Circulating tumor DNA as specific biomarkers for early diagnosis and prognosis of pancreatic cancer

Full Text

Введение

Аденокарцинома поджелудочной железы (АКПЖ) — злокачественная опухоль, на которую, по статистическим данным, приходится 80 % всех видов новообразований этого органа. В 2018 г. только в Соединенных Штатах и Европе зарегистрировано 133 300 смертей [1, 2], обусловленных АКПЖ, которая занимает третье место как причина смерти от рака в США [3]. В России на конец отчетного 2018 г. количество больных со злокачественными образованиями составило 3 762 218, то есть 2,6 % населения страны, из них 19 837 случаев приходится на рак поджелудочной железы. Летальность при этом заболевании составляет 39,9 % [4]. У пациентов с установленным диагнозом пятилетняя выживаемость зарегистрирована на уровне 5 % [1, 5]. Плохая выживаемость в основном объясняется отсутствием эффективных методов скрининга, поздней диагностикой, склонностью к раннему метастатическому распространению и резистентностью к системной терапии [6–8]. Приблизительно у 80 % пациентов АКПЖ диагностируют на III–IV стадиях, когда опухоль распространяется на чревный ствол, верхнюю брыжеечную артерию или находят отдаленные метастазы, в таких случаях хирургическое лечение уже нецелесообразно [4]. Даже пациенты, которым успешно выполнена хирургическая резекция, часто страдают от местного рецидива, метахронного метастазирования и резистентны к химиотерапии [9, 10].

Методы диагностики, используемые для постановки диагноза, такие как компьютерная томография, магнитно-резонансная томография, эндосонография, определение уровня онкомаркеров СА19-9, РЭА, пункционная биопсия под УЗИ-наведением, которая до сих пор остается золотым стандартом, имеют ряд недостатков и ограничений. Основные минусы этих исследований — ограниченность применения, неудовлетворительная специфичность, зависимость точности исследования от стадии заболевания, отсутствие возможности отслеживать динамику опухолевого процесса в реальном времени. С помощью визуализирующих методов не удается обнаружить ранние поражения или провести различие между доброкачественными и злокачественными поражениями. Онкомаркеры не являются строго специфичными, так как их уровень в крови может повышаться в результате клинических ситуаций, не связанных с ростом и прогрессией опухоли, что, соответственно, ограничивает их применение. Пункционная биопсия поджелудочной железы — это инвазивное исследование, для выполнения которого необходимы соответствующие навыки и умения, а цитологический анализ имеет высокий уровень ложных отрицательных результатов, по этой причине порой приходится повторять отбор проб. Анализ биопсийного материала не позволяет судить о динамике опухолевого процесса и об изменении чувствительности опухоли к терапии из-за гетерогенности опухолевой ткани. Таким образом, поиск специфических биомаркеров для ранней диагностики и прогноза заболевания, а также мониторинга пациентов с раком поджелудочной железы в процессе лечения составляет приоритетную задачу для повышения выживаемости пациентов при этом смертельном заболевании. Жидкостная биопсия, которой последнее время уделяют большое внимание и которую считают многообещающим методом, включает исследование свободно циркулирующих опухолевых ДНК (сtDNA) в плазме или сыворотке крови [11, 12].

Происхождение сtDNA

ctDNA — это двухцепочечная молекула, состоящая из небольших фрагментов (от 70 до 200 п. н.) и более крупных фрагментов с молекулярным весом до 21 а. е. м., которая встречается как в плазме, так и в сыворотке [13]. Хотя ДНК может активно высвобождаться из клеток как часть нормального метаболизма, у больных раком ее количество увеличивается от 4 до 40 раз и может достигать концентрации 1000 нг/мл в крови, тогда как у здоровых лиц концентрация бесклеточной ДНК не превышает 100 нг/мл [14, 15]. В основном ДНК попадает в кровоток в результате апоптоза, некроза и прямого высвобождения в результате метаболизма клеток. При опухолевых заболеваниях наблюдается высокий клеточный обмен и, следовательно, повышенный запрограммированный апоптоз, что может объяснить более высокие уровни ctDNA в плазме по сравнению с другими физиологическими состояниями [13]. В результате высокого темпа роста опухолевой ткани в некоторых участках возникает стойкая гипоксия и, как следствие, некроз опухолевых клеток. Фагоцитоз некротических клеток макрофагами способствует высвобождению клеточных компонентов, в том числе фрагментов ДНК опухоли [16]. Помимо этого активное высвобождение ДНК опухолевыми клетками может происходить независимо от апоптоза и некроза. Это было продемонстрировано на лимфоцитах [17]. Теоретически сtDNA должны быстро разрушаться в кровеносном русле под действием нуклеаз. Тем не менее одним из механизмов, обеспечивающих длительную циркуляцию ДНК в крови, является упаковка нуклеинового материала в апоптотические тельца и нуклеосомы. Было показано, что олигонуклеосомные частицы в крови циркулируют в составе иммунных комплексов с анти-ДНК-антителами, и их содержание в крови коррелирует с клиническими параметрами развития заболевания. Доказано также, что нуклеиновые кислоты, высвобождаемые из клетки, могут циркулировать в составе комплексов с ДНК-связывающими белками (альбумин, иммуноглобулины M и G, фибронектин, лактоферрин). Другой механизм, поддерживающий уровень свободной ДНК в кровотоке, заключается в способности прикрепляться к поверхности клеточных элементов крови (эритроцитов и лейкоцитов) за счет ионных связей, а также посредством специализированных мембранных белков [18].

Недавние исследования, в основу которых легло полногеномное секвенирование ДНК плазмы крови, продемонстрировали, что ctDNA содержат последовательность всего генома опухоли, которая может отражать клональную эволюцию опухоли [11]. Это качество открывает возможность использования ctDNA для диагностики и мониторинга рака путем выявления специфических для опухоли генетических и эпигенетических мутаций. Новые технологии позволили улучшить качественный и количественный анализ сtDNA, а исследования злокачественных новообразований, проведенные за последние два десятилетия, свидетельствуют о возможности применения ctDNA в качестве дополнительного диагностического маркера.

Основные методы определения мутаций в ctDNA

Для определения генетической последовательности и выявления клинически значимых мутаций в геноме пациента разработаны разнообразные молекулярно-биологические методы. Однако наиболее комплексным подходом, обеспечивающим достоверный результат подобных исследований, является прямое определение нуклеотидной последовательности участков генома пациента, которое достигается путем секвенирования ДНК. Появление технологий массивного параллельного секвенирования позволило не только увеличить производительность и скорость прочтения до миллиардов пар оснований, но и существенно снизить стоимость анализа. Фракция циркулирующей опухолевой ДНК может составлять менее 1 % общей свободно циркулирующей ДНК, поэтому методы обнаружения должны обладать высокой чувствительностью и специфичностью [19]. В связи с этими требованиями наиболее эффективными оказались два метода — на основе секвенирования нового поколения (NGS — next generation sequencing) и цифровой капельной полимеразной цепной реакции (ПЦР) (ddPCR) [20, 21].

Цифровая капельная ПЦР представляет собой третье поколение технологии ПЦР. В отличие от ПЦР в реальном времени, хорошо известного количественного относительного метода, цифровая ПЦР является абсолютным, менее чувствительным к влиянию ингибиторов, методом измерения. Система ddPCR вычисляет количество молекул нуклеиновых кислот, инкапсулированных в дискретные капли водно-масляной эмульсии, волюмометрическим методом. Концентрация ДНК-мишени в исходном образце соответствует числу копий в микролитре, определенному с чувствительностью до 1 молекулы. Метод прост в использовании и обладает большой специфичностью и чувствительностью при обнаружении редких мутаций (чувствительность детектирования — 0,001 % мутантов). В отличие от ddPCR с помощью NGS можно «прочитать» единовременно сразу несколько участков генома, что значительно ускоряет и удешевляет исследование. NGS позволяет выявлять новые генетические или эпигенетические изменения, которые недоступны ddPCR. Последними разработками NGS являются улучшенные технологии, такие как Safe-Sequencing system (Safe-seq), Cancer personalized profiling by deep sequencing (CAPP-seq), Integrated digital error suppression-enhanced CAPP-seq (iDES-enhanced CAPP-seq), Base-Position error rate (BPER), которые применяют для исследования сtDNA и которые также обладают высокой чувствительностью (0,001 %) и специфичностью (90 %). Часто методы NGS и ddPCR используют в сочетании [22]. Например, Pécuchet et al. применяли BPER NGS и ddPCR для обнаружения ctDNA у больных раком поджелудочной железы и наблюдали высокую чувствительность и специфичность обоих методов. Кроме того, эти методы прекрасно дополняют друг друга, тем самым повышается точность исследования при выявлении мутаций [23].

Применение ctDNA

Исходя из клональной эволюции АКПЖ и математического моделирования скорости приобретения мутаций можно предположить, что проходит около 11,7 года от приобретения инициирующей мутации в здоровой клетке поджелудочной железы до полной трансформации ее в раковую клетку [24]. Таким образом, существует достаточно большой промежуток времени для раннего выявления АКПЖ. В настоящее время наиболее подробно изучены мутации, которые происходят в онкогенах и генах — супрессорах опухолей. По мере накопления эти генетические изменения приводят к нарушению основных сигнальных путей клеточной регуляции, в результате клетка приобретает злокачественные свойства. В АКПЖ наиболее часто мутируют онкоген KRAS (91 %) и три гена — супрессора опухолей: ТР53 (61 %), CDKN2A (44 %), SMAD4 (40 %), которых считают основными драйверами онкогенеза. Однако благодаря недавнему широкому геномному анализу, включая исследования секвенирования всего генома, можно составить более детальное представление о сложных геномных изменениях. Помимо четырех часто мутирующих генов установлен спектр генов, мутирующих только в небольшой части АКПЖ, которые также могут служить драйверами онкогенеза (GATA6, ARID1A, RNF43, ATM, TGFBR2, MAP2K4, MLL3, PIK3CA, RBM10, ROBO2, SMARCA4, PBRM1, SLIT2, KDM6A, BRAF, BRCA2) [10].

Начиная с 2000 г. большое внимание уделялось наиболее часто мутировавшему гену KRAS, как потенциальному биомаркеру АКПЖ. Как правило, в 90 % случаях мутации KRAS происходят в кодонах 12 и 13 и приводят ген в активное состояние. Многие исследования подтвердили, что мутантный KRAS можно обнаружить в плазме или сыворотке у пациентов с АКПЖ [25–28]. Maire et al. сообщили, что чувствительность и специфичность мутации KRAS в сыворотке для диагностики рака поджелудочной железы составили 47 и 87 % соответственно, а Dаbritz et al. удалось путем сочетания мутации KRAS ctDNA в плазме с онкомаркером CA19-9 добиться 98 и 77 % чувствительности и специфичности соответственно [28]. Такие же результаты получили Sefrioui et al. Они также использовали онкомаркер CA19-9 и мутации KRAS [29]. Bettegowda et al. провели исследование на основе жидкой биопсии у 846 пациентов с 15 типами рака, включая АКПЖ, с помощью цифровых технологий и показали зависимость уровня циркулирующей опухолевой ДНК от стадии заболевания. У пациентов на поздних стадиях мутировавший ген обнаруживали в 80 % случаев, а на ранних стадиях (без инвазии и метастазирования) лишь в 47 % случаев [30]. Были проведены сравнительные исследования по обнаружению мутаций ctDNA в плазме и опухолевых тканях, полученных путем биопсии. Marchese et al. обнаружили мутации в гене KRAS в образцах опухолевой ткани в 70 % случаев, тогда как в образцах плазмы тех же пациентов мутация KRAS найдена не была [31]. Чуть позже Zill et al., пользуясь методами NGS, выявили мутации KRAS, TP53 и SMAD4 в 90 % случаев и в плазме, и в опухолевой ткани у 26 пациентов [32].

Рак поджелудочной железы характеризуется не только генетическими мутациями, но и эпигенетическими изменениями. Jones et al. считают, что аберрантное метилирование CpG-островков ДНК может играть ключевую роль в канцерогенезе и опухолевой прогрессии [33]. При аберрантном метилировании инактивируются гены — супрессоры опухолей или, наоборот, усиливаются функции онкогенных сигнальных путей [34]. Обнаружение специфичных эпигенетических изменений в свободно циркулирующей ДНК может стать важным диагностическим инструментом для раннего выявления рака поджелудочной железы. Yi et al. обнаружили гиперметилированные промоторы генов BNC1 и ADAMTS1 в сыворотке крови [35]. Стоит изучить возможность использования комбинаторных подходов с несколькими биомаркерами на основе крови, включая геномные и эпигенетические изменения в ctDNA, в качестве стратегии повышения чувствительности и специфичности диагностики рака поджелудочной железы на ранней стадии.

