Development of HPLC method of ethyl-methylhydroxypyridine succinate quantification in rat and rabbit plasma

Abstract

The methods of ethylmethylhydroxypyridine succinate quantification by HPLC with UV detection in the plasma of rabbits and rats was developed. Techniques are characterized by high accuracy, reproducibility, ease of applying and rapidity of analysis.

Full Text

Оценка динамики плазменной концентрации лекарственных веществ является существенным разделом анализа их фармакокинетики, позволяющим выявить особенности абсорбции, характера распределения, метаболизма и экскреции. Подобные исследования проводятся как на доклиническом этапе разработки лекарственных средств, так и на этапе их клинической апробации, а также после выпуска препарата на рынок с целью оптимизации фармакотерапии [4]. 2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина сукцинат («Мексидол», ООО НПК «Фармасофт», Россия) - оригинальный отечественный синтетический антиоксидант и антигипоксант, обладающий высокой биологической активностью. Наиболее выраженный терапевтический эффект этилметилгидроксипириди-на сукцинат оказывает при сосудистых и дегенеративных заболеваниях головного мозга, таких как ишемический и геморрагический инсульты, транзитор-ная ишемическая атака, дисциркулятор-ная энцефалопатия, болезни Альцгеймера и Паркинсона, травмы головного мозга, судорожные состояния, стрессы, алкогольная энцефалопатия [2]. Для повышения эффективности и безопасности фармакотерапии c использованием этилметилгидроксипиридина сукцина-та актуально дальнейшее исследование особенностей его фармакокинетики: механизмов проникновения в головной мозг через гематоэнцефалический барьер, распределения в различных отделах головного мозга, принадлежности к субстратам, индукторам, ингибиторам семейства цитохромов P450 и белков-транспортеров [7, 9]. В связи с использованием кроликов и крыс в качестве тест-систем для фармакокинетических исследований на доклиническом этапе целью настоящего исследования являлась разработка методики количественного определения этилметилгидрокси-пиридина сукцината в плазме крови кроликов и крыс методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Материалы и методы Исследование выполнено на 15 половозрелых кроликах-самцах породы Шиншилла массой 3500-4300 г, полученных из питомника ООО «Касимов-Миакро» и 30 половозрелых крысах-самцах Wistar массой 220-300 г, прошедших карантинный режим вивария Рязанского государствен- 62 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №1, 2015 г. ного медицинского университета. В ходе эксперимента животных содержали в условиях стандартной экспериментальной биологически чистой комнаты при температуре 22-24оС, естественном освещении, на подстилках из опилок деревьев лиственных пород. Кормление осуществляли ad libitum, в первой половине дня при свободном доступе к воде. Накануне забора крови животных лишали пищи при свободном доступе к воде. Экспериментальные исследования осуществляли в соответствии с правилами лабораторной практики (Приложение к приказу Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 года 708н). Кроликам этилметилгидроксипири-дина сукцинат (препарат «мексидол», ООО НПК «Фармасофт», Россия) вводили per os в дозе 3 таблетки/кролик (в среднем 100 мг/кг массы) [8], крысам - в дозе 200 мг/кг [6]. Через 15 мин; 30 мин; 1; 1,5; 2; 3; 4 и 5 часов после введения препарата у животных забирали кровь в объеме 2,5 мл из ушной вены (у кроликов) или брюшной вены (у крыс под эфирным наркозом) для определения концентрации этилметилгидроксипири-дина сукцината (действующего вещества мексидола). Образцы крови центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин. Полученную плазму хранили при -29°С до последующего анализа. Результаты и их обсуждение Концентрацию этилметилгидрокси-пиридина сукцината в плазме крови кроликов и крыс определяли в изократиче-ском режиме методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с УФ детектированием по оригинальной методике. В работе использовали субстанцию этилметилгидроксипиридина сукцината, предоставленную фирмой-производителем («Фармасофт»). Матричный раствор этилметилгидроксипиридина сукцината с концентрацией 1 мг/мл готовили с использованием метанола (ч. д. а.), из которого готовили растворы стандартных образцов. Для экстракции и элюирования использовали вещества категорий «ХЧ», и «Для хроматографии»: этилацетат («ACROS ORGANICS»), ацетонитрил («ACROS OR-GANICS»), триэтиламин («ACROS ORGANICS»), кислота ортофосфорная («ХИМ-МЕД»), вода деионизированная. Для экстракции этилметилгидроксипиридина сукцината к 1 мл плазмы крови кроликов или крыс добавляли 3 мл этилацетата, встряхивали на приборе Vortex (Elmi, Латвия) и помещали на встряхиватель для пробирок «Shaker» (Elmi, Латвия) на 10 мин, затем центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин. Органический слой упаривали на роторно-вакуумном испарителе (Heidolph instruments, Германия). Сухой остаток растворяли в 300 мкл подвижной фазы и 100 мкл раствора вводили в хроматограф. Анализ проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе «Beckman Coulter» (США), оснащенном авто-самплером «Rheodyne» (США) и УФ спектрофотометрическим детектором «Beckman Coulter» (США) при длине волны 296 нм в изократическом режиме. При анализе использовали хроматографическую колонку - Beckman Coulter (США) 4,6*150 мм (зернение 5 мкм). Температура разделения - 28°С. Скорость потока - 0,5 мл/мин. Подвижная фаза состояла из ацетонитрила и воды в объемном отношении 20:80 с добавлением триэтиламина до объемной доли 0,05% и ортофосфорной кислоты до pH 4,5. Время удерживания этилметилгидроксипиридина сукцината в данных условиях составило 18,1 мин. Количественное определение проводили методом абсолютной калибровки по высоте пиков. Калибровочную кривую получали в результате анализа проб плазмы крови кроликов или крыс с добавками известных количеств стандарта определяемого соединения. Калибровочная зависимость носила линейный характер в диапазоне концентраций 100 - 1000 нг/мл. Данная зависимость для кроликов и крыс описывалась следующими уравнениями: Кролики: C = 10,9747+1,3717*105*h (r = 0,9948), 63 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №1, 2015 г. Крысы: С = 1,6922+1,3796*105*h (r = 0,9926), где h - высота хроматографического пика, С - концентрация этилметилгид-роксипиридина сукцината (нг/мл). Соответствующие калибровочные графики зависимости высоты пика этил-метилгидроксипиридина сукцината от его концентрации в плазме крови кроликов и крыс представлены на рисунках 1 и 2. Экстинкция Рис. 1. Калибровочный график зависимости высоты пика этилметилгидроксипиридина сукцината от его концентрации в плазме крови кроликов Экстинкция Рис. 2. Калибровочный график зависимости высоты пика этилметилгидроксипиридина сукцината от его концентрации в плазме крови крыс Образцы полученных хроматограмм представлены на рисунках 3-4. Пики этилметилгидроксипиридина сукцината отделены от пиков эндогенных соединений, что позволяет достоверно определить исследуемое вещество. Предел количественного определения этилметилгидроксипиридина сукцината для плазмы крови кроликов и крыс составил 40 нг/мл и 20 нг/мл соответственно. 64 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №1, 2015 г. Рис. 3. Хроматограмма пробы интактной плазмы крови кролика Рис. 4. Хроматограмма пробы плазмы крови кролика при однократном введении этилметилгидроксипиридина сукцината В доступной литературе нами обнаружено несколько ВЭЖХ-методик определения концентрации этилметилгидроксипиридина сукцината. В отличие от методики, описанной П.А. Барановым и соавт. (2009) [3], в нашей работе мы применяли не масс-спектрометрический, а более доступный УФ-способ детектирования, а также жидкостную экстракции вместо твердофазной, что позволяет существенно удешевить метод исследования. По сравнению с методиками А.К. Сариева и др. (2005) [5] и С.Б. Середенина и соавт. (2005) [1] использована более простая подготовка проб и изменен состав подвижной фазы. Выводы Разработана хроматографическая методика количественного определения этилметилгидроксипиридина сукцината в плазме крови кроликов и крыс, характеризующаяся высокой точностью, воспроизводимостью, простотой выполнения и быстротой анализа.