New opportunities in the diagnosis of asthma with sensitization to  Aspergillus  spp.

Yana I. Kozlova; Козлова Яна Игоревна; Alexandra E. Uchevatkina; Учеваткина Александра Евгеньевна; Larisa V. Filippova; Филиппова Лариса Вячеславовна; Oleg V. Aak; Аак Олег Владимирович; Valeriy D. Kuznetsov; Кузнецов Валерий Дмитриевич; Ekaterina V. Frolova; Фролова Екатерина Васильевна; Natalya V. Vasilyeva; Васильева Наталья Всеволодовна; Nikolay N. Klimko; Климко Николай Николаевич

doi:10.17816/mechnikov71585

Новые возможности в диагностике бронхиальной астмы с сенсибилизацией к Aspergillus spp.

Авторы: Козлова Я.И.¹, Учеваткина А.Е.¹, Филиппова Л.В.¹, Аак О.В.¹, Кузнецов В.Д.¹, Фролова Е.В.¹, Васильева Н.В.¹, Климко Н.Н.¹
Учреждения:
1. Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова
Выпуск: Том 13, № 2 (2021)
Страницы: 67-76
Раздел: Оригинальные исследования
Статья получена: 15.06.2021
Статья одобрена: 08.07.2021
Статья опубликована: 30.08.2021
URL: https://journals.eco-vector.com/vszgmu/article/view/71585
DOI: https://doi.org/10.17816/mechnikov71585
ID: 71585

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ
Доступ закрыт

Доступ предоставлен
Доступ закрыт

Доступ платный или только для подписчиков

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Обоснование. Диагностика бронхиальной астмы с сенсибилизацией к Aspergillus spp. приобретает все большее значение в связи с тяжелым, неконтролируемым течением заболевания и возможностью формирования аллергического бронхолегочного аспергиллеза.

Цель исследования — оценить возможность применения теста активации базофилов с использованием проточной цитометрии для диагностики бронхиальной астмы с сенсибилизацией к Aspergillus spp.

Материалы и методы. Проведено обследование 118 больных аллергической бронхиальной астмой. Уровни общего иммуноглобулина E (IgE) и специфических IgE к аэроаллергенам определяли в сыворотке крови иммуноферментным методом. Активацию базофилов изучали методом проточной цитометрии с помощью набора Allerginicity kit (Cellular Analysis of Allergy, Beckman-Coulter, США). Для стимуляции базофилов в работе использовали аллерген Aspergillus fumigatus («Алкор Био», Россия).

Результаты. Первую группу составили 57 больных бронхиальной астмой без сенсибилизации к Aspergillus spp. Во вторую группу вошли 36 больных бронхиальной астмой с сенсибилизацией к Aspergillus spp. Третью группу составили 25 больных аллергическим бронхолегочным аспергиллезом. Количество базофилов, активированных аллергеном Aspergillus fumigatus, у больных бронхиальной астмой с сенсибилизацией к Aspergillus spp. и аллергическим бронхолегочным аспергиллезом было достоверно больше, чем в группе пациентов с бронхиальной астмой, и составило 8,1 [5,2; 20,9] % и 84,6 [75,7; 94,0] % соответственно (p < 0,001). Индекс стимуляции в исследуемых группах варьировал от 0,7 до 72,6. Оптимальной диагностической точкой (cut off) для выявления больных бронхиальной астмой с сенсибилизацией к Aspergillus spp. было значение индекса стимуляции более 2,4, а для больных аллергическим бронхолегочным аспергиллезом — 15,95. Среди всех больных с сенсибилизацией к Aspergillus spp. установлена положительная корреляционная связь уровня специфических IgE к Aspergillus spp. с долей активированных аллергеном Aspergillus fumigatus базофилов (r = 0,792, p < 0,001) и индексом стимуляции (r = 0,796, p < 0,05).

Заключение. Тест активации базофилов может быть использован в качестве дополнительного метода диагностики бронхиальной астмы с сенсибилизацией к Aspergillus spp. и аллергического бронхолегочного аспергиллеза. Тест необходим для подтверждения микогенной сенсибилизации в случаях противоречивых или отрицательных результатов кожных тестов и специфических IgE, а также при отсутствии возможности проведения исследований in vivo.

Ключевые слова

Aspergillus spp., астма, тест активации базофилов

Полный текст

Обоснование

Бронхиальную астму (БА) относят к наиболее распространенным заболеваниям дыхательной системы среди взрослого населения с высокой социально-экономической значимостью. В настоящее время во всем мире отмечена тенденция к росту распространенности тяжелых форм заболевания [1]. В структуре тяжелой БА важное место занимает БА с сенсибилизацией к Aspergillus spp. [2, 3].

Согласно результатам некоторых исследований до 50 % взрослых с недостаточно контролируемой БА, несмотря на максимальные дозы ингаляционных глюкокортикоидов, сенсибилизированы к Aspergillus spp. [4]. Признание важной роли плесневых грибов в патогенезе БА привело к возникновению термина «тяжелая БА с микогенной сенсибилизацией» (severe asthma with fungal sensitisation, SAFS). Это группа больных БА с неконтролируемым течением заболевания и сенсибилизацией к антигенам грибов, отсутствием бронхоэктазов, скоплений слизи и уровнем общего IgE менее 1000 МЕ/мл [5].

По расчетным данным, количество больных тяжелой БА с микогенной сенсибилизацией может достигать 6,5 млн человек в мире и 231 000 человек в Российской Федерации [6, 7].

Кроме того, пациенты с БА с сенсибилизацией к Aspergillus spp. составляют группу риска развития такого тяжелого хронического заболевания легких, как аллергический бронхолегочный аспергиллез (АБЛА). В то время как, по оценке экспертов, АБЛА страдают около 5 млн человек в мире, заболевание часто не распознают вовремя [6]. Прогрессирование АБЛА ведет к развитию фиброза, дыхательной недостаточности и инвалидизации больных [8, 9].

Для подтверждения гиперчувствительности немедленного типа к Aspergillus spp. используют методы in vivo, для которых существует ряд противопоказаний, а результаты могут быть противоречивы. В связи с этим в последние десятилетия большое внимание уделяют методам in vitro, преимущество которых заключается в безопасности для пациента, специфичности и возможности стандартизации.

Наряду с высокой потребностью в системных глюкокортикоидах, тяжелая БА с сенсибилизацией к Aspergillus spp. ассоциирована с частыми жизнеугрожающими состояниями и высоким риском смерти [10, 11], что позволяет отнести своевременную диагностику данного фенотипа к одной из актуальных проблем современной медицины.

Цель исследования — оценить возможность применения теста активации базофилов с аллергеном Aspergillus fumigatus в условиях in vitro с использованием проточной цитометрии для диагностики БА с сенсибилизацией к Aspergillus spp.

Материалы и методы

В исследование включили 118 взрослых больных аллергической БА. Уровни общего иммуноглобулина E (IgE) и специфических IgE к грибковым, бытовым и эпидермальным аллергенам в сыворотке крови определяли с помощью иммуноферментного анализа, используя тест-систему (ООО «Полигност», Россия) и панель биотинилированных аллергенов («Алкор Био», Россия).

