Charachterization of umbilical cord mesenchymal stromal cells during long-term expansion in vitro

A. A. Aizenshtadt; Айзенштадт А. А.; M. A. Skazina; Сказина М. А.; E. A. Kotelevskaya; Котелевская Е. А.; L. V. Yelsukova; Елсукова Л. В.; T. L. Zolina; Золина Т. Л.; N. V. Ponomartsev; Пономарцев Н. В.; N. K. Galaktionov; Галактионов Н. К.; I. A. Galembo; Галембо И. А.; D. A. Ivolgin; Иволгин Д. А.; I. I. Maslennikova; Масленникова И. И.; N. I. Enukashvily; Енукашвили Н. И.

doi:10.17816/mechnikov201810111-19

Charachterization of umbilical cord mesenchymal stromal cells during long-term expansion in vitro

Authors: Aizenshtadt A.A.¹, Skazina M.A.², Kotelevskaya E.A.², Yelsukova L.V.², Zolina T.L.², Ponomartsev N.V.³, Galaktionov N.K.³, Galembo I.A.², Ivolgin D.A.¹, Maslennikova I.I.¹, Enukashvily N.I.¹
Affiliations:
1. North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov
2. Stem Cell Bank Pokrovsky
3. Institute of Cytology RAS
Issue: Vol 10, No 1 (2018)
Pages: 11-19
Section: Reviews
URL: https://journals.eco-vector.com/vszgmu/article/view/8806
DOI: https://doi.org/10.17816/mechnikov201810111-19
ID: 8806

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

One of the clinicians’ major concerns is the biological safety of MSC. The critical question for clinical application of human MSC is their ability to undergo spontaneous malignant transformation in a recipient organism. The goal of our research was to study umbilical cord hMSC proliferative and differentiation capacities, karyotype stability, telomerase activity and telomere length, oncomarkers expression and tumorigenicity during long-term (6 months) cultivation ex vivo. Here we report on the establishing the primary culture of human umbilical cord MSC, MSC_0714, that was capable to proliferate ex vivo for up to 59 passages (6 months). During this period, the cells preserved their normal karyotype, morphology and MSC immunophenotype. Telomeres started to shorten only after the passage 20, while hTERT was inactive in these cells for the whole period of expansion. At the beginning of cultivation the number of SA-β-gal positive cells did not exceeded 3-5%, after the 22th passage their number started to increase and reached 49% at the passage 57. Thus, it was shown that MSC during long-term culture retain their characteristics and undergo cell senescence.

Keywords

mesenchymal stem cells (MSC), oncotrasformation, cell culture senescence

Full Text

Введение

Мезенхимные стромальные клетки (МСК) представляют собой высокопролиферативные мультипотентные клетки. В соответствии с минимальными критериями Международного общества клеточной терапии МСК человека — это клетки с фибробластоподобной морфологией, обладающие способностью к адгезии к культуральному пластику, дифференцировочным потенциалом и следующим иммунофенотипом: CD105+, CD73+ и CD90+, CD45–, CD34–, CD14–, CD11b–, CD79–, CD19- и HLA-DR [1]. В настоящее время МСК считаются одним из наиболее перспективных ресурсов для регенеративной терапии из-за простоты выделения, высокой пролиферативной активности и широкого спектра продуцируемых ими биологически активных веществ (цитокины, факторы роста и др.).

Использование МСК в клинической практике связано с необходимостью их культивирования ex vivo, в ходе которого могут значительно изменяться свойства и характеристики клеток. Это в свою очередь может влиять на безопасность и эффективность их применения. МСК человека после выделения из тканей для клинического применения культивируют ex vivo в течение короткого периода времени (2–4 пассажа, 1 месяц), чтобы избежать риска бактериального заражения, хромосомных аберраций и злокачественной трансформации. В ранее опубликованных работах старение культур МСК человека с прекращением пролиферации клеток фиксировали не позднее 30-го пассажа [7–10]. МСК возможно получить из различных тканевых источников: костного мозга, жировой ткани, плаценты и пуповины, пульпы зуба и т. д. Плацента и пуповина служат удобным источником для выделения МСК за счет неинвазивного способа получения ткани и более высокой пролиферативной активности МСК пуповины [2, 3, 11, 12]. Однако небольшая часть МСК может оставаться в тканях реципиента длительное время. Хотя стромальные клетки имеют решающее значение для восстановления тканей, в нескольких исследованиях указывается, что они также могут участвовать в злокачественной трансформации и инициировании рака, как показано у мышей [4, 5].

Целью наших исследований было изучение способности пролиферации и дифференцировки МСК периваскулярного пространства пупочного канатика (МСК ПК) с оценкой стабильности кариотипа, активности теломеразы и длины теломер. Нам удалось получить одну длительно пролиферирующую культуру (на 59-м пассаже, более 6 мес. культивирования), иммунофенотип и кариотип которой оставались постоянными на протяжении всего периода культивирования.

Материалы и методы

Выделение и культивирование периваскулярного пространства пупочного канатика. Образцы пупочных канатиков были получены при неосложненных родах. Забор биологического материала производили только при наличии информированного согласия доноров или их законных представителей. МСК выделяли по описанной ранее методике [12]: пупочную вену канатика промывали раствором Версена, заполняли 0,1 % раствором коллагеназы I и IV типов (Sigma, США) и инкубировали в течение 30 мин при 37 °С. Затем вену промывали фосфатно-солевым буфером, повторно заполняли раствором коллагеназ и инкубировали в течение 30 мин при 37 °С. Полученную взвесь клеток отмывали от фермента центрифугированием (300 g, 10 мин). Клетки переносили в полную ростовую среду, которая состояла из Advanced Stem Cell Medium и 20 % заменителя сыворотки HyClone (США) с добавлением антибиотика пенициллина и антимикотика стрептомицина (оба — Gibco, США), затем высевали в культуральные флаконы (TPP, Швейцария) при плотности 100–400 тыс. кл/см2. Клетки культивировали в условиях гипоксии (7 % О2, 5 % СО2). Смену среды проводили через 3 сут. Пересев (пассирование) клеток при достижении конфлюентности (плотности культуры) 70–80 % осуществляли по стандартным методикам.

Время удвоения популяции (PDT) рассчитывали следующим образом:

PDT = (t2 – t1) / 3,32 · (log n2 – log n1),

где (t2 – t1) — время (h) между пассажами; n2, n1 — количество клеток на каждом пассаже.

Иммунофенотипирование. Экспрессию поверхностных антигенов анализировали с использованием меченных флуорохромом антител против CD34, CD45, CD90, CD105, CD73, CD13, CD10, CD44, CD14, CD117 (все из BD Bioscience, США) с помощью проточного цитометра FC500 (Beckman Coulter, США) в соответствии с инструкциями производителя. МСК промывали последовательно 0,02 % ЭДТА и 0,25 % раствора трипсина. Трипсинизацию останавливали добавлением 10 % заменителя сыворотки (HyClone) в PBS. Полученную суспензию дважды промывали и ресуспендировали в 150 мкл PBS для окрашивания антителами и последующего анализа с помощью проточной цитометрии.

Окраска на β-галактозидазу (SA-β-gal). β-Галактозидазу, ассоциированную со старением (SA-β-gal), выявляли в клетках в соответствии со стандартным протоколом. При использовании данного протокола клетки с активной формой SA-β-gal окрашиваются в синий цвет. Клетки выращивали до 60–70 % конфлюентности, затем промывали в PBS, фиксировали 4 % параформальдегидом в фосфатно-солевом буфере и окрашивали раствором SA-β-gal в течение 16 часов. Реакцию останавливали путем удаления окрашивающего раствора и промывки клеток дистиллированной водой. Полученные препараты анализировали с помощью фазоконтрастного микроскопа Axioscope (Zeiss, Germany). Подсчитывали число окрашенных клеток. В каждом препарате анализировали не менее 20 полей зрения.

Оценка дифференцировочного потенциала. Дифференцировочный потенциал МСК ПК оценивали с помощью набора Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit (R & D Systems, США) в соответствии с протоколом производителя. Клетки высевали при плотности 2 · 104 клеток/см2. Адипогенез индуцировали, когда клетки достигали 100 % конфлюентности. Остеогенную и хондрогенную дифференцировку МСК индуцировали при достижении 60–70 % конфлюентного монослоя. Присутствие адипоцитов в культурах МСК выявляли окрашиванием жировым красным О (Bio-Optica), прохождение остеогенной дифференцировки — по окрашиванию отложений кальция в остеоцитах ализариновым красным С (Chemicon), хондрогенной дифференцировки — с помощью окраски альциановым синим.

