Влияние длины и структуры плеч гомологии на эффективность интеграции длинного трансгена в область разрыва, создаваемого нуклеазами SpCas9 или AsCpf1

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Одним из многообещающих новых подходов к лечению ВИЧ-инфекции является CRISPR/Cas-опосредованный нокаут гена рецептора CCR5 с последующей интеграцией антиВИЧ-гена в область разрыва. Нокауту гена CCR5 посвящено множество работ, однако эффективность последующей таргетной интеграции протяженных фрагментов остается недостаточно изученной. Чтобы оценить эффективность этого подхода, мы изучили встраивание кассеты, экспрессирующей ген EGFP, в локус CCR5 с использованием двух разных нуклеаз (SpCas9 и AsCpf1) и различных вариантов донорной ДНК, доставляемой в составе рекомбинантных аденоассоциированных вирусных векторов (rAAV). Для каждой из нуклеаз были сконструированы пять вариантов донорной ДНК, отличающихся длиной плеч гомологии (от 150 до 1000 п.н.) или их структурой. Эффективность интеграции трансгена с плечами гомологии 150 п.н. оказалась самой низкой при использовании обеих нуклеаз и достоверно отличалась от конструкций с более длинными плечами гомологии. Также показано, что наличие в донорной ДНК сайтов разрезания нуклеазы, фланкирующих кассету с плечами гомологии, не влияет на эффективность интеграции трансгена при AAV-доставке. Максимальная эффективность встраивания (59 ± 6%) достигнута при использовании нуклеазы AsCpf1 и экспрессионной кассеты с плечами гомологии длиной 600 п.н.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Ю. А. Таран

Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью Федерального медико-биологического агентства

Автор, ответственный за переписку.
Email: taran.julia01@gmail.com
Россия, Москва

Р. Р. Минтаев

Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью Федерального медико-биологического агентства

Email: taran.julia01@gmail.com
Россия, Москва

Д. В. Глазкова

Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью Федерального медико-биологического агентства

Email: taran.julia01@gmail.com
Россия, Москва

Б. В. Белугин

Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью Федерального медико-биологического агентства

Email: taran.julia01@gmail.com
Россия, Москва

Е. В. Богословская

Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью Федерального медико-биологического агентства

Email: taran.julia01@gmail.com
Россия, Москва

Г. А. Шипулин

Центр стратегического планирования и управления медико-биологическими рисками здоровью Федерального медико-биологического агентства

