинающейся их десквамации [3].

При помощи конфокальной микроскопии у пациентов с ССГ возможно оценить не только аномальные морфологические изменения клеток эпителия, но и плотность клеток в его различных слоях. В ряде исследований выявлено снижение плотности поверхностных и промежуточных клеток эпителия у пациентов с ССГ [3, 6, 21]. Так, согласно данным, полученным Erdélyi et al., количество поверхностных и крыловидных клеток в группе с ССГ составило 702–984 и 4612–5444 кл/мм2 соответственно, тогда как в группе контроля — 1026–1398 и 5437–6171 кл/мм2 соответственно [6].

Таким образом, при ССГ имеет место снижение плотности поверхностных и крыловидных клеток.

Количество базальных клеток при ССГ, по данным разных исследований, варьирует. Villani et al. обнаружили увеличение плотности базальных эпителиальных клеток [22]. В свою очередь, Zhang et al. показали значительное снижение плотности базальных клеток эпителия у пациентов с ССГ по сравнению с группой контроля без ССГ: при слабо выраженном ССГ — 9234 ± 1365 кл/мм2, при выраженном ССГ — 8634 ± 998 кл/мм2, в группе контроля — 11307 ± 1876 кл/мм2 [28] .

Боуменова и десцеметова мембраны являются прозрачными структурами, не отражающими свет, поэтому в норме они не визуализируются при конфокальной микроскопии [1].

 

Рис. 2. Десквамация эпителия роговицы (косой срез, HRT3-RCM)

 

Под боуменовой мембраной находится субэпителиальное нервное сплетение. Его нервные волокна, перфорируя боуменову мембрану на уровне базального эпителия, формируют суббазальное нервное сплетение. Волокна последнего идут поверхностно, обеспечивая иннервацию базального эпителиального слоя [1, 2, 3, 8, 17].

Основными критериями оценки нервных волокон являются плотность, ширина, извилистость, рефлективность и ветвление.

Согласно данным Niederer et al., плотность суббазальных нервов уменьшается на 0,9 % ежегодно [16]. Снижение плотности суббазальных нервов было также обнаружено при диабете, инфекционных кератитах, а также после LASIK и PRK [4, 7, 8].

Данные об изменении плотности суббазальных нервов при ССГ неоднозначны. Hoşal et al. и Tuominen et al. не обнаружили изменений плотности суббазальных нервов у пациентов с ССГ [9, 21]. Zhang et al. показали увеличение плотности суббазальных нервов роговицы у пациентов с ССГ по сравнению со здоровыми пациентами (1423,5 ± 609,5 и 1315,7 ± 664,7 мкм/мм2 соответственно). Такие вариабельные данные могут быть связаны с различными стадиями выраженности ССГ у пациентов в исследованиях [27].

Тем не менее, согласно результатам нескольких исследований, при ССГ имеют место увеличение извилистости и повышение рефлективности волокон субэпителиального и суббазального нервных сплетений (рис. 3) [16, 17, 27].

 

Рис. 3. Суббазальные нервные сплетения (HRT3-RCM): a — у здорового пациента, b — у пациента с синдромом сухого глаза

 

При ССГ наблюдается также увеличение количества чёткообразных волокон суббазального нервного сплетения, что может указывать либо на их повреждение, либо на повышение их метаболической активности [3, 21, 22].

На уровне базальных клеток эпителия и боуменовой мембраны визуализируются гиперрефлективные дендритические клетки — клетки Лангерганса. Плотность их в центре составляет 34 ± 3 кл/мм2 и 98 ± 8 кл/мм2 — на периферии. Клетки Лангерганса (КЛ) — эпителиальные дендритные клетки, являющиеся антиген-презентирующими клетками роговицы. Они являются важной составляющей защитных сил, которые способны ограничивать воспаление путём активации Т-лимфоцитов и других иммунных клеток. Распространение КЛ уменьшается по направлению от периферии к центру. КЛ располагаются преимущественно вблизи волокон суббазального нервного сплетения [1, 4, 11].

Согласно данным, полученным H. Lin et al., при ССГ имеет место повышение плотности КЛ по сравнению с группой контроля (89,8 ± 10,8 и 34,9 ± 5,7 кл/мм2 соответственно). Кроме того, увеличение отростков у КЛ может указывать на предполагаемую их активацию. В норме КЛ с множеством отростков наблюдается преимущественно на периферии, тогда как при ССГ количество этих клеток увеличивается в центре (рис. 4) [4, 11].

 

 

  Рис. 4. Множественные дендритические клетки в оптическом центре у пациента с синдромом сухого глаза (HRT3-RCM)

 

Строма роговицы составляет 90 % всей толщины роговицы. Состоит из коллагеновых волокон, промежуточного вещества и кератоцитов. Коллагеновые волокна и промежуточное вещество прозрачны и не видны при конфокальной микроскопии. Диаметр ядер кератоцитов варьирует от 5 до 30 мкм, в передней строме имеют форму боба, в задней строме — форму овала (рис. 3 a, b). Плотность кератоцитов наибольшая в передней строме (рис. 5) [10, 12, 14].

