Влияние псевдоэксфолиативного синдрома на морфологические свойства роговицы по данным конфокальной in vivo микроскопии

Полный текст

Введение

Псевдоэксфолиативный синдром (ПЭС) — системное, ассоциированное с возрастом заболевание, для которого характерна продукция и накопление внеклеточного амилоидподобного материала [3, 5–7]. ПЭС поражает множество тканей и органов, но именно офтальмологические проявления являются основой для постановки диагноза [3, 4, 6]. Это возможно благодаря тому, что рутинного биомикроскопического исследования достаточно для обнаружения псевдоэксфолиативного материала (ПЭМ). Типичным является обнаружение ПЭМ на передней капсуле хрусталика и по зрачковому краю радужной оболочки. Скопления его также могут быть найдены на эндотелии, структурах угла передней камеры, поверхности радужной оболочки и связках Цинна [3, 6]. Наличие ПЭС предрасполагает к развитию широкого спектра внутриглазных осложнений: факодонеза, подвывиха хрусталика, развитию закрытоугольной глаукомы, плохому мидриазу, кератопатии и т. д. [3–7].

ПЭС является причиной развития, так называемой, атипичной эндотелиальной дистрофии. Эндотелиопатия, ассоциированная с ПЭС, медленно прогрессирующее заболевание эндотелия роговицы, всегда двустороннее, но асимметричное. Приводит к ранней декомпенсации эндотелия роговицы, которая может быть причиной развития буллёзной кератопатии и резкого снижения зрения [8, 9].

Согласно данным нескольких исследований, для ПЭС также характерно снижение чувствительности роговицы, уменьшение толщины центральной зоны роговой оболочки и нарушение стабильности слёзной плёнки, приводящее к поражению тканей глазной поверхности [1, 8, 10, 11]. Остаётся открытым вопрос о том, какие именно морфологические изменения лежат в основе этих проявлений. Оценить клеточное строение роговицы, лимба и конъюнктивы в режиме реального времени in vivo возможно при помощи конфокальной микроскопии. Большая разрешающая способность позволяет не только визуализировать ткани на клеточном уровне, но и измерить толщину слоёв, оценить количество, форму и размер клеток, в частности клеток эпителия, стромы и эндотелия роговицы [12–16].

Основная цель данной работы — оценить особенности морфологического строения роговой оболочки при ПЭС.

Материалы и методы

В рамках исследования был обследован 21 пациент на базе отделения офтальмологии № V ГМПБ № ٢. Все пациенты были разделены на две группы: основную группу составили 12 пациентов с ПЭС, группу контроля — 9 пациентов без ПЭС. Основным диагностическим критерием ПЭС было обнаружение ПЭМ на передней капсуле хрусталика, на зрачковом крае радужной оболочки или в углу передней камеры. Группы были равноценны по полу и возрасту (табл. 1).

 

Таблица 1. Распределение групп по полу и возрасту (n — количество пациентов)

Table 1. Patients distribution by sex and age (n = patients’ number)

Показатели		Основная группа, n = 12	Группа контроля, n = 9	Достоверность разницы, р
Возраст		72,2 ± 3,8	73,3 ± 4,1	0,51
Пол	Мужчины	3 (25 %)	3 (33,3 %)	0,21
	Женщины	9 (75 %)	6 (66,6 %)

 

Помимо стандартного офтальмологического обследования всем пациентам выполнялась конфокальная микроскопия. В рамках данной работы был использован лазерный сканирующий конфокальный микроскоп Rostock Cornea Module (RCM) на базе Heidelberg Retina Tomograph 3 (HRT3, Heidelberg Engineering GmbH, Germany). Исследование проводилось под эпибульбарной анестезией при помощи одноразовых стерильных колпачков.

HRT3-RCM использует гелий-неоновый диодный лазер с длиной волны 670 нм. Размер исследуемой области — 400 × 400 мкм, размер изображения — 384 × 384 пикселя.

Оценка морфологических свойств роговой оболочки выполнялась в центральной зоне. Среднее количество фотографий на каждого пациента в среднем составило около ١٠٠٠. Для анализа выбирались три наиболее чётких фотографии каждого из следующих слоёв: поверхностный эпителий, слой базальных клеток эпителия, слой суббазальных нервных волокон, передняя строма и задняя строма. Оценку снимка проводил один исследователь, при этом от него были скрыты все данные о пациентах, включая офтальмологический статус.

Для качественного анализа морфологических свойств роговицы мы использовали алгоритм оценки состояния тканей глазной поверхности при помощи конфокальной микроскопии in vivo (табл. 2), предложенный нами ранее. Оценка показателей производилась по балльной системе в зависимости от их выраженности. В каждой группе высчитывался средний балл, отражающий выраженность того или иного показателя.

 

Таблица 2. Алгоритм оценки качественных показателей состояния роговицы при помощи конфокальной микроскопии in vivo

Table 2. Ocular surface assessment algorithm with confocal microscopy in vivo

Показатель	Баллы
Дендритические клетки (Лангерганса)	0–3 балла
Очаги десквамации поверхностного эпителия	0–3 балла
Гиперрефлективные межклеточные микровключения	0–3 балла
Уплотнение боуменовой мембраны	0–3 балла
Гранулоподобные структуры суббазальных нервных волокон	0–3 балла

 

Среди показателей, отражающих морфологические свойства роговицы, количественно были оценены плотность клеток эпителия, стромы, нервных волокон суббазального сплетения, а также длина и коэффициент извитости последних.

Анализ плотности клеток выполнялся для крыловидных клеток, клеток базального слоя эпителия, клеток передней и задней стром. В норме плотность промежуточных клеток составляет около 5000 кл/мм2, базальных клеток — в среднем от 3600 до 8996 кл/мм2 [12, 13, 17]. Плотность кератоцитов наибольшая в передней строме [18, 19–21].

Состояние суббазального нервного сплетения оценивалось с помощью полуавтоматического аналитического программного обеспечения CCMetrics Image Analysis Software v.1.1. Основными оценочными показателями были плотность волокон, а также их ветвей, плотность нервных волокон, а также коэффициент извитости. Расчёт показателей осуществлялся в соответствии с методикой, описанной К.I. Kinard et al. Плотность волокон и их ветвей оценивалась как в поле зрения, так и в 1 мм2. Плотность нервных волокон рассчитывалась следующим образом: длина нервных волокон × коэффициент (0,00075) /площадь сканирования. Коэффициент извитости рассчитывался автоматически [22].

Критерии исключения: дистрофии роговицы, применение контактных линз, гипотензивных препаратов и препаратов искусственной слезы, а также сахарный диабет.

Статистическая обработка данных выполнялась в программе SPSS Statistics v20.0. Проверка нормальности осуществлялась при помощи критерия Колмогорова – Смирнова. Соотношение количественных переменных в двух независимых группах оценивали по t-тесту. При р < 0,05 различия считались статистически значимыми.

Результаты

Среднее количество дендритических клеток у пациентов основной группы было больше, чем у пациентов группы контроля. У ٣٣,٤ ٪ группы контроля в оптическом центре дендритические клетки отсутствовали (табл. 3, рис. 1).

 

Таблица 3. Результаты качественной оценки морфологических свойств роговицы в исследуемых группах (n — количество пациентов)

Table 3. Results of morphological corneal changes in groups (n — number of patients)

Показатель	Средний балл, основная группа (n = 12)	Средний балл, группа контроля (n = 9)	Достоверность разницы, p
Дендритические клетки (Лангерганса)	1,75	1,3	0,0004
Очаги десквамации поверхностного эпителия	1,75	1
Гиперрефлективные межклеточные микровключения	1,75	0,2
Уплотнение боуменовой мембраны	2,4	1,3
Гранулоподобные структуры суббазальных нервных волокон	2,1	1,1

 

Рис. 1. Дендритические клетки (Лангерганса): а — у пациентов без псевдоэксфолиативного синдрома,  b — у пациентов с псевдоэксфолиативым синдромом

 

У пациентов обеих групп наблюдались очаги десквамации поверхностного эпителия разной степени выраженности: основной группы преимущественно средней степени выраженности, у пациентов группы контроля — лёгкой степени выраженности (см. табл. 3, рис. 2).

 

Риc. 2. Очаги десквамации поверхностного эпителия: а — у пациентов без псевдоэксфолиативного синдрома,  b — у пациентов с псевдоэксфолиативным синдромом

 

У пациентов обеих групп были обнаружены гиперрефлективные межклеточные микровключения, однако у пациентов с ПЭС их количество достоверно больше (см. табл. 3, рис. 3).

 

Рис. 3. Гиперрефлективные межклеточные микровключения: a — у пациентов без псевдоэксфолиативного синдрома, b — у пациентов с псевдоэксфолиативным синдромом

 

У всех пациентов (100  ٪) основной группы было выявлено уплотнение боуменовой мембраны: средней степени — у ٥٨,٤ ٪ , тяжёлой степени — у 33,3 ٪. В группе контроля эти цифры составили ٣٣,٣  и 12,8 ٪ соответственно (см. табл. 3, рис. 4).

 

Рис. 4. Уплотнение боуменовой мембраны: a — у пациентов без псевдоэксфолиативного синдрома, b — у па циентов с псевдоэксфолиативным синдромом

 

У пациентов с ПЭС наблюдалась выраженная извитость суббазальных нервных волокон (см. табл. 3, рис. 5).

 

Риc. 5. Извитость суббазальных нервных волокон: a — у пациентов без псевдоэксфолиативного синдрома,  b — у пациентов с псевдоэксфолиативным синдромом

 

Гранулоподобные структуры суббазальных нервных волокон наблюдались у всех пациентов основной группы и лишь у двух пациентов группы контроля (см. табл. 3, рис. 6).

 

Рис. 6. Гранулоподобные структуры суббазальных нервных волокон: a — у пациентов без псевдоэксфолиативного синдрома, b — у пациентов с псевдоэксфолиативным синдромом

 

Таким образом, у пациентов с ПЭС имеют место достоверно более выраженные морфологические изменения передних отделов роговицы, чем у пациентов группы контроля (p = 0,0004).

Основные показатели, касающиеся состояния суббазальных нервных волокон, за исключением количества их ветвей, достоверно не отличались между пациентами обеих групп. Количество ветвей суббазальных нервных волокон было достоверно выше у пациентов с ПЭС (табл. 4).

 

Таблица 4. Показатели состояния суббазальных нервных сплетений в исследуемых группах (n — количество пациентов)

Table 4. State of subbasal nerve plexus in groups (n — number of patients)

Показатель	Основная группа, n = 12	Группа контроля, n = 9	Достоверность разницы, p
Количество нервных волокон в поле зрения	3,25 ± 1,08	3,89 ± 1,22	0,35
Количество нервных волокон на ١ мм2	20,3 ± 6,77	24,3 ± 7,64	0,35
Количество ветвей нервных волокон в поле зрения	7,67 ± 1,2	2,56 ± 0,8	0,045
Количество ветвей нервных волокон на ١ мм2	47,9 ± 13,5	16,0 ± 4,94	0,045
Суммарная длина всех нервных волокон в поле зрения, мм	1390 ± 294	1310 ± 280	0,81
Плотность нервных волокон, мм/мм2	6,49 ± 1,3	6,13 ± 1,1	0,81
Коэффициент извитости	0,067 ± 0,002	0,052 ± 0,002	0,48

 

Плотность клеток во всех исследуемых слоях роговицы была достоверно ниже в основной группе, чем в группе контроля. Наибольшая разница была отмечена для базальных клеток эпителия, наименьшая — для кератоцитов задней стромы (p = 0,012 и p = 0,036 соответственно). Полученные данные указывают на влияние ПЭС преимущественно на плотность клеток эпителия роговицы (табл. 5).

 

Таблица 5. Оценка плотности клеток эпителия и стромы роговицы в исследуемых группах (n — количество пациентов)

Table 5. Evaluation of cell densities in groups (n — number of patients)

Плотность клеток	Основная группа, n = 12	Группа контроля, n = 9	Достоверность разницы, p
Крыловидных	5465 ± 600	6355 ± 614	0,019
Базальных	8315 ± 705	9430 ± 754	0,012
Передней стромы	614 ± 51	736 ± 121	0,026
Задней стромы	397 ± 73	478 ± 59	0,036

 

Обсуждение

Конфокальная in vivo микроскопия позволяет быстро и неинвазивно получить микроструктурные снимки роговицы с высоким разрешением. Исследований, посвящённых изучению состояния роговицы при помощи конфокальной микроскопии, при ПЭС мало. И ни в одном из них не оценивались такие показатели, как распространённость дендритических клеток и гиперрефлективных межклеточных микровключений, выраженность очагов десквамации поверхностного эпителия и уплотнения боуменовой мембраны. Martone et al. указали на единичный случай наличия дендритических клеток и гиперрефлективных межклеточных микровключений при ПЭС [23]. Несколько авторов отметили возможность визуализации ПЭМ на эндотелии роговицы при помощи конфокальной микроскопии [12, 24, 25].

Наше исследование было направлено на прицельно полное исследование морфологического строения роговицы, возможное благодаря конфокальной in vivo микроскопии.

У пациентов с ПЭС наблюдались значительно более выраженные очаги десквамации поверхностного эпителия. Это лишний раз подтверждает тот факт, что ПЭС способствует повреждению тканей глазной поверхности.

Значительное количество дендритических клеток вблизи суббазальных нервных сплетений, наблюдавшееся при ПЭС, указывает на местный воспалительный процесс. Мы предполагаем, что скопления гиперрефлективных межклеточных микровключений, наблюдающиеся в глубоких слоях эпителия и в передних слоях стромы, представляют собой ПЭМ, который провоцирует развитие местных воспалительных изменений. В свою очередь, избыток ПЭМ и инфильтрация дендритическими клетками, возможно, играют роль в нейропатии, затрагивающей суббазальные нервные сплетения. Ряд авторов сообщает о снижении плотности и увеличении извитости суббазальных нервных волокон при ПЭС [8, 24, 25]. Приведённые нами данные не продемонстрировали достоверного снижения их плотности при ПЭС. Тем не менее при ПЭС наблюдалось достоверно большее количество ветвей нервных волокон и увеличение количества гранулоподобных структур суббазальных нервных сплетений, что может указывать либо на их повреждение, либо на повышение их метаболической активности.

Уплотнение боуменовой оболочки наблюдалось у пациентов обеих групп, однако у пациентов с ПЭС оно было достоверно более выражено. Мы считаем, что уплотнение боуменовой мембраны является признаком инволюционных изменений, но ПЭС, в свою очередь, их отягощает.

У пациентов с ПЭС наблюдалось достоверное снижение плотности крыловидных и базальных клеток эпителия, а также клеток передней и задней стромы. Патогенетические механизмы этих изменений неясны, но можно предположить следующие: оксидативный стресс и скопления псевдоэксфолиативного материала.

Оксидативный стресс — один из наиболее значимых механизмов повреждения клетки. Центральным звеном оксидативного стресса является увеличение концентрации активных форм кислорода (АФК), которое вызывает образование свободных радикалов, повреждение клеточных макромолекул, которое приводит к дисфункции, а в дальнейшем и гибели клеток [26].

Количество кератоцитов может уменьшаться с возрастом в ответ на повышение оксидативного повреждения и уменьшение антиоксидантной защиты. Все АФК являются окислителями клеточных компонентов и в больших количествах необратимо повреждают клетки. Защита организма от АФК осуществляется функционированием антиоксидантной системы [26]. Demirdögen et al. сообщили о достоверно значимом низком уровне антиоксидантной защиты у пациентов с ПЭС и псевдоэксфолиативной глаукомой по сравнению с группой контроля и о том, что недостаток антиоксидантов может вносить свой вклад в развитие этих двух патологических состояний [27].

Второй возможной причиной снижения плотности клеток является скопление ПЭМ. Имеются предположения, что гиперрефлективные включения — это и есть ПЭМ, который в свою очередь вызывает местный воспалительный процесс и активизирует апоптоз кератоцитов [26, 27].

Таким образом, ПЭС вызывает значительные морфологические изменения роговицы, а конфокальная микроскопия является уникальным методом, позволяющим детально их изучить.

Об авторах

Виталий Витальевич Потёмкин

ФГБОУ ВО «ПСПбГМУ им. И.П. Павлова» Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: potem@inbox.ru

канд. мед. наук, доцент кафедры офтальмологии

Россия, Санкт-Петербург

Татьяна Сергеевна Варганова

СПб ГБУЗ «Городская многопрофильная больница № 2»

Email: varganova.ts@yandex.ru

врач-офтальмолог

Россия, Санкт-Петербург

Евгений Леонидович Акопов

ФГБОУ ВО «ПСПбГМУ им. И.П. Павлова» Минздрава России

Email: elacop@mail.ru

канд. мед. наук, доцент кафедры офтальмологии

Россия, Санкт-Петербург

Елена Владимировна Агеева

ФГБОУ ВО «ПСПбГМУ им. И.П. Павлова» Минздрава России

Email: ageeva_elena@inbox.ru

клинический ординатор, кафедра офтальмологии

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы