Сравнительная оценка цитотоксичности антимикробных глазных капель фторхинолонового ряда и её влияние на биодоступность препаратов

Полный текст

Выбор антибактериальных глазных капель является важным этапом профилактики послеоперационных инфекционных осложнений. Фторхинолоны различных поколений занимали и продолжают занимать существенное место в профилактике эндофтальмитов после проведения офтальмохирургических операций. Глазные капли, содержащие в качестве международного непатентованного названия (МНН) ципрофлоксацин, офлоксацин и левофлоксацин, достаточно давно используются в офтальмологии. В последние годы из-за развития резистентности микроорганизмов к фторхинолонам «ранних» поколений во многих клиниках мира офтальмохирурги стали использовать в своей практике фторхинолоны IV поколения — моксифлоксацин и гатифлоксацин, а также безифлоксацин, который в настоящее время имеет ограниченное применение пока только в Североамериканском регионе [4]. Помимо широты спектра и активности антибактериальных препаратов (АБП), а также их фармакодинамических и фармакокинетических особенностей важным аспектом для их выбора является наличие или отсутствие консерванта в его составе. Выбирая антибактериальные глазные капли для профилактики послеоперационных осложнений после офтальмохирургических операций, необходимо учитывать скорость достижения минимальных пороговых концентраций (МПК) во влаге передней камеры, которая может зависеть от цитотоксического действия консерванта на эпителиальные клетки роговицы. Оценка цитотоксичности лекарственных препаратов в рамках стандартов Надлежащей лабораторной практики (GLP) является необходимым доклиническим этапом их исследования [19]. Под цитотоксичностью понимают появление патологических изменений в клетках при действии физических, химических и биологических агентов. В зависимости от силы воздействия возможна широкая гамма изменений, ограниченная, с одной стороны, цитостатическим эффектом, а с другой — цитоцидным эффектом, ведущим клетку к гибели [18, 20].

Анализ научных публикаций, в которых приводятся сравнительные данные по оценке токсического воздействия офтальмологических фторхинолонов на различные клеточные структуры глаза, показал, что в настоящее время нет единого мнения по данному вопросу [8]. В отдельных работах цитотоксичность антибактериальных глазных капель связывают с наличием в их составе бензалкония хлорида (БАХ). Данный консервант, как известно, может оказывать цитотоксическое воздействие на эпителий роговицы [13, 17]. Другие авторы считают, что сама молекула АБП может оказывать цитотоксическое действие [6].

Цель данного исследования состояла в сравнении общего цитотоксического действия на эпителий роговой оболочки и биодоступности трёх антибактериальных глазных капель фторхинолонового ряда, зарегистрированных в Российской Федерации: 1) Офтаквикс™ (левофлоксацин 5 мг/мл; консервант БАХ 0,05 мг/мл; производитель «АО Сантэн», Финляндия), далее — «левофлоксацин (оригинальный)»; 2) Сигницеф® (левофлоксацин 5 мг/мл; консервант БАХ 0,1 мг/мл; производитель «Сентисс Фарма Пвт. Лтд.», Индия), далее — «левофлоксацин (дженерик)»; 3) Вигамокс® (моксифлоксацин 5 мг/мл; без консервантов; производитель «Алкон Лабораториз Инк.», США), далее — «моксифлоксацин» — и определении возможного влияния наличия консерванта (в различной концентрации) или его отсутствия на достижение МПК антибиотика во влаге передней камеры глаза (ВПКГ).

Материалы и методы

В настоящее время не существует стандартных методик по определению цитотоксичности глазных капель, в том числе антибактериальных. Исторически сложилось, что токсикологическая экспертиза проводится на основании данных острых, подострых, хронических и других специальных исследований на теплокровных животных [3]. До недавнего времени токсикологические исследования на животных считались «золотым стандартом», однако эти исследования являются трудоёмкими и дорогостоящими, они травмируют подопытных животных и приводят к их гибели. Поэтому в последние годы всё чаще обосновываются предложения о разумном сочетании экспериментов in vivo, in vitro и in silico (компьютерное моделирование) для оптимизации оценки цитотоксичности лекарственных препаратов и биологически активных веществ [2]. Интерес к исследованиям in silico постоянно повышается с этической точки зрения, так как это позволяет уменьшить количество используемых животных для биологического тестирования. Преимущество метода компьютерного моделирования состоит в том, что он является достаточно информативным для оценки общей цитотоксичности лекарственных препаратов, позволяет проводить количественную оценку их цитотоксичности и имеет практическое значение при выборе и обосновании применения лекарственных препаратов, хотя и осложняется наличием структурной и функциональной гетерогенности клеток и не может быть использован для раскрытия точных молекулярных механизмов действия лекарственных препаратов.