Кариотипирование. Для проведения кариотипирования препараты метафазных хромосом, полученные по стандартным методикам, окрашивали раствором Hoechst 33258 с последующим контрастированием актиномицином D при уровне разрешения 450–550 сегментов (ISCN). Анализ проводили с помощью микроскопа AxioScope A1, Carl Zeiss и программного обеспечения Ikaros, Meta Systems (Германия).

Определение длины теломер и активности теломеразы. Изменение длины теломер в ходе культивирования оценивали методом измерения флуоресцентной in situ гибридизации с помощью проточной цитометрии (Flow-FISH). Анализ проводили с использованием коммерческого набора Telomere PNA Kit/FITC for Flow Cytometry (Daco, США) на проточном цитометре Beckman Coulter FC500 в соответствии с инструкцией производителя. В качестве положительного контроля использовали клетки линий 1301 и КВ с удлиненными теломерами. Активность теломеразы в культуре определяли с помощью протокола амплификации теломерных повторов (telomeric repeat amplification protocol, TRAP) с использованием коммерческого набора TRAPEZE® RT Telomerase Detection Kit (Millipore) согласно инструкции производителя. В качестве отрицательного контроля применяли термически инактивированные образцы анализируемой длительно культивируемой культуры, в качестве положительного контроля — рекомендованные производителем набора клетки линий 1301 и КВ с удлиненными теломерами и активной теломеразой. Клетки использовали в количестве 3 · 106 клеток на реакцию.

Результаты

Морфология клеток и продолжительность пролиферации клеток in vitro. Проанализировано более 200 культур МСК ПК. Большинство из них могли быть пассированы не более 5–7 раз (рис. 1). Среди проанализированных культур обнаружена культура МСК ПК (МСК_0714) со способностью к длительному культивирования in vitro, клетки которой сохраняли пролиферативную активность в течение 59 пассажей. В начале культивирования ростовые характеристики данной культуры были схожими со средними показателями для МСК ПК, к 5-му пассажу время удвоения популяции увеличилось, однако затем скорость прироста популяции вернулась к прежним значениям и была относительно постоянной до 30-го пассажа, плавно увеличиваясь затем до 50-го пассажа. Заметное снижение пролиферативной активности наблюдали только на поздних сроках культивирования (50–60-й пассаж) (см. рис. 1).

Рис. 1. Среднее время удвоения популяции мезенхимных стромальных клеток пупочного канатика. Синяя линия — среднее время удвоение популяции мезенхимных стромальных клеток в 204 культурах. Красная линия — время удвоения популяции мезенхимных стромальных клеток _0714. По оси абсцисс — количество пассажей, по оси ординат — время удвоения популяции. Данные представлены в виде среднего значения с отложенным стандартным отклонением

В течение всего периода культивирования клетки МСК_0714 сохраняли типичную для МСК морфологию. При этом в начале культивирования в популяции в основном присутствовали фибробластоподобные клетки размером 25–60 мкм, а также вытянутые веретеновидные клетки с линейными размерами 50–100 мкм. После 40-го пассажа в популяции стали появляться более крупные клетки (100–250 мкм) полигональной формы с большим количеством отростков (рис. 2). Однако мы не обнаружили колоний округлых клеток с уменьшенной адгезией к пластику.

Рис. 2. Репрезентативные микрофотографии клеток культуры МСК_0714 на ранних (4-й пассаж), средних (22-й пассаж) и поздних (47-й пассаж) сроках культивирования. Световая микроскопия. Ув. ×400. Масштаб (50 мкм) указан на микрофотографиях

Старение клеток при длительном культивировании. В начале культивирования содержание SA-β-gal-позитивных клеток не превышало 3–5 %. После 50-го пассажа их доля существенно возрастала и к 57-му пассажу достигла 49 % (рис. 3). Следует отметить, что основная часть окрашенных клеток на поздних пассажах — полигональные крупные клетки. Такая морфология характерна для стареющих МСК.

Рис. 3. Культура МСК_0714 на 48-м пассаже. Синий цвет — клетки с активной SA-β-gal. Световая микроскопия. Ув. ×400. Масштаб указан на микрофотографиях

Изменение экспрессии поверхностных антигенов при длительном культивировании. Иммунофенотипирование МСК_0714 при длительном культивировании выполняли на 2-м и 3-м пассажах, а затем — каждые 3–4 пассажа. На всем протяжении культивирования процентное содержание клеток, экспрессирующих антигены CD90, CD105, CD44, CD73 и отрицательных по экспрессии CD45, CD34, CD117, CD14, практически не изменялось и превышало 90 % (табл. 1). Несмотря на постоянное содержание в популяции клеток с МСК-специфичным иммунофенотипом, анализ интенсивности флуоресценции клеток, экспрессирующих CD90 и СD105, выявил, что с увеличением срока культивирования in vitro происходило заметное снижение плотности изучаемых антигенов на поверхности МСК (рис. 4).

Таблица 1 / Table 1. Изменение иммунофенотипа клеток МСК_0714 в зависимости от длительности культивирования

Change in immunophenotype of cells MSC_0714 depending on the duration of cultivation

Антиген	Содержание окрашенных клеток
Антиген	3-й пассаж	10-й пассаж	19-й пассаж	33-й пассаж	57-й пассаж
СD 90	98 ± 2	98 ± 2	99 ± 0,6	98 ± 2	97,5 ± 2,4
CD 105	97,5 ± 1,5	98 ± 1	98 ± 1,2	97 ± 2	96,7 ± 2,32
CD 73	96,5 ± 0,29	97 ± 0,4	98 ± 0,9	97 ± 1	99,3 ± 0,7
CD 10	95,0 ± 1,4	95,0 ± 1,5	94 ± 2	93 ± 4,5	81,8 ± 17,1*
CD 13	99 ± 0,59	98 ± 0,3	99 ± 0,3	94 ± 5	63,6 ± 14,5*
CD 44	96 ± 0,84	96 ± 0,5	96 ± 0,5	96 ± 0,5	99 ± 0,9
HLA-ABC	0	0	0	0	0
CD 45	0,05 ± 0,02	0	0,6 ± 0,5	0	1 ± 0,4
CD14	0	0	0,3 ± 0,5	0,5 ± 0,5	0,8 ± 0,5
CD117	1 ± 0,05	1,1 ± 0,05	1,1 ± 0,05	1,1 ± 0,05	1,5 ± 0,7
CD34	0	0	0	0	2,1 ± 1,8

Рис. 4. Интенсивность флуоресценции клеток культуры МСК_0714, экспрессирующих антигены CD90 и СD105 в зависимости от пассажа

Снижение дифференцировочного потенциала в ходе длительного культивирования мезенхимных стволовых клеток. Анализировали способность МСК к дифференцировке в остеогенном, адипогенном и хондрогенном направлениях. Эта способность является одной из основных характеристик МСК согласно принятым критериям [1]. Все проанализированные культуры МСК обладали способностью к дифференцировке в адипогенном, остеогенном и хондрогенном направлениях. Дифференцировочный потенциал клеток культуры МСК_0714 оценивали каждые 3–7 пассажей начиная с 5-го пассажа. До 28-го пассажа МСК обладали способностью к дифференцировке в остео-, хондро- и адипогенном направлениях (рис. 5), затем, постепенно утрачивая дифференцировочный потенциал (клетки утратили способность к хондрогенной дифференцировке на 32-м пассаже, адипогенной дифференцировке — на 41-м и остеогенной — на 50-м), к концу культивирования клетки не обладали способностью к дифференцировке, несмотря на сохранение МСК-специфичного иммунофенотипа.

Рис. 5. Вид культур МСК_0714 28-го пассажа после 2-й недели культивирования в среде, содержащей хондрогенные (a — окрашивание альциановым синим), адипогенные (b — окрашивание жировым красным О) и остеогенные стимулы (c — окрашивание ализариновым красным). Световая микроскопия. Ув. ×400. Масштаб указан на микрофотографиях

Сокращение длины теломер при неактивной теломеразе в МСК_0714 в ходе длительного культивирования. Для культуры МСК_0714 была проведена оценка изменения длины теломер в ходе культивирования. До 23-го пассажа МСК характеризовались стабильной длиной теломер, которая затем сокращалась в среднем на 30 %, однако оставалась в пределах, описанных для некультивированных клеток пуповинной крови (рис. 6).

Рис. 6. Изменение длины теломер клеток культур МСК_0714 в ходе культивирования in vitro

Активность теломеразы в клетках МСК_0714 оценивали на всем протяжении культивирования каждые пять пассажей. На всем протяжении культивирования не было выявлено признаков активации теломеразы (рис. 7).

Рис. 7. Активность теломеразы в клетках МСК_0714. КВ и 1301 — положительный контроль, клетки с высокоактивной теломеразой hTERT

Сохранение стабильного кариотипа мезенхимных стволовых клеток при длительном культивировании. Для оценки кариотипа каждого образца МСК анализировали 20 метафазных пластинок на четырех и более поздних пассажах в зависимости от длительности поддержания пролиферативного потенциала. Для культуры МСК_0714 кариотипирование проводили на 5, 9, 17, 24, 33, 50 и 59-м пассажах. Показано, что МСК_0714 на всем протяжении культивирования сохраняли стабильный кариотип без изменения количества и структуры хромосом в течение всего срока культивирования (рис. 8).

Рис. 8. Кариотип МСК_0714 через 5 мес. после начала культивирования (50-й пассаж)

Обсуждение

МСК человека обладают высоким пролиферативным потенциалом. Однако скорость пролиферации может меняться в зависимости от источника выделения [12]. Такая высокая пролиферативная активность является одновременно достоинством и недостатком. С одной стороны, высокий пролиферативный потенциал клеток позволяет получить их в количествах, достаточных для трансплантации, с другой — вызывает опасения по поводу возможности спонтанной онкогенной трансформации. Аллогенные (донорские) трансплантированные МСК удаляются из организма реципиента в течение примерно 1 мес. Небольшая часть клеток остается и пролиферирует в течение более длительного периода [6, 13].

В культуре большинство образцов МСК пролиферируют в течение 1–2 мес. и далее вступают в процесс клеточного старения. Клетки МСК_0714 интенсивно пролиферировали и сохраняли иммунофенотип на протяжении 21–25 пассажей (3 мес. роста в культуре). В продолжение 4 мес. последующего роста в культуре выраженность признаков клеточного старения (активность SA-β-gal, ассоциированной со старением и укорочением теломер) нарастала. По нашим данным, на основе анализа научных публикаций (база данных PubMed) в ходе реализации проекта впервые была получена культура МСК, клетки которой обладали способностью к длительному культивированию in vitrо — в течение 59 пассажей или более 6 мес. В ранее опубликованных работах старение культур МСК человека с прекращением пролиферации клеток фиксировали не позднее 30-го пассажа [7–10]. Следует отметить, что значительный размер выборки, использованной в нашем исследовании, свидетельствует о том, что сохранение пролиферативного потенциала in vitro в течение длительного периода (более 20 пассажей), видимо, не является характерной особенностью МСК.

При этом в части публикаций было описано, что длительное культивирование МСК сопровождается хромосомными аномалиями [10, 14], хотя в других исследованиях, наоборот, были получены свидетельства генетической стабильности МСК [15, 16]. Предполагается, что генетическая стабильность, во-первых, видоспецифична — хромосомы МСК человека более стабильны по сравнению с МСК мышей, а во-вторых, зависит от условий культивирования. В полученной нами культуре не было зафиксировано хромосомных перестроек в течение всего периода культивирования in vitro, что говорит о высокой генетической стабильности данной культуры МСК ПК

Таким образом, показано, что при долгосрочном культивировании МСК сохраняют свои характеристики и подвержены клеточному старению.

Работа выполнена в рамках государственного задания МЗ РФ и поддержана грантом РФФИ № 16-34-01163.

About the authors

A. A. Aizenshtadt

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

Author for correspondence.
Email: nie@newmail.ru
Russian Federation, Saint Petersburg