Email: taran.julia01@gmail.com
Россия, Москва

Список литературы

  1. Mautino M.R. (2002) Lentiviral vectors for gene therapy of HIV-1 infection. Curr. Gene Ther. 2, 23–43.
  2. Orlova O.V., Glazkova D.V., Mintaev R.R., Tsyganova G.M., Urusov F.A., Shipulin G.A., Bogoslovskaya E.V. (2023) Comparative evaluation of the activity of various lentiviral vectors containing three anti-HIV genes. Microorganisms. 11, 1053.
  3. Chang L.-J., Liu X., He J. (2005) Lentiviral siRNAs targeting multiple highly conserved RNA sequences of human immunodeficiency virus type 1. Gene Ther. 12, 1133–1144.
  4. Milone M.C., O’Doherty U. (2018) Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia. 32, 1529–1541.
  5. Naeem M., Majeed S., Hoque M.Z., Ahmad I. (2020) Latest developed strategies to minimize the off-target effects in CRISPR-Cas-mediated genome editing. Cells. 9, 1608.
  6. Papapetrou E.P., Schambach A. (2016) Gene insertion into genomic safe harbors for human gene therapy. Mol. Ther. 24, 678–684.
  7. Lucotte G. (2002) Frequencies of 32 base pair deletion of the (Delta 32) allele of the CCR5 HIV-1 co-receptor gene in Caucasians: a comparative analysis. Infect. Genet. Evol. 1, 201–205.
  8. Karuppusamy K.V., Demosthenes J.P., Venkatesan V., Christopher A.C., Babu P., Azhagiri M.K., Jacob A., Ramalingam V.V., Rangaraj S., Murugesan M.K., Marepally S.K., Varghese G.M., Srivastava A., Kannangai R., Thangavel S. (2022) The CCR5 gene edited CD34+CD90+ hematopoietic stem cell population serves as an optimal graft source for HIV gene therapy. Front. Immunol. 13, 792684.
  9. Xu L., Yang H., Gao Y., Chen Z., Xie L., Liu Y., Liu Y., Wang X., Li H., Lai W., He Y., Yao A., Ma L., Shao Y., Zhang B., Wang C., Chen H., Deng H. (2017) CRISPR/Cas9-mediated CCR5 ablation in human hematopoietic stem/progenitor cells confers HIV-1 resistance in vivo. Mol. Ther. 25, 1782–1789.
  10. Liu M., Rehman S., Tang X., Gu K., Fan Q., Chen D., Ma W. (2019) Methodologies for improving HDR efficiency. Front. Genet. 9. 691. doi: 10.3389/fgene.2018.00691
  11. Zhang J.-P., Li X.L., Li G.H., Chen W., Arakaki C., Botimer G.D., Baylink D., Zhang L., Wen W., Fu Y.W., Xu J., Chun N., Yuan W., Cheng T., Zhang X.B. (2017) Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biol. 18, 35.
  12. Tóth E., Weinhardt N., Bencsura P., Huszár K., Kulcsár P.I., Tálas A., Fodor E., Welker E. (2016) Cpf1 nucleases demonstrate robust activity to induce DNA modification by exploiting homology directed repair pathways in mammalian cells. Biol. Direct. 11, 46.
  13. Irion U., Krauss J., Nüsslein-Volhard C. (2014) Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development (Cambridge, England). 141, 4827–4830.
  14. Yao X., Zhang M., Wang X., Ying W., Hu X., Dai P., Meng F., Shi L., Sun Y., Yao N., Zhong W., Li Y., Wu K., Li W., Chen Z.J., Yang H. (2018) Tild-CRISPR allows for efficient and precise gene knockin in mouse and human cells. Dev. Cell. 45, 526–536.e5.
  15. Bak R.O., Porteus M.H. (2017) CRISPR-mediated integration of large gene cassettes using AAV donor vectors. Cell Rep. 20, 750–756.
  16. Глазкова Д.В., Ветчинова А.С., Богословская Е.В., Жогина Ю.А., Маркелов М.Л., Шипулин Г.А. (2013) Подавление экспрессии гена CCR5-рецептора человека с помощью искусственных микроРНК. Молекуляр. биология 47(3), 475–485.
  17. Kimura T. Ferran B., Tsukahara Y., Shang Q., Desai S., Fedoce A., Pimentel D.R., Luptak I., Adachi T., Ido Y., Matsui R., Bachschmid M.M. (2019) Production of adeno-associated virus vectors for in vitro and in vivo applications. Sci. Rep. 9, 13601.
  18. Guo P., El-Gohary Y., Prasadan K., Shiota C., Xiao X., Wiersch J., Paredes J., Tulachan S., Gittes G.K. (2012) Rapid and simplified purification of recombinant adeno-associated virus. J. Virol. Methods. 183, 139–146.
  19. Минтаев Р.Р., Глазкова Д.В., Таран Ю.А., Богословская Е.В., Шипулин Г.А. (2025) Повышение эффективности и безопасности редактирования гена CCR5 человека путем подбора оптимальных направляющих РНК Cas9 и Cas12a. Молекуляр. биология. 59(2), ХХ-ХХ.
  20. Gutierrez-Guerrero A., Abrey Recalde M.J., Mangeot P.E., Costa C., Bernadin O., Périan S., Fusil F., Froment G., Martinez-Turtos A., Krug A., Martin F., Benabdellah K., Ricci E.P., Giovannozzi S., Gijsbers R., Ayuso E., Cosset F.L., Verhoeyen E. (2021) Baboon envelope pseudotyped “Nanoblades” carrying Cas9/gRNA complexes allow efficient genome editing in human T, B, and CD34+ cells and knock-in of AAV6-encoded donor DNA in CD34+ cells. Front. Genome Editing. 3, 604371.
  21. Safari F., Zare K., Negahdaripour M., Barekati-Mowahed M., Ghasemi Y. (2019) CRISPR Cpf1 proteins: structure, function and implications for genome editing. Cell Biosci. 9, 36.
  22. Maslennikova A., Mazurov D. (2022) Application of CRISPR/Cas genomic editing tools for HIV therapy: toward precise modifications and multilevel protection. Front. Cell. Infect. Microbiol. 12, 880030. doi.org: 10.3389/fcimb.2022.880030.
  23. Hung K.L., Meitlis I., Hale M., Chen C.Y., Singh S., Jackson S.W., Miao C.H., Khan I.F., Rawlings D.J., James R.G. (2018) Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells. J. Am. Soc. Gene Ther. 26, 456–467.
  24. Hendel A., Kildebeck E.J., Fine E.J., Clark J., Punjya N., Sebastiano V., Bao G., Porteus M.H. (2014) Quantifying genome editing outcomes at endogenous loci using SMRT sequencing. Cell Rep. 7, 293–305.
  25. Chu V.T., Weber T., Wefers B., Wurst W., Sander S., Rajewsky K., Kühn R. (2015) Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 33, 543–548.
  26. Odé Z., Condori J., Peterson N., Zhou S., Krenciute G. (2020) CRISPR-mediated non-viral site-specific gene integration and expression in T cells: protocol and application for T-cell therapy. Cancers. 12, 1704.
  27. Shin S.W., Lee J.S. (2020) Optimized CRISPR/Cas9 strategy for homology-directed multiple targeted integration of transgenes in CHO cells. Biotechnol. Bioeng. 117, 1895–1903.
  28. Kim S., Kim D., Cho S.W., Kim J., Kim J. S. (2014) Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24, 1012–1019.
  29. Asaad W., Volos P., Maksimov D., Khavina E., Deviatkin A., Mityaeva O., Volchkov P. (2023) AAV genome modification for efficient AAV production. Heliyon. 9, e15071.
  30. Zetsche B., Gootenberg J.S., Abudayyeh O.O., Slaymaker I.M., Makarova K.S., Essletzbichler P., Volz S.E., Joung J., van der Oost J., Regev A., Koonin E.V., Zhang F. (2015) Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163, 759–771.
  31. Ding R., Chao C.-C., Gao Q. (2022) High-efficiency of genetic modification using CRISPR/Cpf1 system for engineered CAR-T cell therapy. Methods Cell Biol. 167, 1–14.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Нокаут гена CCR5-EGFP в клеточной линии HT1080-CCR5-EGFP. а – Схема эксперимента по оценке эффективности нокаута РНП-комплексами SpCas9/L96 или AsCpf1/cL652. б – Эффективность нокаута гена CCR5-EGFP РНП-комплексами SpCas9/L96 или AsCpf1/cL652 (по четыре повтора для каждого РНП-комплекса). Показаны средние значения и стандартные отклонения. В качестве отрицательного контроля (K-) использовали клетки, не подвергнутые электропорации.