Тест активации базофилов выполняли методом проточной цитометрии с помощью набора Allerginicity kit (Cellular Analysis of Allergy, Beckman-Coulter, США). Уровень базофилов оценивали с помощью маркеров CD3–CRTH2+ (CRTH2-хемоаттрактантный рецептор). Количество активированных базофилов определяли по возрастанию экспрессии CD203c на клетках после стимуляции in vitro. С этой целью образцы цельной периферической крови окрашивали тройным коктейлем моноклональных антител CRTH2-FITC/CD203c-PE/CD3-PC7 в присутствии буферного раствора (отрицательный контроль), или моноклональных антител к IgE (положительный контроль), или аллергена A. fumigatus («Алкор Био», Россия) в течение 15 мин при 37 °С в темноте. Оптимальная концентрация аллергена была установлена в предыдущих исследованиях [12]. Затем проводили лизис эритроцитов лизирующим фиксирующим реагентом, входящим в набор Allerginicity kit. На проточном цитометре Navios Beckman Coulter (США) подсчитывали не менее 500 базофилов в каждой пробе. Оценивали спонтанную активацию базофилов — долю клеток CD3–CRTH2+CD203c++ от общего количества базофилов в пробе с буферным раствором, что позволяет разграничить уровень экспрессии молекул покоящихся клеток по сравнению с состоянием активации клетки. Подсчет числа активированных базофилов после инкубации с анти-IgE-антителами необходим для подтверждения способности базофилов к неспецифической активации для исключения ложноотрицательных реакций и повышения специфичности метода.

Диагноз устанавливали в соответствии с рекомендациями, изложенными в «Глобальной стратегии лечения и профилактики бронхиальной астмы» (Global Initiative for Asthma, GINA, 2020 г.) [1]. Для выявления микогенной сенсибилизации использовали критерий, предложенный экспертами Международного общества микологии человека и животных (International Society for Human and Animal Mycology, ISHAM): положительный кожный прик-тест (≥3 мм) и/или определение в сыворотке крови уровня специфического IgE к грибковому аллергену, соответствующего классу I и выше (≥0,35 МЕ/мл). Диагноз АБЛА устанавливали на основании критериев R. Agarwal и соавт. (2013) [13].

Полученные в процессе исследования данные обрабатывали с помощью программной системы STATISTICA 10 и SPPS Statistics 23. Данные представляли в виде медианы и нижнего и верхнего квартилей [Ме (Q1; Q3)]. Для оценки различий между независимыми выборками применяли ранговый дисперсионный анализ по Краскелу – Уоллису и непараметрический критерий Манна – Уитни. Взаимосвязь показателей оценивали с помощью коэффициента корреляции Спирмена. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05. Для оценки диагностической значимости индекса стимуляции в выявлении микогенной сенсибилизации выполняли ROC-анализ (receiver-operator characteristic) с расчетом площади под ROC-кривой — AUC (area under curve), которая является одной из количественных оценок диагностической эффективности изучаемого показателя. Построение ROC-кривой заключается в расположении на осях X и Y частоты истинно положительных результатов (чувствительность) и ложноположительных результатов (специфичность) для каждой точки разделения. Для выбора оптимального значения точки разделения (порогового значения) использовали максимальное значение суммы чувствительности и специфичности.

Результаты и обсуждение

На основании результатов клинико-инструментального обследования больные БА были разделены на три группы. Первую группу составили 57 больных БА без сенсибилизации к Aspergillus spp., средний возраст — 50 ± 15 лет (женщин — 80,7 %). Во вторую группу вошли 36 больных БА с сенсибилизацией к Aspergillus spp., средний возраст — 49 ± 14 лет (женщин — 77,8 %). Согласно критериям R. Agarwal и соавт. выделили 25 больных, у которых на фоне БА сформировался АБЛА. Средний возраст больных в третьей группе составил 45 ± 16 лет (женщин — 64 %). Группы не отличались между собой по полу и возрасту.

Всем больным провели тест активации базофилов с аллергеном Aspergillus fumigatus в условиях in vitro с использованием проточной цитометрии. Результаты представлены в таблице.

Таблица. Результаты иммунологического обследования больных бронхиальной астмой, n = 118

Table. Results of immunological examination of patients with asthma, n = 118

Показатели	Первая группа	Вторая группа	Третья группа	Уровень значимости (р)
Показатели	БА (n = 57)	БА с сенсибилизацией к Aspergillus spp. (n = 36)	АБЛА (n = 25)	Уровень значимости (р)
Уровень специфических IgE к Aspergillus, МЕ/мл	0,02 [0, 00; 0, 05]	0,90 [0, 56; 1, 27]	2,20 [1, 15; 7, 13]	р1–2 < 0,001 р1–3 < 0,001 р2–3 < 0,001
Cпонтанная активация базофилов, %	2,6 [1, 8; 4, 4]	2,3 [1, 5; 3, 1]	2,3 [1, 5; 4, 3]	р1–2 = 0,12 р1–3 = 0,59 р2–3 = 0,45
IgE-опосредованная активация базофилов, %	71,9 [60, 0; 81, 7]	74,2 [63, 1; 87, 3]	74,5 [67, 0; 88, 1]	р1–2 = 0,34 р1–3 = 0,21 р2–3 = 0,72
Количество активированных базофилов, %	3,6 [2, 3; 5, 5]	8,1 [5, 2; 20, 9]	84,6 [75, 7; 94, 0]	р1–2 < 0,001 р1–3 < 0,001 р2–3 < 0,001
Индекс стимуляции	1,2 [1, 0; 1, 5]	4,0 [2, 5; 11, 2]	27,7 [21, 1; 48, 5]	р1–2 < 0,001 р1–3 < 0,001 р2–3 < 0,001

Примечание. БА — бронхиальная астма; АБЛА — аллергический бронхолегочный аспергиллез; IgE — иммуноглобулины E.

Cпонтанная активация базофилов у больных БА с сенсибилизацией к Aspergillus spp. и в группах сравнения не различалась между собой и колебалась в пределах от 0,6 до 8,3 %. Степень IgE-опосредованной активации базофилов не различалась между группами и колебалась в пределах от 29,6 до 96,9 %.

Количество базофилов, активированных аллергеном Aspergillus fumigatus, у больных БА с сенсибилизацией к Aspergillus spp. и АБЛА было достоверно больше, чем в группе пациентов с БА, и составило 8,1 [5, 2; 20, 9] % и 84,6 [75, 7; 94, 0] % соответственно (p < 0,001).

Принято учитывать уровень активации базофилов не только по числу клеток, у которых повысилась экспрессия маркера CD203c в ответ на инкубацию с аллергеном, но по индексу стимуляции (ИС). ИС рассчитывают как отношение доли активированных базофилов в пробе с аллергеном к доли базофилов со спонтанной активацией в отрицательном контроле. ИС в группе больных БА с сенсибилизацией к Aspergillus spp. составил 4,0 [2, 5; 11, 2]. Показатель достоверно отличался от групп сравнения и занимал промежуточное положение между показателями у больных БА и АБЛА (p < 0,001). Следует отметить, что максимальных значений ИС достиг в группе больных АБЛА — 27,7 [21, 1; 48, 5].

Примеры гистограмм теста активации базофилов у больных БА с сенсибилизацией к Aspergillus spp. и без сенсибилизации к Aspergillus spp. представлены на рис. 1.

Рис. 1. Тест активации базофилов у больных бронхиальной астмой. Пациент С. (а, b) и пациент Д. (c, d) на этапе итогового гейтирования базофилов (CD3–CRTH2+CD203++) после спонтанной (a, c) и специфической Aspergillus fumigatus (b, d) активации. Большая доля активированных базофилов (b) подтверждает наличие сенсибилизации

Fig. 1. Basophil activation test in patients with asthma. Patients С. (а, b) and patients D. (c, d) at the final basophil gaiting (CD3–CRTH2+CD203++) after the spontaneous (a, c) and specific Aspergillus fumigatus (b, d) activation. High percentage of the activated basophils (b) confirms the sensibility

Для оценки диагностической значимости теста активации базофилов в выявлении сенсибилизации к Aspergillus spp. выполняли ROC-анализ с расчетом площади под кривой. В нашем исследовании ИС колебался от 0,7 до 72,6 у больных с сенсибилизацией к Aspergillus spp. и от 0,7 до 4,2 у больных без сенсибилизации к Aspergillus spp. AUC составила 0,883 (95 % ДИ 0,809–0,956), чувствительность — 86,9 % (95 % ДИ 76,2–93,2), а специфичность — 94,7 % (95 % ДИ 85,6–98,2) (p < 0,001). Это указывает на высокую специфичность и чувствительность метода, а значение ИС более 2,4 является оптимальной точкой разделения (cut off) для выявления микогенной сенсибилизации с высоким уровнем достоверности у больных БА.

На следующем этапе у больных с сенсибилизацией к Aspergillus spp. было определено значение ИС для диагностики АБЛА. AUC составила 0,887 (95 % ДИ 0,800–0,972), чувствительность — 96,0 % (95 % ДИ 80,5–99,3), а специфичность — 80,6 % (95 % ДИ 65,0–90,3) (p < 0,001). Таким образом, значение ИС более 15,95 является оптимальной точкой разделения (cut off) для выявления больных АБЛА.

Рис. 2. Кривые ROC, иллюстрирующие оптимальные точки отсечения (cut off) индекса стимуляции (ИС) для выявления сенсибилизации к Aspergillus spp. у больных бронхиальной астмой (a) и аллергическим бронхолегочным аспергиллезом (b)

Fig. 2. ROC curves illustrating the optimal cut off points of the index stimulation to detect sensitization to Aspergillus spp. patients with asthma (a) and ABPA (b)

Среди всех больных с сенсибилизацией к Aspergillus spp. установлена положительная корреляционная связь уровня специфических IgE к Aspergillus spp. к доле активированных аллергеном Aspergillus fumigatus базофилов (r = 0,792, p < 0,001) и ИС (r = 0,796, p < 0,05). Полученные данные подтверждают взаимосвязь теста активации базофилов со стандартным определением уровня IgE к грибковым аллергенам и позволяют использовать его в диагностике гиперчувствительности немедленного типа к Aspergillus spp. у больных БА.

Обсуждение

Подтверждение гиперчувствительности к Aspergillus spp. — важный диагностический этап у больных тяжелой БА с сенсибилизацией к Aspergillus spp. и АБЛА. Известные в настоящее время варианты лабораторно-инструментальных методов не всегда могут удовлетворить потребности клиницистов. Следует помнить, что ингаляционный тест с антигенами Aspergillus spp. ассоциирован с риском развития фатального бронхоспазма и не рекомендован для применения в клинической практике [13, 14]. В то время как для проведения провокационных и кожных тестов существует ряд противопоказаний, особенную актуальность приобретают методы диагностики in vitro [15]. Однако получаемые результаты не всегда достоверны и воспроизводимы в различных лабораториях. Известно, что IgЕ, уровень которых определяют во всех диагностических алгоритмах, характеризуются незначительным содержанием в сыворотке крови. Кроме того, иммуноглобулины этого класса могут отсутствовать в циркуляции, но быть фиксированы на клетках-мишенях — базофилах и тучных клетках [16].

Одним из наиболее перспективных направлений аллергодиагностики in vitro является тест активации базофилов специфическими аллергенами с помощью проточной цитометрии [17–19]. Преимущество теста состоит в расширении показаний для пациентов, безопасности и возможности стандартизации.

Роль базофилов в иммунной регуляции и аллергическом ответе в последние годы была переоценена. Установлено, что клетки, стимулирующие Тh2-клеточную дифференцировку путем секреции цитокинов и антигенной презентации, участвуют в развитии IgE-опосредованного хронического аллергического воспаления и играют ключевую роль в IgG-опосредованной системной анафилаксии [20].

Помимо того что базофилы периферической крови и тканевые тучные клетки представляют первичные эффекторные клетки в IgE-опосредованных аллергических реакциях, они также могут быть вовлечены и в другие типы аллергического и неаллергического ответа, в основе которых лежат иные механизмы реакции (активация комплемента, не-IgE-опосредованная стимуляция и прямое цитотоксическое воздействие). Таким образом, изучение функциональной активности базофилов имеет большое диагностическое значение [21].

Принцип теста активации базофилов сводится к тому, что при контакте аллергена с молекулами IgE, фиксированных на базофилах, запускается каскад ферментных реакций, приводящих к дегрануляции и появлению на клеточной поверхности дополнительных молекул. В настоящее время наиболее изученными и перспективными в аллергодиагностике маркерами активации базофилов являются CD63 и CD203с [22–24]. Идентификацию базофилов, а также оценку экспрессии маркеров активации и дегрануляции осуществляют при помощи проточного цитометра.

В нашем исследовании использовали маркер CD203с (невральный антиген поверхностно-клеточной дифференциации, E-NPP3). Это гликозилированный тип II трансмембранной молекулы, принадлежащий семейству эктонуклеотидов пирофосфатаз/фосфодиэстераз — ферментов, катализирующих гидролиз олигонуклеотидов, нуклеозидов фосфатаз и NAD. Среди клеток в гемопоэзе поверхностный E-NPP3 представлен исключительно на базофилах [25]. В малых количествах он определяется на покоящихся клетках. После активации клетки уровень CD203с возрастает на 350 % [26].

Таким образом, тест активации базофилов с помощью проточной цитометрии — доступный и перспективный метод лабораторной диагностики гиперчувствительности немедленного типа. В настоящее время опубликованы данные зарубежных и отечественных авторов о применении теста активации базофилов в диагностике инсектной, пищевой, пыльцевой, лекарственной аллергии, а также хронической крапивницы [17–19, 27, 28]. Особенно полезен тест активации базофилов у больных с микогенной аллергией, так как в настоящее время диагностические грибковые аллергены для кожного тестирования в Российской Федерации не зарегистрированы.

Исследования по выявлению сенсибилизации к Aspergillus spp. с помощью теста активации базофилов немногочисленны и были проведены у больных муковисцидозом. Согласно результатам Gernez и соавт., тест активации базофилов позволил дифференцировать колонизацию дыхательных путей и сенсибилизацию к Aspergillus в этой группе больных. Опубликован ряд работ, в которых тест активации базофилов в сочетании с определением специфических IgE к Aspergillus и общего IgE способствовал своевременному выявлению АБЛА у больных муковисцидозом [29–31]. Эти данные согласуются с результатами наших предыдущих исследований [12].

Полученные в ходе настоящего исследования результаты свидетельствуют, что тест может быть использован в качестве дополнительного метода диагностики БА с сенсибилизацией к Aspergillus spp. и АБЛА. Тест можно проводить для подтверждения микогенной сенсибилизации в случаях противоречивых или отрицательных результатов кожных тестов и специфических IgE, а также при отсутствии возможности выполнения исследования in vivo.

Важное преимущество метода заключается в том, что тест активации базофилов с аллергеном Aspergillus fumigatus проводят менее чем за 2 ч, для него необходим небольшой объем цельной периферической крови. Это можно сделать в том же образце крови, который применяют для других иммунологических исследований, что существенно уменьшает дискомфорт для пациента. Кроме того, получение количественных результатов позволяет использовать тест активации базофилов как инструмент дифференциальной диагностики БА с сенсибилизацией к Aspergillus spp. и АБЛА. Своевременное выявление этих двух заболеваний респираторного тракта, связанных с сенсибилизацией к Aspergillus spp., имеет большое значение для определения дальнейшей терапевтической тактики.

Выводы

У больных БА с сенсибилизацией к Aspergillus spp. с помощью теста активации базофилов была подтверждена микогенная сенсибилизация.
Пороговое значение ИС для выявления БА с сенсибилизацией к Aspergillus spp. составило 2,4, для АБЛА — 15,95.
Тест активации базофилов можно рассматривать для подтверждения микогенной сенсибилизации в случае противоречивых или отрицательных результатов кожных тестов и специфических IgE, а также при отсутствии возможности проведения исследования in vivo.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах