R577X polymorphism of alpha-actinin-3 in human populations of North-Eastern Asia

Full Text

Введение

Ген изоформы 3 α-актинина скелетных мышц человека (ген ACTN3) расположен на длинном плече хромосомы 11 и кодирует белок α-актинин-3, экспрессирующийся исключительно в быстросокращающихся волокнах скелетных мышц [1]. Среди нуклеотидных замен гена ACTN3 наиболее известна замена C → T в локусе rs1815739, которая приводит к терминации синтеза белка в аминокислотной позиции 577 экзона 16, что происходит вследствие замены аргинина на терминирующий кодон (замены R577X) [2]. Такого рода замена приводит к дефициту α-актинина-3 в быстросокращающихся мышечных волокнах, что, в свою очередь, может стать причиной снижения скоростно-силовых показателей физической работоспособности человека [3]. Однако дефицит α-актинина-3 не приводит к патологии мышц, так как его отсутствие компенсируется другой изоформой — α-актинином-2. Между тем известно, что частота аллеля 577X понижена у спортсменов, занимающихся скоростно-силовыми видами спорта, что стало основой для гипотезы о генетической предрасположенности человека к выполнению скоростно-физической работы [4].

В скелетных мышцах изоформы α-актининов выполняют не только статическую функцию, участвуя в организации тонких филаментов и взаимодействии между саркомерным цитоскелетом и саркоплазмой, но и регуляторную, поскольку они принимают участие в регуляции дифференциации и сокращении миофибрилл. Эксперименты на мышах показали, что нокаут гена ACTN3 приводит к смещению метаболических путей, характерных для лактатзависимых быстрых миофибрилл, в сторону аэробных путей, ассоциированных в норме с медленными мышечными волокнами [5]. Таким образом, повышенная частота аллеля 577X в некоторых популяциях человека могла быть связана с отбором, направленным на повышение эффективности метаболизма и способствующим динамическим видам деятельности (например, длительной охоте, а в спорте — марафону, плаванию, велогонке), а также производству тепла, что может иметь адаптивное значение [6]. Предполагается также, что длительному удержанию аллеля 577X в популяциях человека мог способствовать балансирующий отбор [7], а в популяциях Евразии также и другие формы положительного отбора [5, 8, 9].

Недавние исследования показали, что в популяциях коренного населения Америки наблюдаются повышенные частоты аллеля 577X гена ACTN3 [9–11]. Результаты статистического анализа показали, что повышение частоты этого аллеля у индейцев Америки может быть обусловлено как воздействием отбора, так и случайными причинами, например, эффектом основателя [9]. В глобальном масштабе частота аллеля 577X повышается по мере удаления от Африки и достигает максимума в популяциях Америки [9]. Предполагается, что распространению этой мутации способствовали позитивные изменения в показателях мышечной активности, которые дает аллель 577X, а именно повышение выносливости [6]. Поэтому вполне вероятно, что аллель 577X оказался полезным еще на ранних стадиях заселения Евразии, поскольку помогал преодолевать большие расстояния при расселении людей, а также способствовал длительной охоте [6, 7]. Результаты молекулярного датирования указывают на древность этой мутации [9]. Расчеты показали, что она возникла примерно 60 тысяч лет назад, что свидетельствует о возможности приобретения селективных преимуществ носителями аллеля 577X еще на начальном этапе освоения просторов Евразии [9]. Гомозигота по аллелю 577X была выявлена у представителя культуры Кловис (возрастом около 13 тыс. лет) — древнейшей культуры индейцев Америки [12]. Это свидетельствует о том, что высокая частота аллеля 577X, по всей видимости, была характерна для предковой популяции америндов еще в Азии, хотя последующие события, связанные с редукцией генетического разнообразия в Берингии несколько тысяч лет тому назад [13], могли привести к формированию генетических различий между популяциями разных частей Берингии.

Поскольку о распространенности аллеля 577X гена ACTN3 в популяциях Крайнего Северо-Востока Азии известно очень мало, то в настоящей работе нами предпринят популяционный скрининг этого генетического варианта у чукчей, коряков и эвенов, а также среди русского населения Магаданской области.

Материал и методы

Сбор образцов

Исследованы выборки коренного населения Северо-Восточной Азии: чукчи (n = 15) (г. Анадырь, Чукотский автономный округ), коряки (n = 66) и эвены (n = 74) (Северо-Эвенский район Магаданской области). Изучена также выборка русского населения Магаданской области (n = 77).

Выделение ДНК, амплификация, рестрикционный анализ, секвенирование

Материалом для исследования служила геномная ДНК, выделенная из цельной крови с помощью стандартного метода, который включает в себя лизис клеток 1 % раствором додецилсульфата натрия и протеиназой K (Sigma, США) и последующую депротеинизацию фенолом и хлороформом. Генотипирование локуса rs1815739 (полиморфизм C → T) проводили с помощью анализа полиморфизма рестрикционных фрагментов (ПДРФ) участка гена ACTN3, амплифицированного с помощью полимеразной цепной реакции, как описано ранее [12]. Амплифицированные с помощью праймеров ACTN3-F (5’-CTGTTGCCTGTGGTAAGTGGG-3’) и ACTN3-R (5’-TGGTCACAGTATGCAGGAGGG-3’) фрагменты ДНК длиной 291 пара нуклеотидов (п. н.) обрабатывали рестриктазой DdeI (Fermentas, Литва). Рестрикция «нормального» аллеля С (аминокислотный вариант R577) приводит к формированию фрагментов длиной 205 и 86 п. н., а «мутантного» аллеля Т (вариант 577X) — к появлению фрагментов длиной 108, 97 и 86 п. н. Рестрикционные фрагменты ДНК фракционировали электрофоретически в 8 % полиакриламидных гелях. Для детекции ДНК использовали окраску гелей бромистым этидием с последующей визуализацией ДНК в УФ-свете.

Участок гена ACTN3, включающий в свой состав локус rs1815739, амплифицировали с помощью пары олигонуклеотидных праймеров ACTN3-78 (5’-ACACTGCTGCCCTTTCTGTT-3’) и ACTN3-489 (5’-GAGACAGGCAAGGCGATTTA-3’). Эти праймеры были подобраны с помощью анализа нуклеотидной последовательности гена ACTN3 (под номером NG_013304 в базе данных GenBank) с использованием программы Primer3 [15]. Участки ДНК амплифицировали в течение 35 циклов в температурном режиме: 95 ºС — 30 с, 60 ºС — 30 с и 72 ºС — 30 с. Продукты амплификации секвенировали по Сэнгеру с использованием набора для циклического секвенирования ДНК Big Dye Terminator (Applied Biosystems v. 3.1) и генетического анализатора ABI Prism 3500xL (Applied Biosystems, США).

Секвенирование экзомов и прилегающих нетранслируемых участков генов проводили с помощью системы Agilent SureSelectXT Human All Exon V5+UTRs (Agilent Technologies) на платформе HiSeq 1500 (Illumina, США) для шести образцов ДНК от представителей коренного населения Сибири (3 коряка, 2 эвена и 1 эвенк). В качестве референтной последовательности использовали геномную сборку GRCh37.p13. Для аннотации вариантов полиморфизма использовали сервер SeattleSeq Annotation.

В работе использованы также данные о полноэкзомном полиморфизме, сгенерированные из нуклеотидных последовательностей целых геномов от представителей коренного населения Северо-Восточной Азии (25 представителей эскимосов, чукчей и коряков; по данным работы [16]) и других регионов Сибири (83 представителя эвенов, эвенков, якутов, тувинцев, шорцев, алтайцев, бурят, монголов, кетов, хантов, манси, селькупов, ненцев и нганасан; по данным работы [17]).

Статистический анализ

Для выравнивания и анализа нуклеотидных последовательностей применяли программы пакета MEGA5 [18]. Частоту аллелей локуса rs1815739, гетерозиготность и соответствие распределения генотипов равновесию Харди — Вайнберга рассчитывали с помощью пакета программ Arlequin 3.01 [19]. Для выявления гаплотипов из генотипов с неизвестной гаметной фазой применяли алгоритм ELB [20] пакета программ Arlequin 3.01.

Результаты и обсуждение

Результаты рестрикционного анализа, проведенного с помощью фермента DdeI, показали наличие полиморфизма С/Т в локусе rs1815739 гена ACTN3, вариантам которого соответствуют варианты R/X-полиморфизма белка ACTN3. Гомозиготные генотипы rs1815739-TT гена ACTN3 (XX для белка) дополнительно подтверждали с помощью секвенирования ДНК по Сэнгеру. В итоге нами обнаружено, что в популяциях коренного населения Северо-Востока Азии частота аллеля rs1815739-T (аминокислотный вариант 577X) составляет около 30 % у чукчей, 34 % у коряков и около 40 % у эвенов (табл. 1).

 

Таблица 1. Частоты генотипов и аллелей локуса rs1815739 гена ACTN3 в популяциях Северо-Восточной Сибири и других регионов мира Frequencies of genotypes and alleles of the ACTN3 gene locus rs1815739 in populations of North-Eastern Siberia and other regions of the world

Популяция	n	Генотипы			Аллели		Ho	He	HWE, p
		CC	TC	TT	C	T
Чукчи1	15	0,533	0,4	0,07	0,733	0,267	0,4	0,405	1,0
Коряки1	66	0,409	0,5	0,091	0,659	0,341	0,5	0,453	0,43
Эвены1	74	0,324	0,554	0,122	0,601	0,399	0,554	0,483	0,23
Русские 1	77	0,338	0,584	0,078	0,63	0,37	0,584	0,469	0,048
Европейцы2	226	0,195	0,584	0,221	0,487	0,513	0,584	0,501	0,016
Китайцы2	86	0,326	0,419	0,255	0,535	0,465	0,419	0,5	0,13
Мексиканцы2	100	0,12	0,6	0,28	0,42	0,58	0,6	0,49	0,026
n — размер выборки; Ho — наблюдаемая гетерозиготность; He — ожидаемая гетерозиготность; HWE, p — статистическая значимость отклонения от равновесия Харди — Вайнберга (достоверно при p < 0,05). Данные приводятся по результатам: 1 — настоящая работа; 2 — база данных dbSNP

 

У русских Магаданской области частота этого аллеля составила 37 %. Следует отметить, что в других популяциях мира, взятых для сравнения (см. табл. 1), частота аллеля rs1815739-T выше 40 %. Самые низкие частоты этого аллеля наблюдаются у африканцев — около 10 % (табл. 2). В исследовании Amorim et al. [9] отмечалось, что частота аллеля rs1815739-T повышается по мере удаления от Африки и достигает максимума в популяциях Америки. Однако проведенное нами исследование показывает, что на Северо-Востоке Азии наблюдаются отнюдь не самые высокие частоты этого аллеля в Евразии, а, наоборот, можно говорить о существенном снижении его частоты среди не только коренного, но и пришлого населения Северо-Востока Азии.

 

Таблица 2. Частота аллеля rs1815739-T гена ACTN3 в популяциях мира Frequency of allele rs1815739-T of ACTN3 gene in the populations of the world

Регион	Размер выборки	Частота аллеля rs1815739-T	Источник
Африка	794	0,093	[9]
Ближний Восток	356	0,392	[9]
Европа	445	0,443	[9]
Центральная и Южная Азия	199	0,502	[9]
Восточная Азия	581	0,477	[9]
Сибирь	114	0,447	[17]
Северо-Восточная Сибирь	155	0,361	Настоящая работа
Америка	394	0,764	[9]

 

Анализ генетических дистанций (в виде значений попарных Fst) показывает отсутствие межпопуляционных различий на Северо-Востоке Азии (табл. 3). Однако все исследованные нами выборки (за исключением коряков) не отличаются по распределению генотипов по локусу rs1815739 гена ACTN3 также и от китайцев, но достоверно (включая коряков) отличаются от европейцев и мексиканцев. Проведенный анализ показал также, что во всех изученных нами популяциях наблюдается равновесное распределение частот генотипов в соответствии с законом Харди — Вайнберга (см. табл. 1). Только для выборки русских Магаданской области значимость отклонения от равновесия Харди — Вайнберга оказалась пограничной (p = 0,048). Между тем в выборках европейцев и мексиканцев выявляется достоверное отклонение от равновесного распределения частот генотипов. Во всех этих случаях причиной отклонения является превышение наблюдаемых частот гетерозигот CT над ожидаемыми. Отбор в пользу гетерозигот имеет функциональное объяснение. Так, было обнаружено, что гетерозиготные по локусу rs1815739 индивидуумы затрачивают меньше энергии при беге на большие дистанции и, соответственно, могут обладать большей выносливостью, например, во время длительных путешествий [21].

 

Таблица 3. Попарные Fst-различия между популяциями Pairwise Fst differences between populations

Популяция	Коряки	Эвены	Чукчи	Русские	Китайцы	Европейцы
Коряки	0
Эвены	0	0
Чукчи	0	0,0167	0
Русские	0	0	0,0034	0
Китайцы	0,0248*	0,0027	0,0578	0,0123	0
Европейцы	0,0528*	0,0215*	0,0951*	0,0359*	0,0006	0
Мексиканцы	0,1024*	0,0581*	0,1567*	0,0791*	0,0208*	0,0053
* достоверные различия (p < 0,05)

 

Анализ нуклеотидных последовательностей геномного участка, включающего в свой состав локус rs1815739 гена ACTN3, позволил выявить гаплоблок длиной примерно 280 тысяч п. н. (табл. 4). Как видно, в популяциях наблюдаются два основных гаплотипа — A и B, различающихся в 27 позициях 10 генов. Аллель T локуса rs1815739 гена ACTN3 находится в гаплотипе B. Кроме этих основных гаплотипов, в популяциях распространены гаплотипы C, D и E, появившиеся, по-видимому, в результате рекомбинации между гаплотипами A и B.

 

Таблица 4. Гаплотипы участка хромосомы 11, окружающего локус rs1815739 гена ACTN3, по результатам анализа экзомного полиморфизма The haplotypes of the chromosome 11 region surrounding the locus rs1815739 of the ACTN3 gene, according to the results of the analysis of exome polymorphism

Гены	Позиция	rs (SNP)	Гаплотипы
			A	B	C	D	E
NPAS4	66188761	77600363	T	G	G	G	G
MRPL11	66203025	2279865	C	A	A	A	C
LOC101928090	66233944	7925093	G	C	C	C	G
PELI3	66240882	2277302	C	T	T	T	C
PELI3	66242107	61582507	G	A	A	A	G
PELI3	66244454	3179961	G	A	A	A	G
DPP3	66247844	2279864	A	G	G	G	A
DPP3	66254085	11550299	T	G	G	G	T
DPP3	66272142	1671063	G	A	G	A	G
DPP3	66272237	2305535	A	G	G	G	A
BBS1	66282095	2298806	A	G	G	G	A
BBS1	66288123	11822028	C	T	T	T	C
BBS1	66288733	10896125	C	G	G	G	C
BBS1	66297363	3816492	T	C	C	C	T
BBS1	66300348	3741360	G	A	A	A	G
ZDHHC24	66303854	7116921	C	T	T	C	C
ZDHHC24	66303895	7116940	C	T	T	C	C
ZDHHC24	66305227	146249445	A	G	G	A	G
ZDHHC24	66306355	3737525	G	A	A	G	G
ACTN3	66326362	509556	G	A	G	G	G
ACTN3	66328095	1815739	C	T	C	C	C
CTSF	66331458	572846	G	A	G	G	G
CTSF	66333598	545009	T	C	T	T	T
CTSF	66335548	1127894	G	A	G	G	G
SPTBN2	66458980	623022	A	G	G	A	G
SPTBN2	66460527	639938	T	C	C	T	C
SPTBN2	66468469	506028	G	A	A	G	A
Rs (SNP) — идентификаторы локусов. Серой тонировкой закрашены аллели локусов, входящих в состав гаплотипа А. Полужирным отмечен локус rs1815739 гена ACTN3

 

Примечательно, что «мутантный» аллель rs1815739-T присутствует только в одном гаплотипе B, а «нормальный» аллель rs1815739-C характерен как для гаплотипа A, наиболее отличающегося от гаплотипа B, так и для гаплотипов C, D и E, представленных отдельными участками гаплотипов A и B. Интересно, что в гаплотипе С наблюдается минимальный по длине участок гаплотипа A (длиной 9186 п. н.), представленный пятью локусами генов ACTN3 и CTSF и фланкированный нуклеотидными последовательностями генов, характерных для гаплотипа B. Таким образом, можно заключить, что, несмотря на то, что «мутантный» аллель rs1815739-Т распространен в различных популяциях человека, он сохранился, по всей видимости, только в составе гаплотипа В, а при рекомбинации отбор гаплотипов всегда шел в пользу «нормального» аллеля rs1815739-С и соответствующего ему нуклеотидного окружения.

В табл. 5 приводятся данные о распределении частот гаплотипов геномного участка хромосомы 11, включающего ген ACTN3, в региональных группах Сибири. Несмотря на малые выборки, видно, что в популяциях Северо-Восточной Сибири наблюдается очень ограниченный набор гаплотипов (главным образом, А и В). Частота гаплотипа А в популяциях этого региона достоверно выше, чем во всех остальных региональных выборках коренного населения Сибири (p < 10–3, точный тест Фишера). Частота гаплотипа B с «мутантным» вариантом локуса rs1815739 достоверно выше в популяциях Центральной и Южной Сибири в сравнении с Северо-Восточной Сибирью (p < 0,04, точный тест Фишера).

 

Таблица 5. Частота гаплотипов участка хромосомы 11, окружающего локус rs1815739 гена ACTN3, в популяциях Сибири Frequency of the haplotypes of the chromosome 11 region surrounding the locus rs1815739 of the ACTN3 gene in Siberian populations

Регионы (популяции)	n	Гаплотипы
		A	B	C	D	E
Северо-Восточная Сибирь (эскимосы, чукчи, коряки)	25	0,68	0,28	0,04	0	0
Центральная Сибирь (эвены, эвенки, якуты)	29	0,21	0,57	0,16	0,03	0,03
Южная Сибирь (тувинцы, шорцы, алтайцы, буряты, монголы)	34	0,16	0,49	0,29	0	0,06
Западная Сибирь (кеты, ханты, манси, селькупы, ненцы, нганасане)	20	0,25	0,33	0,25	0,15	0,02
n — размер выборки

 

Полученные в настоящей работе результаты свидетельствуют о том, что, вопреки выводам Amorim et al. [9], в популяциях Северо-Восточной Азии наблюдаются довольно низкие частоты варианта rs1815739-T и гомозигот TT. Таким образом, полученные результаты не поддерживают идею о том, что в популяциях охотников и оленеводов, каковыми являются (или являлись до недавнего времени) эвены, коряки и чукчи, следует ожидать повышенных частот аллеля rs1815739-T в соответствии с предположениями ряда авторов [6, 7]. Так, Bramble и Lieberman [6] предложили гипотезу о том, что появление в первобытном обществе такого явления, как длительная охота, требовало от древних охотников большой выносливости, чему могли способствовать фенотипические изменения, вносимые аллелем 577X α-актинина-3. Кроме этого, ранее предполагалось, что в мышечных клетках с дефицитом α-актинина-3 происходит переключение с лактатзависимых метаболических путей на аэробные, что приводит к усилению производства тепла и, соответственно, может быть полезным свойством при адаптации к холоду [5]. Однако частота этого генетического варианта у коренного населения Северо-Востока Азии отнюдь не высока, и поэтому гипотеза о том, что распространение аллеля 577X может иметь адаптивное значение, по всей видимости, не поддерживается.

Благодарности

Работа выполнена при финансовой поддержке программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Поисковые фундаментальные научные исследования в интересах развития Арктической зоны Российской Федерации». Авторы благодарны докторам Т. Кивисилд (T. Kivisild) и Ф. Клементе (F. Clemente) (Кембриджский университет, Англия) за помощь в работе.

About the authors

Boris A Malyarchuk

Institute of Biological Problems of the North FEB RAS

Author for correspondence.
Email: malyarchuk@ibpn.ru

Doctor Biol Sci, Laboratory Head, Genetics Laboratory

Russian Federation, Magadan, Russia

Miroslava V Derenko

Institute of Biological Problems of the North FEB RAS

Email: mderenko@mail.ru

Doctor Biol Sci, Principal Researcher, Genetics Laboratory

Russian Federation, Magadan, Russia

Galina A Denisova

Institute of Biological Problems of the North FEB RAS

Email: gad@ibpn.ru

Candidate Biol Sci, Senior Researcher, Genetics Laboratory

Russian Federation, Magadan, Russia

References

Supplementary files