Скачать (397KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Характеристики AAV-векторов, кодирующих донорную ДНК. а – Схема rAAV-векторов. CRISRP-сайт – сайт разрезания РНП, ITR – инвертированные концевые повторы. б – Структура последовательности, интегрируемой в целевую область. EGFP – ген зеленого флуоресцентного белка, pPGK – промотор, WPRE – посттранскрипционный регуляторный элемент, SV40 PA – сигнал терминации транскрипции. в – Схема разрезания геномной ДНК нуклеазой AsCpf1 и встраивания донорной ДНК с мутацией PAM. г – Инфекционный титр rAAV-векторов. Представлены средние значения концентраций rAAV и стандартные отклонения.

Скачать (702KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Оценка эффективности интеграции трансгена EGFP. а – Эффективность интеграции при электропорации клеток HT1080 РНП-комплексами SpCas9/L96 или AsCpf1/cL652 с последующей трансдукцией одним из 10 rAAV. б – Эффективность трансдукции, вычисляемая по доле популяции ЕGFP+ клеток через 48 ч после трансдукции rAAV без предварительной электропорации. Показаны средние арифметические значения и стандартное отклонение. “К–” – нетрансдуцированные клетки HT1080. в – Частота интеграции трансгена EGFP- после электропорации клеток РНП SpCas9/L96 или AsCpf1/cL652 и трансдукции rAAV с донорной ДНК. Характеристики донорной ДНК приведены в таблице под диаграммой: в строке Длина плеч гомологии указан размер одного плеча гомологии, наличие сайтов CRISPR обозначено знаком “+”. Приведены средние значения и стандартные отклонения. Статистическую значимость различий оценивали с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA), после которого проводили тест Тьюки для парных сравнений между группами. Значимость различий между группами: *p-value 0.01 < 0.05, **p-value 0.001 < 0.01, ***p-value 0.0001 < 0.001, ****p-value < 0.0001.

Скачать (551KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2025