Research flow cytometric of the DNA content in tumor cells of lung cancer patients with paraneoplastic rheumatic syndrome

Full Text

Как известно, большинство злокачественных опухолей состоит из гетероплоидных популяций клеток, которые характеризуются изменениями структуры и количества хромосом (анеуплоидия и полиплоидия) и соответственно изменением содержания ДНК в ядрах клеток [1, 12]. Так, полиплоидные опухоли чаще всего более злокачественные, чем диплоидные, они более инвазивны, быстрее растут и метастазируют [2, 8]. При этом клетки полиплоидных опухолей обладают большей жизнеспособностью и приспособительной реакцией к разнообразным условиям микроокружения [13, 14]. Современный метод проточной ДНК-цитометрии позволяет с высокой точностью произвести анализ большого количества клеток и определить различные показатели клеточного цикла. В основе метода лежит измерение флюоресценции специальных красителей (маркеров), избирательно связывающихся с ДНК [3, 5]. Результаты современных ретроспективных и проспективных исследований свидетельствуют о том, что показатели содержания ДНК определенные с помощью проточной цитометрии характеризуют степень гетероплоидности клеток опухоли и их пролиферативную активность. Эти исследования дополняют общепринятые признаками оценки опухолевого процесса (размер первичной опухоли, степень распространения опухоли и др.) и являются существенными прогностическими факторами при многих злокачественных новообразованиях [4, 6, 7, 10]. Как известно, рак легкого относится к высокозлокачественным опухолям. Довольно часто он сочетается с паранеопла-стическим ревматологическим синдромом (ПНРС) [9, 11]. В настоящее время все больший интерес у исследователей вызывает изучение ДНК-цитометрического профиля у больных злокачественными 128 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №4, 2013 г. опухолями, в том числе и раком легкого. Информации относительно анализа содержания ДНК в опухолевых клетках больных раком легкого с наличием ПНРС мы не обнаружили. Цель исследования - определение и сравнительный анализ содержания ДНК в опухолевых клетках больных раком легкого с наличием и без ПНРС. Материалы и методы В исследование вошли 70 больных раком легкого, которые находились на лечении в торакальном отделении Винницкого областного клинического онкологического диспансера. Все больные были разделены на две группы. Первая группа - 40 больных раком легкого без наличия ПНРС, вторая - 30 пациентов с раком легкого с проявлениями ПНРС. Забор опухолевого материала осуществлялся во время операций, который до проведения исследования хранился в замороженном состоянии. Содержание ДНК в ядрах опухолевых клеток определяли методом проточной ДНК-цитометрии. Суспензии ядер из опухолевых клеток получали с помощью специального раствора для исследования ядерной ДНК CyStain DNA Step 1 (Partec, Германия) согласно протокола-инструкции фирмы производителя. Данный раствор позволяет маркировать ядерную ДНК диа-мидинофенилиндолом (DAPI), который входит в его состав. В процессе приготовления нуклеарных суспензий использовались специальные одноразовые фильтры CellTrics 50 мкм (Partec, Германия). Регистрацию данных выполняли на многофункциональном научно-исследовательском проточном цитометре "Partec PAS" (Partec, Германия) с применением программного обеспечения FloMax (Partec, Германия) в научно-исследовательском центре Винницкого национального медицинского университета имени Н.И. Пирогова. Для возбуждения флюоресценции DAPI применялось УФ-излучение. С каждого образца нуклеарной суспензии анализу подвергалось 20 тыс. событий. Циклический анализ клеток выполнялся средствами про граммного обеспечения Modfit LT for Windows 4.0 (Verity Software House, USA). Определяли показатели: количество диплоидных и анеуплоидных клеток в образце (%), распределение клеток каждой популяции по фазам клеточного цикла (G0G1, S, G2 + M). Также вычисляли специальные индексы, которые характеризуют ДНК ане-уплоидию: DI (индекс ДНК - характеризует отношение интенсивности флюоресценции пика анеуплоидных клеток к диплоидному), CI (клеточный индекс) и AI (индекс