Методы оценки воздействия тестируемых антибактериальных препаратов на клетки

Для определения цитотоксичности АБП на эпителиальный клеточный пласт использовали количественные и качественные методы оценки:

• количественная оценка — метод конфокальной микроскопии, исследование проводилось с помощью конфокального микроскопа Сonfoscan-4;
• качественная оценка — определение плеоморфизма и плеомегатизма под конфокальным микроскопом Сonfoscan-4 с фотофиксацией изображения одной точки объекта и последующим построением изображения путём сканирования.

Конфокальная микроскопия роговицы была проведена 30 пациентам до и после закапывания антибактериального препарата в конъюнктивальную полость. Было сформировано три группы по 10 человек. Пациентам первой группы закапывали 0,5 % раствор моксифлоксацина (Вигамокс), пациентам второй и третьей групп 0,5 % раствор левофлоксацина (Офтаквикс и Сигницеф соответственно). Первое исследование проводилось до закапывания глазных капель, повторное исследование после инстилляции глазных капель фторхинолонового ряда по схеме. Определяли количественное состояние клеток эпителия роговицы, их плеоморфизм и плеомегатизм. Демографические данные исследуемых пациентов по группам представлены в табл. 1.

 

Таблица 1. Распределение пациентов, участвующих в исследовании по возрасту и полу

Table 1. Distribution of examined patients according to age and sex

Пациенты	Антибактериальные препараты
	Группа 1Вигамокс(моксифлоксацин 0,5 %)	Группа 2Офтаквикс(левофлоксацин 0,5 %)	Группа 3Сигницеф(левофлоксацин 0,5 %)
Средний возраст (max/min) Женщины, n (%) Мужчины, n (%)	68,1 (43/85) 22 (73,3) 8 (26,7)	60,3 (39/73) 14 (46,7) 16 (53,3)	68,2 (40/89) 12 (40) 18 (60)

 

Метод определения минимальных пороговых концентраций тестируемых антибактериальных препаратов во влаге передней камеры

Для определения МПК исследуемых АБП во влаге передней камеры применялись методы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в сочетании с масс-спектрометрическим детектированием (МС).

Особенностью анализа проб содержимого влаги передней камеры является необходимость обнаружения малых концентраций целевых веществ, что при традиционных подходах затруднительно ввиду малого количества анализируемого образца и вследствие этого невозможности проведения процедур концентрирования. Для этого была использована эффективная методика количественного анализа, позволяющая работать с малым объёмом биоматериала [4]. Биодоступность исследуемых АБП оценивали на основании сравнения концентраций, определяемых в ВПКГ.

В исследование было включено 90 пациентов, которые были распределены на три группы по 30 человек. Пациентам первой группы закапывали 0,5 % раствор моксифлоксацина (Вигамокс), пациентам второй и третьей групп 0,5 % раствор левофлоксацина (Офтаквикс и Сигницеф соответственно). Пациентам всех трёх групп антибактериальные капли закапывали в день операции, за один час до начала операции, четырёхкратно по 1 капле с интервалом 15 минут. Перед началом факоэмульсификации (ФЭК) с помощью инсулинового шприца отбирали 0,1 мл ВПКГ для дальнейшего исследования концентрации АБП. Использовали метод ВЭЖХ-МС/МС, который проводили на жидкостном хромато-масс-спектрометре Shimadzu LCMS-2010EV (ESI-ионизация в электроспрее) на колонке для жидкостной хроматографии Agilent Extend C-18.

Условия хроматографического разделения: объёмная скорость подвижной фазы через колонку — 0,25 см3/мин; объём вводимой пробы — 0,005 см3; температура термостата колонки — 40 °C; состав подвижной фазы: компонент А — 0,2 % раствор муравьиной кислоты в дистиллированной воде и компонент Б — ацетонитрил.

Условия работы масс-селективного детектора: давление газа-осушителя — 0,1 МПа, скорость газа-распылителя — 1,5 л/мин, температура нагревателя — 200 °C, температура CDL — 200 °C, напряжение на электроспрее — 4000 В, напряжение на электронном умножителе — 1500 В, детектирование по отдельным ионам (SIM) в положительной ионизации.

Материалы обработаны статистически с помощью программы Statistica 6,0.

Результаты

Масс-хроматограмма и масс-спектры левофлоксацина и моксифлоксацина приведены на рис. 1.

 

Рис. 1. Масс-хроматограмма и масс-спектры левофлоксацина и моксифлоксацина: а) масс-хроматограмма левофлоксацина и моксифлоксацина; b) масс-спектр левофлоксацина; c) масс-спектр моксифлоксацина

 

Сравнение концентраций трёх антибактериальных препаратов в ВПКГ показало, что в группе пациентов, которым закапывали левофлоксацин (Сигницеф), средняя концентрация антибиотика в ВПКГ составила 1,5 мкг/мл. В группе пациентов, которым закапывали левофлоксацин (Офтаквикс), средняя концентрация равнялась 0,9 мкг/мл (рис. 2), средняя концентрация моксифлоксацина (Вигамокса) в ВПКГ у пациентов перед ФЭК составила 1,0 мкг/мл (см. рис. 1). Максимальная концентрация антибиотика Сигницеф в ВПКГ составляла 1,55 ± 0,86 мкг/мл через 30–60 мин и 1,29 ± 1,08 мкг/мл через 60–120 мин после закапывания препарата. Профилактическое закапывание антибактериальных капель до 30 мин перед ФЭК, а также за 120–240 мин до начала проведения операции позволило обнаружить более низкие концентрации АБП в ВПКГ — 0,96 ± 0,81 и 0,99 ± 0,72 мкг/мл соответственно.

Данные количественной оценки состояния клеток эпителия роговицы у пациентов 1-й группы (Моксифлоксацин) по данным конфокальной микроскопии представлены на рис. 2.

 

Рис. 2. Данные количественной оценки состояния клеток эпителия роговицы до и после закапывания антибактериального препарата (Моксифлоксацин) у пациентов 1-й группы по данным конфокальной микроскопии

 

Данные количественной оценки состояния клеток эпителия роговицы у пациентов 2-й группы (Левофлоксацин оригинальный) по данным конфокальной микроскопии представлены на рис. 3.

 

Рис. 3. Данные количественной оценки состояния клеток эпителия роговицы до и после закапывания антибактериального препарата (Левофлоксацин оригинальный) у пациентов 2-й группы по данным конфокальной микроскопии

 

Данные количественной оценки состояния клеток эпителия роговицы у пациентов 3-й группы (Левофлоксацин дженерик) по данным конфокальной микроскопии представлены на рис. 4.

 

Рис. 4. Данные количественной оценки состояния клеток эпителия роговицы до и после закапывания антибактериального препарата (Левофлоксацин дженерик) у пациентов 3-й группы по данным конфокальной микроскопии

 

Полученные результаты цитотоксического действия АБП на клетки эпителия роговицы по убыванию токсичности представлены следующим образом: левофлоксацин (дженерик) > моксифлоксацин > левофлоксацин (оригинальный).

ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты оценки цитотоксичности антибактериальных глазных капель фторхинолонового ряда, полученные в данном исследовании, показали, что антибактериальные глазные капли имеют различную степень цитотоксичности. Все протестированные препараты обладали цитотоксическим действием на клетки эпителия роговицы. Нами были установлены различия в достижении минимальных пороговых концентраций, которые коррелировали с данными конфокальной микроскопии о степени цитотоксичности.

 

Таблица 2. Данные качественной оценки состояния клеток эпителия роговицы у пациентов 3-й группы (Левофлоксацин дженерик) по данным конфокальной микроскопии

Table 2. Quantitative assessment of corneal epithelial cells before and after antibiotic drop instillation in 3rd (Levofloxacin generic preparation) group patients according to confocal microscopy data

Пациент	Полимегатизм		Плеоморфизм
	до а/б, ٪	после а/б, %	до а/б, ٪	после а/б, %
1	34,3	47,1	44,6	43,0
2	29,5	24,7	53,5	76,7
3	50,2	63,2	34,7	48,9
4	34,0	32,6	54,2	57,0
5	51,3	35,9	28,6	56,4
6	49,7	51,6	35,1	42,2
7	33,0	26,5	55,2	62,3
8	37,2	29,7	56,3	53,3
9	35,5	28,8	59,2	71,2
10	45,8	76,8	43,2	20,3
Количество клеток: в норме 1650–3200 (кл/мм2). Полимегатизм: в норме больше 30 %. Плеоморфизм: в норме меньше 59,6 %

 

Проникновение антибиотиков в ВПКГ определяется рядом факторов. Эпителий роговицы содержит прочные межклеточные соединения. Таким образом, чтобы проникнуть в переднюю камеру глаза, антибиотик должен обладать способностью проникать непосредственно через гидрофобный эпителий, поэтому жирорастворимые препараты обладают преимуществом. Когда эпителий роговицы повреждён или глаз воспалён, проникновение препарата значительно ускоряется. Если антибиотик или консервант, входящий в состав капель, обладает токсичностью по отношению к эпителию роговицы, проницаемость также может повышаться [12].

Сравнение концентраций трёх АБП (Офтаквикса и Сигницефа с действующим веществом левофлоксацином и Вигамокса с действующим веществом моксифлоксацином) в ВПКГ пациентов показало, что при использовании левофлоксацина (Сигницеф) достигается более высокая средняя концентрация АБП в ВПКГ — 1,5 мкг/мл, чем при использовании других препаратов. По-видимому, это связано с наличием в составе капель Сигницефа гипромеллозы, которая обладает высокой вязкостью, что увеличивает продолжительность контакта АБП с поверхностью конъюнктивы и роговицы. Присутствие бензалкония хлорида в Сигницефе в концентрации, превышающей в два раза концентрацию консерванта основного препарата (Офтаквикс), оказывает воздействие на эпителиальный слой роговицы, что подтверждается данными конфокальной микроскопии и способно повлиять на биологическую доступность лекарственного средства.

 

Таблица 3. Данные качественной оценки состояния клеток эпителия роговицы у пациентов 2-й группы (Левофлоксацин оригинальный) по данным конфокальной микроскопии

Table 3. Quantitative assessment of corneal epithelial cells before and after antibiotic drop instillation in 2nd (Levofloxacin original preparation) group patients according to confocal microscopy data

Пациент	Полимегатизм		Плеоморфизм
	до а/б, %	после а/б, %	до а/б, %	после а/б, %
1	33,4	47,8	59,3	34,3
2	41,5	35,0	52,5	53,4
3	35,2	37,1	48,1	53,3
4	39,6	46,4	53,5	41,4
5	32,8	28,6	59,7	43,1
6	49,0	32,9	37,7	53,9
7	56,5	37,0	31,5	55,1
8	38,8	34,8	47,8	65,2
9	37,5	40,6	52,6	39,7
10	45,8	39,4	49,3	45,3

 

Таблица 4. Данные качественной оценки состояния клеток эпителия роговицы у пациентов 2-й группы (Моксифлоксацин) по данным конфокальной микроскопии

Table 4. Quantitative assessment of corneal epithelial cells before and after antibiotic drop instillation in 2nd (Moxifloxacin) group patients according to confocal microscopy data

Пациент	Полимегатизм		Плеоморфиз
	до а/б, %	после а/б, %,	до а/б, %	после а/б, %
1	38,3	45,5	56,1	35,1
2	39,2	48,4	47,5	47,0
3	35,0	42,0	46,2	38,1
4	32,9	38,7	57,3	38,7
5	43,4	63,4	48,1	20,5
6	33,3	49,9	63,4	47,5
7	46,4	42,8	50,7	43,6
8	38,1	28,5	57,5	56,3
9	36,6	31,6	56,2	53,1
10.	49,1	42,8	36,0	37,9

 

По оценке цитотоксичности антибактериальных глазных капель наши данные во многом совпадают с результатами, опубликованными в зарубежной научной литературе. Проведённые ранее зарубежные исследования показали, что фторхинолоны в различной степени способны подавлять пролиферацию кератоцитов [14] и при высоких концентрациях оказывать цитотоксический эффект на эпителий и эндотелий роговицы [12]. В ранних работах по оценке цитотоксичности фторхинолонов было установлено, что ципрофлоксацин обладал наименьшей цитотоксичностью по отношению к роговичному эпителию в сравнении с норфлоксацином и офлоксацином, а также гентамицином и тобрамицином [9]. В последние годы в научной литературе появились публикации, в которых оценивалась цитотоксичность фторхинолонов III–IV поколений. В экспериментальных исследованиях было установлено, что левофлоксацин является менее токсичным фторхинолоном, чем моксифлоксацин или гатифлоксацин [7]. По данным других авторов, из пяти офтальмологических фторхинолонов левофлоксацин также показал наименьшую цитотоксичность по отношению к клеткам эндотелия роговицы человека и к кератоцитам, а ципрофлоксацин оказался наиболее цитотоксичным [8]. S. Kim et al. (2007) установили, что жизнеспособность эпителиоцитов роговицы человека через 24 часа экспозиции культуры клеток в присутствии левофлоксацина составила 64 %, в то время как только 5 % клеток были жизнеспособными после экспозиции в присутствии моксифлоксацина. Кроме того, оценка миграционной способности клеток показала, что в течение 24 часов в присутствии левофлоксацина реэпителизация проходила на 95 %, что существенно не отличалось от контроля, а для моксифлоксацина этот показатель составил 60 %. Этот факт имеет большое значение, поскольку быстрая реэпителизация роговицы помогает предотвратить вторичное инфицирование глазной поверхности и другие возможные осложнения [11]. Несмотря на опубликованные результаты экспериментальных исследований, свидетельствующие о потенциальной цитотоксичности офтальмологических фторхинолонов IV поколения, в последнее время появляются сообщения, в которых данная информация подвергается сомнению. Так, по данным R. Watanabe et al. (2010), не было установлено статистически достоверных различий между токсичностью левофлоксацина и моксифлоксацина и неблагоприятным воздействием этих АБП на эпителий и эндотелий роговицы здоровых добровольцев. Оба препарата хорошо переносились и были безопасными при инстилляциях. Эти данные согласуются с результатами другого исследования, в котором также не было выявлено достоверных различий в скорости заживления роговицы среди двух групп пациентов, которые в послеоперационном периоде после факоэмульсификации катаракты получали инстилляции глазных капель моксифлоксацина и левофлоксацина, хотя и наблюдалась тенденция к более быстрому темпу эпителизации в группе левофлоксацина [11]. Авторы сделали вывод, что профилактическое применение фторхинолонов IV поколения в форме антибактериальных глазных капель пациентам в послеоперационном периоде не должно вызывать серьёзных опасений по поводу кератотоксичности этих АБП.

ВЫВОДЫ

Представленные в работе результаты исследований по оценке цитотоксичности антибактериальных глазных капель из группы фторхинолонов III–IV поколений демонстрируют, что данные АБП могут оказывать цитостатический эффект в условиях in vivo и отличаются по своему цитотоксическому потенциалу. Анализ и оценку полученных результатов следует экстраполировать на клинические признаки, которые, как правило, являются неспецифическими. Отмена лекарственного средства или его замена на менее токсичный препарат может решить проблему устранения нежелательных реакций, возникающих при использовании глазных капель.

Средняя концентрация фторхинолонов III и IV поколений в ВПКГ у пациентов с катарактой, которым закапывали Офтаквикс и Вигамокс, была одинаковой и составляла соответственно 0,9 и 1,0 мкг/мл. В группе пациентов, которым в качестве профилактики послеоперационных осложнений назначали Сигницеф, средняя концентрация АБП в ВПКГ равнялась 1,5 мкг/мл. Оптимальным временем для профилактического использования АБП при назначении капельных форм непосредственно перед ФЭК для создания терапевтической концентрации АБП в ВПКГ следует считать 30–120 минут до начала проведения операции. Широкое внедрение методики по определению АБП в содержимом влаги передней камеры глаза с помощью метода ВЭЖХ-МС позволит повысить эффективность и безопасность при назначении АБП фторхинолонового ряда. Следует отметить, что у всех исследуемых препаратов, которые принадлежат к фторхинолонам III–IV поколений, средняя концентрация АБП в ВПКГ была в несколько раз выше, чем средняя МПК 90 для штаммов, выделенных от больных, что должно способствовать безопасному течению послеоперационного периода и профилактике инфекционных осложнений.

Об авторах

Тамара Славиковна Хинтуба

ФГБОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова» Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: khintubatamara@gmail.com

аспирант кафедры офтальмологии

Россия, Санкт-Петербург

Юрий Викторович Тахтаев

ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Минздрава России

Email: ytakhtaev@gmail.com

д-р мед. наук, профессор кафедры офтальмологии

Россия, Санкт-Петербург

Игорь Николаевич Околов

Санкт-Петербургский филиал ФГАУ МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Фёдорова

Email: ytakhtaev@gmail.com

канд. мед. наук, заведующий клинико-бактериологической лабораторие

Россия, Санкт-Петербург

Вера Александровна Мотылева

ФГБОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова» Минздрава России

Email: ytakhtaev@gmail.com

врач-офтальмолог, аспирант кафедры офтальмологии

Россия, Санкт-Петербург

Роман Борисович Шлякман

ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Минздрава России

Email: ytakhtaev@gmail.com

врач-офтальмолог, аспирант кафедры офтальмологии

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы