THE VALUE OF MICROBIOLOGICAL MONITORING AND DETERMINING THE MOLECULAR GENETIC CHARACTERISTICS OF HOSPITAL MICROFLORA OF PURULENT OSTEOLOGY DEPARTMENT

Full Text

Актуальность проблемы хирургической инфекции определяется значительной распространенностью заболевания, сложностью этиологической диагностики, тяжестью и длительностью лечения. Несмотря на достижения современной медицины, частота неудовлетворительных результатов лечения хирургической инфекции в целом остается достаточно высокой [1-5]. Традиционные схемы лечения больных основаны на хирургической санации очага в комплексе с антибактериальной терапией. Однако на сегодняшний день процесс лечения многократно усложнился за счет распространения приобретенной антибиотикорезистентности возбудителей [6, 7]. Продолжительность нетрудоспособности, стоимость лечения инфекционных осложнений, высокий процент инва-лидизации определяют социальноэкономическую значимость борьбы с инфекцией в отделениях гнойной хирургии. Материалы и методы В работе проанализированы 434 штамма микроорганизмов, выделенных у 384 пациентов, лечившихся в отделении гнойной остеологии ФГБУ «ПФМИЦ» Минздрава России в течение 2014 года. Среди всех пациентов 193 человека лечились по поводу глубокого нагноения по 45 сле эндопротезирования крупных суставов, 138 больных - по поводу хронического остеомиелита различной локализации, 43 пациента - по поводу синдрома диабетической стопы. Видовая идентификация микрофлоры проводилась на анализаторе iEMS Reader FM (Labsystems, Финляндия) c помощью набора тест-систем (Lachema, Чехия). Анализ видового состава микрофлоры и устойчивости к антибактериальным препаратам осуществляли с помощью компьютерной программы «Микроб-автомат». Антибиотикорезистентность определялась диско-диффузионным методом на агаре Мюллера-Хинтон с помощью сенси-дисков (Bio-Rad Laboratories), минимальные подавляющие концентрации препаратов (МПК) рассчитывали на анализаторе антибиотикограмм «ADAGIO» (Bio-Rad Laboratories) [8]. Выявление генов наиболее распространенных метало^-лактамаз (группы Vim, Imp, NDM) и сериновых карбапене-маз (групп КРС и типы ОХА-48, ОхА-40), а также видоспецифических ОХА-51 осуществляли методом ПЦР с гибридизаци-онно-флюоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме «реального времени» с использованием коммерческих Российский медико - биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2016. Т. 24, № 3 наборов «АмплиСенс MDR MBL-FL», «АмплиСенс MDR КРС/ОХА-48-FL» и «АмплиСенс MDR Acinetobacter ОХА-FL» (ФБУН ЦНИИЭ, Россия). Амплификация проводилась на приборе «Rotor Gene 6000» (Corbet Research, Австралия) в соответствии с методическими указаниями к наборам. Детекция бета-лактамаз расширенного спектра (БЛРС) проводилась с помощью Е-тестов с цефтазидимом и цефтазидим/клавуланатом (Bio Merieux, Франция). Для сравнения зоны задержки использовали штамм E.coli АТСС 25922, не продуцирующий бета-лактамазы и штамм E.coli АТСС 700603, продуцирующий БЛРС. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программы Statistica общепринятыми методами. Результаты и их обсуждение При изучении этиологической структуры возбудителей инфекции в отделении гнойной остеологии выявлено, что в среднем грамположительных микроорганизмов вдвое больше (302 штамма), чем грамотрицательных (132 штамма). Подавляющее число грамположительных бактерий - это стафилококки. Анализ структуры грамотрицатель-ных возбудителей показал преобладание неферментирующих грамотрицательных палочек, энтеробактерии выделялись реже. Среди неферментирующих бактерий чаще выделялась Ps.aeruginosa, а половину энтеробактерий у пациентов с периим-плантной инфекцией и остеомиелитом составила K.pneumoniae. Структура возбудителей инфекции в разных группах пациентов представлена в таблице 1. Таблица 1 Этиология инфекционных процессов у пациентов отделения гнойной остеологии Возбудители инфекции Группы пациентов Периимплантная инфекция Хронический остеомиелит Синдром диабетической стопы S. aureus 77 76 16 S. epidermidis 50 25 9 P.aeruginosa 20 19 12 A.baumanii 15 3 11 K.pneumoniae 11 6 2 E.coli 6 2 4 Proteus spp. 4 3 5 E.cloacae 1 0 5 Enterococcus spp. 10 4 12 Из общего числа 203 микроорганизмов, выделенных у пациентов с периим-плантной инфекцией, стафилококки составили 62,5%, при этом золотистых стафилококков было выделено 77 изолятов, коагулазонегативных - 50 штаммов. Ме-тициллинрезистентные штаммы среди S.aureus (MRSA) составили 33,7%, среди коа-гулазонегативных стафилококков (MRSE) -32%, т.е. можно сказать, что среди всех стафилококков - возбудителей периим-плантной инфекции - каждый третий изо-лят является госпитальным штаммом. Второе место по частоте выделения занимают неферментирующие грамотри-цательные палочки (28,0%), среди которых 20 изолятов составили P.aeruginosa и 15 - A.baumanii. Далее следуют энтеробактерии, которых всего выделено 22 штамма, причем 11 из них - это клебсиел-лы. Энтерококки всегда выделялись в ассоциациях с вышеперечисленными микроорганизмами, а не самостоятельно. Среди неферментирующих грам-отри-цательных палочек значительное количество штаммов отличались устойчивостью к различным антибактериальным препаратам. 46 Российский медико - биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2016. Т. 24, № 3 /> «V Л>- Р JS ^. s' öf .* /•Vs -о гг At ЛГ J? /VV J' <?У* Ц 32,5% тщщ- Щ 56,2% Ц 82,1% T4TJ%~ Ц 79,3% Г3Э^ J 36,0% Ц 68,5% 78,2% 3 48,1% ТЇ4Ж J22,1% I 61,4% ZU 68,4% 24,1% И 22,5% J 29.5% 51,4% 59,3% 57,6% 0% 20% 40% 60% 80% 100% □ Резистентность A.baumanii □ Резистентность Ps.aeruginosa Рис. 1. Резистентность неферментирующих грамотрицательных бактерий, выделенных у пациентов с периимплантной инфекцией Проведенные молекулярно генетические исследования показали, что 4 изолята P.aeruginosa среди выделенных штаммов являлись продуцентами метал-ло-бета-лактамаз VIM группы и 1 - КРС группы. Из 15 штаммов A.baumanii у 9 изолятов выявлено наличие генов ОХА-40 подобных карбапенемаз. Среди энтеробактерий также встречались полирезистентные штаммы. 8 штаммов Klebsiella pneumoniae были по-лирезистентными в отношении трех и более классов антибактериальных препаратов. Фенотип резистентности Klebsiella pneumoniae представлен на рисунке 2. 4 УФА 1,3% 1,2% ] 2,7% 32,7% 2 30,6% I 97,0% I 87,4% I 89,4% 81,3% 94,1% ■if 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% у □ Резистентность Klebsiella pneumoniae Рис. 2. Резистентность Klebsiella pneumoniae - возбудителей периимплантной инфекции 47 Российский медико - биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2016. Т. 24, № 3 Все полирезистентные штаммы Klebsiella pneumoniae продуцировали бе-та-лактамазы расширенного спектра, продуцентов метало-бета-лактамаз среди клебсиелл не было выявлено. Анализ 148 штаммов микроорганизмов, выделенных у пациентов с хроническим остеомиелитом, показал, что подавляющее большинство изолятов (68,2%), также как у больных с периимплантной инфекцией, составили стафилококки, из них 76 штаммов - S.aureus и 25 - S.epidermidis. Среди золотистых стафилококков было 20 штаммов MRSA, а среди коагулазонегативных - 10 штаммов MRSE, т.е. третья часть всех стафилококков, выделенных при остеомиелите, были поли-резистентными. Из 23 неферментирующих грамотри-цательных палочек (22,9% всех микроорганизмов), выделенных у пациентов с обострением хронического остеомиелита, подавляющее большинство - 19 штаммов - составили P.aeruginosa, три штамма A. baumanii и один штамм Alcaligenes faecalis. Фенотип резистентности синегнойных палочек у пациентов с остеомиелитом в анализируемый период имел свои отличия (рис. 3). „їй J 1 * . •f J? <че<? o* H Л0 »° 4.° ' V/ \ W ; -J лг # J. . o* ^ ^ ^ 1 0,0% 0,0% 0,0% 0% ✓ 7,8% 16,2% 15,7% 23,1% 25,0% 38,5% 7,7% 7,7% 15,6% 15,4% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35% 40% 45% □ Резистентность синегнойных палочек Рис. 3. Резистентность синегнойных палочек, выделенных у пациентов с хроническим остеомиелитом Как видно из рисунка, резистентность штаммов P.aeruginosa, выделенных из остеомиелитических очагов, ниже резистентности изолятов P.aeruginosa, обнаруженных при периимплантной инфекции. У двух полирезистентных штаммов выявлен ген, кодирующий продукцию ме-талло-бета-лактамаз VIM группы. Три штамма A.baumanii, выделенные у пациентов с хроническим остеомиелитом, были полирезистентными и фенотипически не отличались от таковых у пациентов с пе-риимплантной инфекцией, кроме того, у них выявлен ген, кодирующий продукцию ОХА-40 подобных карбапенемаз. Фенотип и генотип резистентности энтеробактерий при остеомиелите не отличался своеобразием. Четыре из шести клебсиелл и один штамм из двух выделенных E.coli продуцировали БЛРС, проявляя резистентность ко всем цефалоспоринам, фторхино-лонам и тикарциллину/клавуланату. 48 Российский медико - биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2016. Т. 24, № 3 Группа больных с синдромом «диабетической стопы» была самой немногочисленной по сравнению с другими группами пациентов, получавших лечение в отделении гнойной остеологии в отчетный период. Из «диабетических очагов» было выделено 83 микроорганизма, среди которых стафилококки составили 30,1%, что в два раза меньше, чем у пациентов с другими заболеваниями в этом отделении. Золотистых стафилококков обнаружено 16 штаммов, из них 6 - метициллинрезистентных, коагулазонегативных изолятов было 9, из них 4 - метициллинрезистентных, т.е. более трети всех стафилококков являются «проблемными» и требуют для эрадикации специальной антибактериальной терапии. Грамотрицательных палочек у пациентов с синдромом «диабетической стопы» было выделено вдвое больше (48,4%), чем у других пациентов, большинство из них (23 штамма) составили неферментирующие бактерии и 16 штаммов - энтеробактерии. Среди грамотрицательных неферментирующих бактерий было 12 изо-лятов P.aeruginosa и 11 A.baumanii. Фенотип резистентности неферментирующих палочек представлен на рисунке 4. nF /У> Ч®85 Ч®85 ^ * VV /у о®V у/ / /уJ /Л4 ,iy «W # от ^ V Л * .<г° ^ 0% ✓ 82,1% ІІІІІІІІІІІІІІІІІІІІІІІІІІІІІІІІІІШ 58,0% ,1% ■ 51,6% 50,0% 75,4% 20% 40% 60% 80% 100% □ Резистентность A.baumanii а Резистентность Ps.aeruginosa Рис. 4. Резистентность неферментирующих грамотрицательных бактерий, выделенных у пациентов с синдромом диабетической стопы Более половины всех неферментирующих бактерий были резистентны к цефалоспоринам III-IV поколений. К цеф-тазидиму устойчивость проявляли 40,1% штаммов A.baumanii, в то же время к до-рипенему среди ацинетобактеров были устойчивы половина изолятов. Все карба-пенемрезистентные штаммы исследованы на наличие бета-лактамаз. Результаты мо 49 лекулярных исследований показали, что два штамма Ps.aeruginosa экпрессировали ген, кодирующий продукцию метало-бета-лактамаз Vim-типа, а у трех штаммов A.baumanii выявлен ген ОХА-40 подобных карбапенемаз. Группу энтеробактерий, выделенных у пациентов с синдромом «диабетической стопы», составили 5 изолятов Enterobacter Российский медико - биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2016. Т. 24, № 3 cloacae, 5 изолятов Proteus spp., 4 штамма E.coli и 2 штамма Klebsiella pneumoniae. Три штамма энтеробактерий - обе клеб-сиеллы и одна кишечная палочка - продуцировали БЛРС, остальные изоляты отличались хорошей чувствительностью к антимикробным препаратам разных классов. Анализ возбудителей инфекции у пациентов отделения гнойной остеологии показал, что чаще других микроорганизмов выделяются стафилококки. Молекулярногенетические исследования свидетельствуют о высокой частоте обнаружения mecA гена как у золотистых, так и коагулазонега-тивных стафилококков, подтверждая фенотип метициллинрезистентных штаммов. В целом антибиотикорезистентность стафилококков у пациентов с разной патологией была практически одинаковой. Анализируя устойчивость синегнойных палочек в отношении антимикробных препаратов, следует отметить, что полире-зистентные штаммы чаще выделялись у пациентов с периимплантной инфекцией, чем у пациентов с хроническим остеомиелитом и синдромом диабетической стопы. Та же закономерность наблюдалась у выделенных A.baumanii. Возбудители пери-имплантной инфекции нередко обладают фенотипом полирезистентных госпитальных микроорганизмов. Все более широкое назначение карбапенемов ведет к увеличению числа карбапенемрезистеных штаммов среди грамотрицательных микробов, что еще раз подчеркивает необходимость тщательного анализа фенотипа и генотипа полирезистентных штаммов для назначения адекватной антибиотикотерапии. В силу большого количества бета-лактамаз продуцирующих штаммов среди энторобактерий, особенно среди клебси-елл, назначение цефалоспоринов, включая цефепим, не может рассматриваться как рациональная терапия. Для полноценной эрадикации энтеробактерий также необходимо привлечение молекулярно-генетических методов исследования, позволяющих наиболее тщательно подобрать антимикробный препарат. Заключение Таким образом, пациентов отделения гнойной остеологии, несмотря на различные нозологические формы, объединяют основные возбудители инфекционных процессов. Чаще других микроорганизмов выделяются S.aureus и S.epider-midis, третья часть из которых экспрессируют ген mec A, а значит, обладают высокой перекрестной устойчивостью ко всем ß-лактамам и ассоциированной устойчивостью к антибиотикам других групп. Наибольшую антистафилококовую активность в отношении этих стафилококков показали ванкомицин и линезолид. Второе место по частоте выделения занимают неферментирующие грамотрицательные палочки - Ps.aeruginosa и A.baumanii, в значительной доле случаев полирезисте-ные к антимикробным препаратам. Максимально активными для эрадикации Ps.aeruginosa и A.baumanii были карбапе-немы и цефоперазон/сульбактам. В рамках одного отделения для купирования инфекции без тщательного микробиологического анализа крайне сложно назначить адекватную рациональную антимикробную терапию. В терапии инфекционных процессов у пациентов отделения гнойной остеологии предпочтительной может быть комбинированная антибактериальная терапия, которая эффективна в отношении полирезистентных штаммов особенно при хронической или рецидивирующей инфекции.

References

Supplementary files