ане-уплоидии) [10]. CI = AnC / (AnC + DiC) и AI = (AnC х DI + DiC х 1) / (AnC + DiC), где AnC - количество анеуплоидных клеток в G0G1 фазе по отношению к общему количеству анеуплои-дных клеток; DiC - количество диплоидных клеток в G0G1 фазе по отношению к общему количеству диплоидных клеток. Исследование апоптоза (фрагментации ядерной ДНК) выполнено путем выделения SUB-G0G1 участка на ДНК-гистограммах перед пиком G0G1, указывающего на ядра клеток с содержанием ДНК < 2c. Для оценки количественных результатов исследования определяли значение среднего (М) и ошибку среднего (m) -M±m. Для сравнения средних показателей двух различных исследуемых групп использовали параметрический t-критерий Стьюдента. Статистическую обработку проводили с помощью программного обеспечения для статистического анализа "Biostat" и "MS Ехсєі XP". Результаты и их обсуждение При проведении анализа показателей проточной ДНК-цитометрии опухолевых клеток больных раком легкого установлено наличие отличительных молекулярнобиологических характеристик этих опухолей в зависимости от наличия ПНРС. Так выявлено, что при диплоидном варианте опухоли, статистически достоверной между двумя группами является разница в содержании клеток в G0G1 и S фазах клеточного цикла (табл. 1). Количество опухолевых клеток в G0G1 фазе клеточного цикла у больных раком легкого без ПНРС составляло 87,09±1,69 %, в то время как у 129 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №4, 2013 г. больных раком легкого с наличием ПНРС значение этого показателя было меньше на 9,04 % (р<0,05) и составляло 79,87±1,82 %. Параллельно, уменьшение содержания клеток в G0G1 фазе клеточного цикла сопровождается повышением содержания клеток в S и G2 + M фазах. Так, у больных раком легкого с наличием ПНРС содержание опухолевых клеток в S фазе было в 2,21 раза больше (р<0,01) чем у пациентов без данного синдрома - 13,99±1,43 % и 6,33±1,66 % соответственно. Это свидетельствует о повышенной пролиферативной активности опухолевых клеток больных второй группы. Если сравнивать распределение опухолевых клеток больных раком легкого по фазам клеточного цикла при анеуплоид-ном варианте опухоли видно, что общее количество диплоидных клеток у больных второй группы (51,94±3,47 %) на 23,01 % меньше (р<0,05), чем у больных первой группы (13,99±1,43 %). Соответственно и общее содержание анеуплоидных клеток (48,06±3,47 %) у пациентов раком легкого с наличием ПНРС на 33,09 % больше (р<0,05) нежели у пациентов раком легкого без данного синдрома (36,11±2,72 %). Также следует отметить, что содержание опухолевых клеток в S-фазе (30,37±2,20 %) у больных раком легкого с наличием ПНРС на 33,38% больше (р<0,01) нежели у больных без ПНРС (22,77±2,50 %). Анализируя показатели клеточного цикла опухолевых клеток больных раком легкого выявлены следующие изменения связанные с наличием у больных ПНРС (табл. 2). Так, при диплоидном профиле опухоли у больных раком легкого с наличием ПНРС, наблюдается повышенная ДНК-синтетическая и пролиферативная активность опухолевых клеток по сравнению с пациентами без ПНРС. Подтверждение этому - общее содержание клеток в S-фазе (13,99±1,43 %) у больных второй группы в 2,21 раза больше (р<0,01), чем у больных первой группы (6,33±1,66 %). Также было установлено, что при ане-уплоидном профиле опухоли существует достоверная разница между двумя группами в таких показателях, как общее ко личество клеток в S-фазе, апоптотическая активность, индекс ДНК, клеточный индекс и индекс анеуплоидии. Общее количество опухолевых клеток в S-фазе у пациентов раком легкого с наличием ПНРС (18,73±1,78 %) на 51,05 % больше (р<0,05) нежели у пациентов раком легкого без ПНРС (12,4±1,74 %). В тоже время апоптотическая активность опухолевых клеток у больных второй группы была достоверно ниже по сравнению с аналогичным показателем больных первой группы: 6,55±0,88 % и 11,71±1,83 % соответственно, т.е. на 78,78 % (р<0,05). При сравнении значений индексов, которые характеризуют анеуплоидию ДНК (табл. 2), видно, что у больных раком легкого с ПНРС средние значения DI, CI и AI достоверно выше аналогичных показателей больных без данного синдрома. Так, индекс ДНК у больных второй группы (1,78±0,07) был значительно выше на 32,84 % (р<0,01), чем у больных первой группы (1,34±0,08). Также были большими значения и клеточного индекса (0,4±0,04) у пациентов раком легкого с проявлениями ПНРС по сравнению с аналогичным показателем (0,29±0,03) у пациентов без данного синдрома, соответственно на 37,93 % (р<0,05). Значения индекса анеуплоидии у больных второй группы были больше на 18,92 % (р<0,01), чем у больных контрольной группы (1,32±0,04 и 1,11±0,03 соответственно). При анализе ДНК-цитометрических показателей опухолевых клеток больных раком легкого обеих групп, наблюдается следующее. Полученные данные свидетельствуют, что опухоли больных раком легкого с проявлениями ПНРС в отличие от опухолей больных без данного синдрома характеризуются повышенной про-лиферативной активностью с одновременно пониженной апоптотической активностью опухолевых клеток. Также в опухолях больных раком легкого с наличием ПНРС наблюдаются более высокие индексы анеуплоидии ДНК, что дополнительно подтверждает их более злокачественное течение. 130 Таблица 1 Распределение опухолевых клеток больных раком легкого по фазам клеточного цикла в зависимости от наличия ПНРС (M ± m) Характеристика групп больных по профилю опухоли Показатели клеточного цикла, % Диплоидные клетки Анеуплоидные клетки Всего G0G1 S G2 + M Всего G0G1 S G2 + M Рак легкого без ПНРС, n=40 Диплоидный 100 87,09±1,69 6,33±1,66 6,58±0,54 - - - - Анеуплоидный 63,89±2,72 83,37±2,35 7,83±1,84 8,8±2,3 36,11±2,72 59,97±4,76 22,77±2,5 17,26±3,49 Рак легкого с ПНРС, n=30 Диплоидный 100 79,87±1,82** 13,99±1,43* 6,15±0,77 - - - - Анеуплоидный 51,94±3,47** 81,96±2,38 11,14± 1, 8 6,9±1,69 48,06±3,47** 55,13±2,57 30,37±2,2* 14,5±1,4 Примечание: * - р <0,01 относительно показателей соответствующего профиля опухоли у больных первой группы ** - р <0,05 относительно показателей соответствующего профиля опухоли у больных первой группы Таблица 2 ДНК-цитометрические показатели опухолевых клеток больных раком легкого в зависимости от наличия ПНРС (M ± m) Характеристика групп больных по профилю опухоли Общая фаза S, % SUB-G0G1 (апоптоз), % Индекс ДНК, DI Клеточный индекс, CI Индекс анеуплоидии, AI Рак легкого без ПНРС, n=40 Диплоидный 6,33±1,6 11,38±3,03 - - - Анеуплоидный 12,4±1,74 11,71±1,83 1,34±0,08 0,29±0,03 1,11±0,03 Рак легкого с ПНРС, n=30 Диплоидный 13,99±1,42* 8,33±1,26 - - - Анеуплоидный 18,73±1,78** 6,55±0,88** 1,78±0,07* 0,4±0,04** 1,32±0,04* Примечание: * - р <0,01 относительно показателей соответствующего профиля опухоли у больных первой группы ** - р <0,05 относительно показателей соответствующего профиля опухоли у больных первой группы Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №4, 2013 г. Выводы 1. Установлено наличие отличительных молекулярно-биологических характеристик опухолевых клеток, свидетельствующих о более злокачественном течении заболевания у больных раком легкого с проявлениями паранеопластического ревматологического синдромома. 2. В опухолях больных раком легкого с паранеопластическим ревматологическим синдромом наблюдается достоверно более высокая пролиферативная активность опухолевых клеток в отличие от аналогичных показателей у пациентов без паранеоплас-тического ревматологического синдрома (общее количество клеток в S-фазе при диплоидном типе опухоли выше в 2,21 раза, при анеуплоидном - на 51,05 %). 3. Уровень апоптоза (фрагментации ДНК) достоверно ниже на 78,78 % при анеуплоидном типе опухоли у больных с проявлениями паранеопластического ревматологического синдрома в отличие от аналогичных показателей у пациентов без данного синдрома, что может свидетельствовать о более неблагоприятном прогнозе. 4. Более высокие показатели, которые характеризуют анеуплоидию ДНК клеток опухолевой ткани у пациентов раком легкого с паранеопластическим ревматологическим синдромом (DI выше на 32,84 %, CI - на 37,93 %, AI - на 18,92 %), по сравнению с аналогичными показателями у пациентов без данного синдрома, подтверждают у них более высокую агрессивность и злокачественность опухолевого процесса.

References

Supplementary files