 

Рис. 5. Конфокальная микроскопия стромы роговицы (HRT3-RCM): a — передняя строма роговицы, b — задняя строма роговицы

 

Характерных изменений стромы роговицы при ССГ описано ранее не было. Единственное, что обращает на себя внимание, по данным нескольких исследований, большое количество гиперрефлективных кератоцитов и межклеточных микровключений (рис. 6). Ряд авторов считают эти кератоциты «активированными», или «стрессовыми». Плотность «активных» кератоцитов выше у пациентов с ССГ и эндокринной офтальмопатией [23]. Однако нет единого мнения о том, что означает гиперрефлективность — апоптоз кератоцитов, активный метаболический процесс или неточность метода.

 

 

Рис. 6. Гиперрефлективные межклеточные микровключения, «активированные» кератоциты (HRT3-RCM)

 

Эндотелий представляет собой монослой гексагональных клеток с тёмными границами и светлой цитоплазмой (рис. 7). Ядра клеток обычно не визуализируются. Диаметр клеток в среднем составляет 20 мкм [1, 10, 14].

 

Рис. 7. Конфокальная микроскопия эндотелия роговицы (HRT3-RCM)

 

Применение конфокальной микроскопии позволяет в режиме реального времени оценить неинвазивно in vivo гистологическую структуру роговицы, лимба и конъюнктивы. Таким образом, при различных заболеваниях тканей глазной поверхности метод может быть использован не только с диагностической целью, но и с целью мониторинга течения заболевания и оценки эффективности лечения. Исследование эпителия роговицы у пациентов с ССГ демонстрирует значительное его повреждение [9]. Повреждение эпителия роговицы может быть связано с гиперосмолярностью слёзной плёнки, которая является следствием повышения испарения слёзной плёнки. Последнее может быть связано как с морфологическими, так и с воспалительными изменениями эпителия роговицы [19, 26]. Состояние стромы роговицы требует дальнейшего изучения. Отдельного внимания заслуживает состояние нервов роговицы. Конфокальная микроскопия демонстрирует значительные изменения суббазальных нервных сплетений у пациентов с ССГ. Неинвазивная оценка иммунных клеток роговицы стала возможна благодаря конфокальной микроскопии. При ССГ это особо актуально ввиду доказанной роли воспаления в развитии заболевания.

 

Рис. 8. Дендритические клетки (Лангерганса)

 

Рис. 9. Очаги десквамации поверхностного эпителия

 

Рис. 10. Гиперрефлективные межклеточные микровключения

 

Рис. 11. Уплотнение боуменовой мембраны

 

Рис. 12. Извитость суббазальных нервных волокон

 

Рис. 13. Гранулоподобные структуры суббазальных нервных волокон

 

Учитывая все вышеизложенные данные, нами был разработан алгоритм оценки состояния тканей глазной поверхности при помощи конфокальной микроскопии in vivo, представленный ниже (табл. 1).

 

Таблица 1. Алгоритм оценки состояния тканей глазной поверхности при помощи конфокальной микроскопии in vivo

Table 1. Ocular surface assessment algorithm with confocal microscopy in vivo

Плотность клеток (на мм2)
Показатель	крыловидных клеток эпителия	базальных клеток эпителия	кератоцитов
			передней стромы	задней стромы
Дендритические клетки (Лангерганса)	– /+ /++/ +++
Очаги десквамации поверхностного эпителия	– /+ /++/ +++
Гиперрефлективные межклеточные микровключения	–/+ /++/ +++
Уплотнение боуменовой мембраны	– /+ /++/ +++
Общая длина суббазальных нервных волокон в поле зрения, мм*
Извитость суббазальных нервных волокон*	– /+ /++/ +++
Гранулоподобные структуры суббазальных нервных волокон	– /+ /++/ +++
* Данные показатели могут быть количественно определены с помощью полуавтоматического аналитического программного обеспечения CCMetrix Image Analysis Software v. 1.1

 

Авторы надеются, что применение данного алгоритма может быть полезно как в клинической работе с пациентами с заболеваниями тканей глазной поверхности, так и при проведении различных научных сравнительных исследований, при которых требуется детальная количественная оценка изменений роговицы.

Об авторах

Виталий Витальевич Потёмкин

ФГБОУ ВО «ПСПбГМУ им. И.П. Павлова» Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: potem@inbox.ru

канд. мед. наук, доцент кафедры офтальмологии

Россия, Санкт-Петербург

Татьяна Сергеевна Варганова

СПб ГБУЗ «Городская многопрофильная больница № 2»

Email: varganova.ts@yandex.ru

врач-офтальмолог

Россия, Санкт-Петербург

Елена Владимировна Агеева

ФГБОУ ВО «ПСПбГМУ им. И.П. Павлова» Минздрава России

Email: ageeva_elena@inbox.ru

клинический ординатор, кафедра офтальмологии

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы