THE METHOD OF QUANTITATIVE EVALUATION OF SOME PARA-AMINOPHENOL DERIVATIVES IB PHARMACEUTICAL AND CHEMICO-TOXICOLOGICAL INVESTIGATIONS

Abstract

The materials on the development of analytical methods for paracetamol using a spectrometric technique in the pharmaceutical substance, medicinal forms and biological liquids are presented in the paper.

Full Text

Фармацевтический рынок средств, применяемых для снятия симптомов простуды и гриппа представлен многочисленными препаратами, одним из компонентов которых является парацетамол. Парацетамол входит в состав лекарственных препаратов, выпускаемых в разнообразных формах: порошки («Колдрекс», «Фервекс» для детей и взрослых, «Терафлю» от гриппа и простуды), таблетки («Панадол», «Пенталгин Плюс», «Ринза» и др.), свечи («Цефекон» для детей, «Эффералган» и др.), капсулы («Солпадеин»), суспензии («Детский Панадол»), кроме того в аптеках в свободной продаже имеется парацетамол в виде таблеток [4]. Высокий спрос на данную группу средств объясняется их эффективностью при снятии жара и боли, а также тем, что указанные препараты, имея широкий спектр показаний, являются средствами безрецептурного отпуска [3]. По статистическим данным объем продаж только "Колдрекса" в 2012 году составил 1,47 млрд. рублей, «Фервекса» - 1,18 млрд. рублей, «Терафлю» - 3,8 млрд. рублей [6]. Парацетамол оказывает жаропонижающее и болеутоляющее действие. Препарат применяют самостоятельно или в сочетании с другими средствами при невралгиях, головной боли, простудных забо леваниях. Однако при передозировке возможно поражение печени, а иногда и почек. К приему этого препарата следует с осторожностью относиться пациентам с выраженным астматическим компонентом. Для установления факта отравления и правильного выбора метода детоксикации необходима разработка экспресс-методики количественного определения парацетамола в биологических жидкостях, в частности в моче. Для количественного определения парацетамола фармакопейная статья ГФ XII издания рекомендуют метод нитри-тометрии с внешним индикатором (йод-крахмальная бумага) после кислотного гидролиза субстанции в течение одного часа, что связано с большими временными затратами [2]. Таким образом, актуальной является разработка экспрессной методики количественного определения данного лекарственного вещества, обладающей высокой чувствительностью. Она позволит провести количественное определение парацетамола не только в лекарственных формах, но и в биологических жидкостях организма человека (кровь, моча), что необходимо при химикотоксикологических исследованиях. 130 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №2, 2014 г. Целью работы является разработка унифицированной валидизированной методики количественного определения парацетамола в фармацевтической субстанции, лекарственных формах и биологических объектах. Наличие фенольного гидроксила в структуре парацетамола указывает на возможность последнего вступать в реакции азосочетания с солями диазония с образованием азокрасителя, что и было использовано нами в настоящем исследовании. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: 1. Установить количественное соотношение реагирующих веществ (парацетамола и диазореактива); 2. Осуществить выбор рабочей длинны волны; 3. Установить время устойчивости окраски азокрасителя; 4. Определить чувствительность реакции с целью возможности использования ее при химико-токсикологических исследованиях; 5. Определить диапазон подчинения продукта реакции основному закону све-топоглощения; 6. Провести количественное определение парацетамола в фармацевтической субстанции, лекарственных формах и биологических жидкостях. В основе спектрофотометрического метода количественного определения в видимой области использована реакция спиртового раствора парацетамола с диа-зотированной сульфаниловой кислотой в кислой среде. Материалы и методы Все исследования проводили на фотометре КФК-3 в кюветах с толщиной оптического слоя 10мм при комнатной температуре. В анализе использовали рабочий стандартный образец (РСО) парацетамола (ФС 42-0268-07). Приготовление рабочего стандартного раствора: 0,0200 г (точная навеска) субстанции парацетамола помещали в мерную колбу на 10 мл, растворяли в 5 мл 95%ного спирта этилового, доводили спиртом до метки, хорошо перемешивали. Статистическую обработку экспериментальных данных исследований (р = 95%) проводили с помощью программ StatSoft Statistica 6,0 Microsoft Excel с вычислением граничных значений доверительного интервала среднего результата и определением ошибки единичного определения [1]. Результаты и их обсуждение Установлено, что взаимодействие парацетамола с диазотированной сульфа-ниловой кислотой происходит в стехио-метрических соотношениях 1:1. Для выбора рабочей длины волны готовили спиртовой раствор парацетамола с концентрацией 0,0002г/мл. По истечении 5 минут измеряли оптическую плотность окрашенного продукта реакции при разных длинах волн, относящихся к видимой области спектра (380нм -780нм). Спектр поглощения спиртового раствора парацетамола в видимой области имеет максимум при длине волны 565 нм. При той же длине волны проводили измерения оптической плотности испытуемых растворов и растворов сравнения. Результаты определения устойчивости окраски во времени представлены в таблице 1. Из данных таблицы видно, что в течение 30 минут окраска оставалась устойчивой. Для выявления линейной зависимости между концентрацией фармацевтической субстанции парацетамола и оптической плотностью продукта его реакции с диазореактивом готовили ряд разведений в широком диапазоне концентраций - от 0,0001 г/мл до 0,004 г/мл. Проведенные исследования позволяют сделать заключение, что в выбранном интервале концентраций парацетамола наблюдается подчинение закону Бугера-Ламберта-Бера. На основании полученных данных была разработана следующая методика анализа парацетамола. Методика анализа: 0,2000 г (точная навеска) парацетамола растворяют в 25 мл спирта этилового в мерной колбе вместимостью 100 мл, перемешивают и доводят спиртом объем раствора до метки (раствор А). 131 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №2, 2014 г. Таблица 1 Зависимость оптической плотности азокрасителя от времени Объем раствора парацетамола и его концентрация, г/мл Объем добавляемых реактивов, мл Длина волны, нм Оптическая плотность 5 мин 10 мин 15 мин 20 мин 25 мин 30 мин 0,1 мл; 0,0002 г/мл 2 мл кислоты сульфаниловой, 0.5 мл раствора NaNO2, 4 мл раствора Na2CO3, 1 мл раствора NaOH, спирта до 10 мл 565 0,314 0,316 0,314 0,314 0,314 0,314 В мерную колбу на 10 мл вносят 2 мл 0,4%-ного раствора кислоты сульфа-ниловой, 0,5 мл свежеприготовленного раствора натрия нитрита, 0,1 мл спиртового раствора парацетамола (раствора А), 4 мл 20%-ного раствора натрия карбоната, 1 мл 20%-ного раствора натрия гидроксида и воды очищенной до 10 мл. После перемешивания в течение 10-15 секунд измеряют оптическую плотность испытуемого раствора и стандартного раствора парацетамола на спектрофотометре в максимуме поглощения при 565 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Раствор сравнения - вода очищенная. Относительная погрешность определения находилась в пределах точности спектрофотометрического анализа. Минимальная концентрация парацетамола, определяемая по этой методике, составляет 0,0001 г/мл, что свидетельствует о возможности ее применения не только для анализа фармацевтических препаратов, но и для определения парацетамола в биологических объектах. Следующим этапом исследования явилось определение содержания парацетамола в фармацевтической субстанции и лекарственной форме. Определение проводили в сравнительном аспекте с раствором стандартного образца, поскольку данный метод определения является более точным, надежным и отвечает требованиям Государственной Фармакопеи XII издания. Полученные результаты представлены в таблице 2. Таблица 2 Результаты определения парацетамола в фармацевтической субстанции и лекарственной форме № опыта Объект исследования Найдено Нормы допустимых отклонений Метрологическая характеристика 1. 99,98 Не менее 99,9%, не Хср= 100,02 2. 3. 4. Фармацевтическая субстанция парацетамола 100,20 99,96 99,98 более 101,0% S= 0,1009 Sxср= 0,4512 ε= 0, 0125 5. 99,98 ε a = 100,02 ± 1,25 1. 0,494 [0,470-ь 0,530] ХСр= 0,495 2. 3. 4. Таблетки парацетамола по 0,5 г 0,494 0,497 0,494 S= 0,5530 Sxср= 0,2473 ε= 1,3868 5. 0,494 ε a = 0,495 ± 0,19 132 Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова, №2, 2014 г. Как следует из приведенных в таблице данных, полученные результаты укладываются в нормы допустимых отклонений. Валидация методики показала, что данная методика не отягощена грубой и системной ошибкой, является правильной и позволяет получить воспроизводимые результаты. Разработанная методика была применена в химико-токсикологическом исследовании парацетамола в моче в качестве биологической жидкости [5]. Были изучены условия экстракции парацетамола из водных растворов с целью их использования при разработке оптимальной методики изолирования определяемого вещества из мочи. Установлено, что максимальное количество парацетамола экстрагируется эфиром при рН=7,5 в присутствии натрия хлорида в качестве электролита. Оптимальной оказалась двукратная экстракция по 5 минут. Для приготовления модельной смеси использовали образец мочи, полученный от здорового добровольца. При этом в течении месяца до отбора проб человек не принимал лекарств. Модельные смеси мочи готовили путем добавления к ней определенного объема стандартного спиртового раствора парацетамола с концентрацией 0,0002 г/мл. Приготовленные смеси выдерживали в течении 24 часов при комнатной температуре. Экстракцию парацетамола проводили с соблюдением условий, разработанных для водных растворов определяемого вещества. Сухой остаток, полученный после испарения эфира, исследовали спектрофотометрическим методом в видимой области по методике, разработанной для фармацевтической субстанции исследуемого лекарственного средства. Результаты исследования представлены в таблице 3. Таблица 3 Результаты количественного определения парацетамола в моче Внесено парацетамола мкг/10 мл мочи Найдено Метрологическая характеристика мкг % 40 29,36 73,40 Xc„= 76,63% 40 32,40 81,02 S = 3,27 40 29,80 74,50 S„B = 1,46 40 30,04 75,11 ε = 5,29 40 31,65 79,12 ε a= 76,63±5,29 Выводы Разработана методика количественного определения парацетамола в фармацевтической субстанции и лекарственной форме спектрофотометрическим методом в видимой области спектра. Показана возможность использования данной методики в дальнейших химико -токсикологических исследованиях. Литература