Метаболит N-ацетил-парабензохинонимин как фактор возможной нейротоксичности парацетамола

Полный текст

ОБОСНОВАНИЕ

Парацетамол (ацетаминофен) — самый распространенный жаропонижающий и обезболивающий препарат, для которого в меньшей степени, чем для большинства нестероидных противовоспалительных средств, характерны побочные эффекты в виде повреждения желудочно-кишечного тракта, повышения системного сосудистого сопротивления с повреждением почек и задержки жидкости из-за нарушения синтеза простагландинов. Благодаря его популярности и предполагаемому высокому уровню безопасности парацетамол применяют во время беременности. В США его используют 25–40 % беременных, из которых 3–20 % — во всех трех триместрах [1]. Однако парацетамол оказывает гепатотоксичное действие в случае превышения его дозы, и, по оценкам ученых, является наиболее частой причиной печеночной недостаточности в США и Европе. У 44 % здоровых добровольцев единовременный прием парацетамола вызвал повышение печеночных трансаминаз [2].

В основе токсичности парацетамола лежит его метаболизм (рис. 1), минорный путь которого приводит к образованию N-ацетил-парабензохинонимина (NAPQI).

 

Рис. 1. Метаболизм парацетамола. NAPQI — N-ацетил-парабензохинонимин; UDG — УДФ-глюкуронилтрансфераза

Fig. 1. Metabolism of paracetamol. NAPQI — N-acetyl-p-benzoquinonimine; UDG — uridine-diphosphate (UDG)-glucuronosyl transferase

 

При обычном приеме парацетамола этот метаболит безвреден, поскольку он быстро конъюгируется глутатион-S-трансферазой и выводится с желчью. Очень редко происходит его ковалентное соединение с сульфгидрильными группами белков с образованием стабильных белковых аддуктов, в норме удаляющихся путем аутофагии [3]. Накопление NAPQI происходит в случае приема парацетамола в высоких дозах с последующим достижением предела насыщения. В этом случае белки митохондрий превращаются в необратимо формирующиеся нефункциональные конъюгаты, возникает дефицит глутатиона, развивается реакция окислительного стресса, запускается апоптоз [4]. Предрасполагающими факторами к токсическому действию парацетамола являются истощение, длительная диета (истощение запасов глутатиона), употребление алкоголя (индукция метаболизма в системе CYP2E1) и снижение содержания желчных кислот, восстанавливающих гепатоциты [5].

Подробно описанные механизмы токсичности, связанные с метаболизмом парацетамола, вместе с известным фактом популярности этого препарата у беременных, вызывают опасения. Образование NAPQI зависит от ферментов, активность которых во время беременности увеличивается [6], а именно цитохромов семейств CYP2A6, CYP3A4, CYP2D6. При этом нельзя исключать, что токсичность NAPQI создает угрозу для развивающейся нервной системы плода, уязвимой к воздействию внешних факторов. Исследования показали ассоциацию между применением парацетамола матерью во время беременности и поведенческими расстройствами у подросших детей [7]. Мы проанализировали токсичность парацетамола и NAPQI для клеток нервной системы в эксперименте.

Цель исследования — изучить влияние метаболита парацетамола NAPQI на нейроны коры мозга крыс в условиях окислительного стресса, индуцированного перекисью водорода.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для исследования использованы: перекись водорода, парацетамол, цитозин-β-D-арабинозидфуранозид, поли-D-лизин фирмы Sigma (США), среда инкубации DMEM с L-глутамином, сыворотка крови плодов коровы, трипсин, пенициллин и стрептомицин фирмы «БиолоТ» (Россия).

Нейроны выделяли из коры мозга эмбрионов крыс на 17–18-й день развития [8]. Для выделения клеток применяли трипсин, для предотвращения размножения глиальных клеток использовали цитозин-β-D-арабинозидфуранозид. Нейроны выращивали в полной ростовой среде DMEM, содержащей 10 % среды F12, 10 % сыворотки крови плодов коровы, 2 мМ L-глутамин и 20 мМ HEPES. Нейрональные клетки высеивали в полной ростовой среде в 96-луночные планшеты, покрытые поли-D-лизином, в количестве 4 ∙ 10⁵ в лунке. На следующий день клетки обрабатывали 1 мкМ цитозин-β-D арабинофуранозидом, который заменяли полной ростовой средой через 24 ч. Эксперименты начинали на 5–6-й день культивирования клеток in vitro.

Жизнеспособность клеток определяли методом, основанным на восстановлении бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-тетразолия (МТТ) [9]. Клетки сеяли в 96-луночный планшет в концентрации 5 ∙ 10⁴ в лунке, и через 24 ч меняли полную ростовую среду на среду DMEM с L-глутамином. Затем их инкубировали с парацетамолом в концентрации 1 мг/мл или NAPQI (0,1 мг/мл) в течении 24 ч. За 2,5 ч до конца инкубации добавляли 0,3 мМ перекись водорода. Реагент МТТ добавляли в концентрации 0,5 мг/мл за 2 ч до окончания инкубации. Через 2 ч клетки лизировали с 20 % додецилсульфатом натрия в растворе 50 % диметилформамида в 0,05 н раствора HCl. Содержание окрашенного продукта реакции (МТТ-формазана) измеряли, определяя оптическую плотность при значении 570 нм на микропланшетном ридере. Результаты выражали в процентах от контрольных значений — условных 100 % МТТ-формазана в клетках РС12, не подвергнутых действию парацетамола, NAPQI и перекиси водорода.

Изменения митохондриального мембранного потенциала проверяли методом проточной цитометрии с использованием катионного красителя JC-1. Клетки инкубировали с парацетамолом в концентрации 1 мг/мл или NAPQI (0,1 мг/мл) в течении 24 ч. За час до конца инкубации добавляли 0,3 мМ перекись водорода. Краситель JC-1 добавляли в конечной концентрации за 0,5 ч до окончания инкубации. Измерения проводили на проточном цитометре FC-500 (Beckman Coulter) при FL1 = 525 ± 40 нм, FL2 — 575 ± 30 нм, λ_ex = 488 нм. Изменение цвета с красного на зеленый оценивали и анализировали количественно. Результаты выражали в процентах от контрольных значений, связанных с клетками РС12, не подвергнутыми воздействию изучаемых веществ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На рис. 2 представлены результаты первого типичного эксперимента из трех. Преинкубация с 0,3 мМ перекисью водорода, парацетамолом в концентрации 1 мг/мл и NAPQI (0,1 мг/мл) снижает процент выживших клеток до 51,5 %, 85,2 % и 85,6 % соответственно. При совместной инкубации перекиси водорода и парацетамола или NAPQI выявлено еще более значительное снижение жизнеспособности нейронов (до 52,8 %), чем на контрольных клетках.

 

Рис. 2. Влияние парацетамола и N-ацетил-парабензохинонимина на выживание нейронов коры мозга плодов крыс. APAP — парацетамол; NAPQI — N-ацетил-парабензохинонимин

Fig. 2. The effect of paracetamol and NAPQI on the survival of neurons in the cerebral cortex of the fetal rats. APAP — paracetamol; NAPQI — N-acetyl-p-benzoquinonimine

 

Данная преинкубация также снижает митохондриальный мембранный потенциал до 90,0, 90,7 и 90,5 % соответственно (рис. 3). При совместной инкубации перекиси водорода и парацетамола или NAPQI обнаружено еще большее снижение митохондриального мембранного потенциала до 88,9 и 80,6 % соответственно, чем на контрольных клетках.

 

Рис. 3. Влияние парацетамола и N-ацетил-парабензохинонимина на изменение митохондриального мембранного потенциала в нейронах коры мозга плодов крыс. APAP — парацетамол; NAPQI — N-ацетил-парабензохинонимин

Fig. 3. The effect of paracetamol and NAPQI on the change in the mitochondrial membrane potential of neurons in the cerebral cortex of the fetal rats. APAP — paracetamol; NAPQI — N-acetyl-p-benzoquinonimine

 

Влияние парацетамола на развитие мозга плода остается предметом дискуссий. Анализ датского национального регистра рождений выявил взаимосвязь между применением парацетамола беременными и расстройствами аутистического спектра у рожденных детей [10]. Аналогичные результаты обнаружены в анализах других когорт: норвежской когорты MoBa [11] и когорты Nurses’Health Study — одного из крупнейших регистров, направленных на изучение женского здоровья [12]. Метаанализ опубликованных исследований подтвердил взаимосвязь между применением парацетамола беременными и риском возникновения синдрома дефицита внимания и гиперактивности у детей [13].

Измерение концентраций парацетамола и его метаболита при выявлении ассоциаций затруднено из-за неоднородности результатов исследований. Не ясной остается и доза препарата, которую можно считать безопасной для приема во время беременности [14].

Данных из экспериментов на животных не так много. С. Rigobello и соавт. обнаружили, что после применения беременными крысами парацетамола у их крысят в возрасте двух месяцев возникали признаки социальной дезадаптации, когнитивные нарушения, а также нарушения метаболизма моноаминов в гипоталамусе, мозжечке и спинном мозге [15].

В ходе экспериментов доказано, что парацетамол способен существенно увеличивать экспрессию JNK, HIF1A, CASP3 — маркеров апоптоза клеток в сфероидах человеческой глиобластомы А172 [16]. Мы показали, что в концентрации 1 мM и 2 мM парацетамол увеличивает гибель клеток нейрональной линии РС12 [17, 18].

Существуют также данные, что парацетамол вызывал когнитивные нарушения и изменения количества нейротропного фактора в разных участках мозга (увеличение во фронтальной коре и снижение в височной доле) у мышей [19].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Раннее мы показали, что парацетамол способен оказывать токсическое действие на клетки нейрональной линии РС12 [9, 17, 18]. Полученные данные о том, что парацетамол и его метаболит NAPQI снижают жизнеспособность и митохондриальный мембранный потенциал нейронов коры мозга плодов крыс могут свидетельствовать о возможном токсическом эффекте этого препарата на нервную ткань. Наши исследования вносят вклад в описание биологического механизма, который может объяснить нейротоксическое действие парацетамола, в частности, на развивающийся мозг плода. Необходимо изучить особенности образования NAPQI, связанные с изменением активности CYP2D6 и CYP3A4 во время беременности. Наиболее сложной задачей мы считаем определение критической дозы и периода применения парацетамола во время беременности, необходимых для реализации его нейротоксичности.

ДОПОЛНИТЕЛЬНО

Источник финансирования. Исследование проведено при финансовой поддержке Министерства здравоохранения Российской Федерации в части научной деятельности (государственное задание № АААА-А19-119060390106-0).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Все авторы внесли существенный вклад в проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Об авторах

Юлия Александровна Власова

Северо-западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова

Email: Yuliya.Vlasova@szgmu.ru
ORCID iD: 0000-0001-5536-3595
Scopus Author ID: 6701810182

канд. биол. наук, доцент

Россия, 195067, Санкт-Петербург, Пискаревский пр., д. 47

Ксения Александровна Загородникова

Северо-западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова

Автор, ответственный за переписку.
Email: ksenia.zagorodnikova@gmail.com
SPIN-код: 4669-2059

канд. мед. наук, доцент

Россия, 195067, Санкт-Петербург, Пискаревский пр., д. 47

Список литературы

Дополнительные файлы