Наибольшую эффективность ctDNA показала в исследованиях, связанных с прогнозированием и ответной реакцией на химиотерапию у пациентов с АКПЖ. Хотя оперативное лечение до сих пор остается основным методом лечения рака поджелудочной железы, но так или иначе всем пациентам независимо от стадии рака при отсутствии противопоказаний рекомендована адъювантная химиотерапия. Многие исследования были посвящены поиску зависимости выживаемости от проведенного лечения. Оказалось, что пациенты с мутацией KRAS, обнаруженной ctDNA в плазме, имеют плохой прогноз даже на фоне химиотерапии FOLFIRINOX. Sausen et al. показали, что пациенты с мутацией KRAS в ctDNA после операции были более подвержены рецидиву, чем пациенты без мутации KRAS. Следует отметить, что рецидив был выявлен на 6,5 мес. раньше по ctDNA, чем при использовании стандартных методов визуализации [25]. В другом исследовании Hadano et al. оценили появление рецидива и общую выживаемость пациентов, перенесших операцию, при помощи технологии ddPCR. Оказалось, что у пациентов, у которых была обнаружена сtDNA, рецидив возникал в течение 6 мес., а медиана выживаемости составляла около 16 мес., тогда как у пациентов без ctDNA показатели рецидива и медианы выживаемости составили 13 и 27 мес. соответственно [36]. Perets et al. наблюдали за пациентами с IV стадией на фоне химиотерапии и выяснили, что у пациентов с диким типом КRAS (немутированным) медиана выживаемости составила около 37,5 мес., а с мутантным KRAS около 8 мес. [37]. Интересный анализ провели Nakano et al., которые сравнивали ctDNA, полученную перед операцией, с ctDNA в послеоперационном периоде. Они обнаружили, что у некоторых пациентов без мутации KRAS перед операцией могли появиться мутации в этом гене в послеоперационном периоде, и рецидив в таких случаях возникал в течение 6 мес. [38]. В свою очередь Kinugasa et al. более подробно изучили мутации KRAS в кодоне 12 у 75 пациентов с помощью ddPCR. Большинство мутаций KRAS располагались в кодонах G12V и G12D. Медиана выживаемости у пациентов с такими мутациями также была значительно короче и составляла 276 дней по сравнению с пациентами с диким типом KRAS (413 дней). Примечательным оказалось то, что выживаемость у пациентов с мутацией G12V была самой короткой (219 дней) в сравнении с другими мутациями [39]. Интересный анализ провели Wei et al., которые выполняли секвенирование ctDNA и наблюдали не только за мутацией KRAS, но и за другими мутациями, выявленными в процессе исследования. В этом исследовании участвовали 38 пациентов с III и IV стадиями на фоне режима первой линии FOLFIRINOX [40]. Результат оказался довольно впечатляющий, так как доказывает пользу применения ctDNA при мониторинге рака. У пациентов с мутациями KRAS и TP53 резистентность к химиотерапии появилась в конце 2-го цикла, после чего опухоль начала снова прогрессировать. Один пациент с мутацией SF3B1 положительно отреагировал на все четыре цикла химиотерапии, в результате чего размер опухоли уменьшился и появилась возможность выполнить резекцию опухоли. У пациентов с мутацией GNAS^R201S на фоне лечения уровень ctDNA не изменился. А у пациентов с мутациями KEAP1 и BCL11A ответ на химиотерапию был таким же, как и у пациентов с мутацией KRAS. В исследовании также было показано, что ctDNA больше подходит для отслеживания опухолевой прогрессии, чем онкомаркеры CA19-9, CA125 и РЭА.

Заключение

Неудивительно, что ctDNA представляет большой интерес для многих исследователей, так как уже сейчас очевидна значительная польза ее применения для пациентов, страдающих раковыми заболеваниями. Как уже доказано, ctDNA имеет ряд преимуществ: во-первых, это неинвазивный метод диагностики; во-вторых, с помощью технологий ddPCR и NGS можно выявить генетические и эпигенетические изменения, происходящие в опухолевой ткани; в-третьих, уровень ctDNA коррелирует с опухолевой прогрессией. Все эти качества позволяют использовать ctDNA для раннего выявления, прогнозирования и мониторинга заболевания во время лечения.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

A. A. Tarmaev

Email: obeylerli@mail.ru
China, Harbin, Heilongjiang Province

Ozal A. Beylerli

Author for correspondence.
Email: obeylerli@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6149-5460
Russian Federation, 450008, Ufa, Lenin street, 3

References

Supplementary files