Разработка и валидация методики количественного определения ротенона в гомогенате коры головного мозга крыс методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Обложка

Цитировать

Полный текст

Аннотация

Введение. Ротенон — нейротоксин, вызывающий повреждение дофаминергических нейронов чёрной субстанции и используемый в качестве средства для моделирования экспериментального паркинсонического синдрома. Разработка методики количественного определения ротенона в головном мозге позволит предложить и апробировать новые стратегии фармакотерапии паркинсонизма, связанные со снижением проникновения нейротоксических веществ в мозг.

Цель исследования заключалась в разработке и валидации ВЭЖХ-методики (высокоэффективная жидкостная хроматография) количественного определения ротенона в коре больших полушарий головного мозга крыс.

Материал и методы. Количественное определение ротенона осуществляли с помощью хроматографической системы Stayer («Аквилон», Россия) с УФ-спектрофотометрическим детектором UVV 104 при длине волны 296 нм в изократическом режиме. Применяли обращенно-фазную хроматографическую колонку Luna C18 100Å (250*4,6) с зернением 5 мкм при температуре 37°С. Состав подвижной фазы: вода деионизированная, ацетонитрил в соотношении 70:30. Определение концентрации ротенона проводили методом абсолютной калибровки по площади пиков.

Пробоподготовка заключалась в гомогенизации 500 мг измельченной лобной доли коры головного мозга крыс в 500 мкл воды очищенной с последующим центрифугированием (1750 g), отбором надосадочной жидкости, осаждением белка ацетонитрилом (2,5 мл). Водный слой упаривали на роторно-вакуумном испарителе. К сухому остатку добавляли 250 мкл подвижной фазы и 100 мкл инжектировали в хроматограф.

Результаты. Методика была валидирована по следующим параметрам: селективность, линейность, точность, прецизионность, пределы обнаружения и определения, перенос пробы, стабильность образцов. Аналитический диапазон составил 62,5−1000,0 нг/г мозга с коэффициентом корреляции более 0,99. Предел обнаружения и количественного определения ротенона составляли соответственно 25,0 и 62,5 нг/г. Расчет внутри- и межцикловой точности и прецизионности показал, что данные параметры не превышают 20% для концентрации, соответствующей нижнему пределу количественного определения, и 15% — для более высоких концентраций. Стабильность методики продемонстрирована при краткосрочном хранении в условиях комнатной температуры, трехкратном цикле заморозки-разморозки при минус 80°С, хранении при минус 80°С в течение 60 сут. Перенос пробы отсутствовал.

Ограничения исследования. Разработанная хроматографическая методика позволяет анализировать содержание ротенона в коре головного мозга крыс в диапазоне концентраций 62,5−1000,0 нг/г.

Заключение. Разработана и валидирована методика количественного определения ротенона в гомогенате коры больших полушарий головного мозга крыс.

Соблюдение этических стандартов. Экспериментальное исследование было одобрено комиссией по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России.

Участие авторов:
Градинарь М.М. — выполнение хроматографических исследований, пробоподготовка;
Щулькин А.В. — статистическая обработка результатов, написание текста;
Черных И.В. — выполнение хроматографических исследо-ваний, расчёт валидационных параметров;
Якушева Е.Н. — руководство исследованием, написание текста.
Все соавторы — утверждение окончательного варианта статьи, ответственность за целостность всех частей статьи.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. 

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Поступила в редакцию: 08 июня 2023 / Принята в печать: 02 февраля 2023 / Опубликована: 30 апреля 2023 

Об авторах

Мария Михайловна Градинарь

ФГБОУ ВО «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Автор, ответственный за переписку.
Email: masha.gradinar1995@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2246-4127
Россия

Алексей Владимирович Щулькин

ФГБОУ ВО «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: alekseyshulkin@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0003-1688-0017
Россия

Иван Владимирович Черных

ФГБОУ ВО «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: ivchernykh88@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5618-7607

Доктор биол. наук, доцент, заведующий кафедрой фармацевтической химии ФГБОУ ВО «Рязанский ГМУ имени академика И.П. Павлова» МЗ РФ, 390026, г. Рязань.

e-mail: ivchernykh88@mail.ru

Россия

Елена Николаевна Якушева

ФГБОУ ВО «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: e.yakusheva@rzgmu.ru
ORCID iD: 0000-0001-6887-4888
Россия

Список литературы

  1. Sherer T.B., Betarbet R., Testa C.M., Seo B.B., Richardson J.R., Kim J.H., et al. Mechanism of toxicity in rotenone models of Parkinson’s disease. Journal of Neuroscience. 2003; 23(34): 10756–64. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.23-34-10756.2003
  2. Watabe M., Nakaki T. Mitochondrial complex I inhibitor rotenone inhibits and redistributes vesicular monoamine transporter 2 via nitration in human dopaminergic SH-SY5Y cells. Molecular Pharmacology. 2008; 74: 933–40. https://doi.org/10.1124/mol.108.048546
  3. Alam M., Schmidt W.J. l-DOPA reverses the hypokinetic behavior and rigidity in rotenone-treated rats. Behavioural Brain Research. 2004; 153: 439–46. https://doi.org/10.1016/j.bbr.2003.12.021
  4. Betarbet R., Sherer T.В., Greenamyre J.T. Animal models of Parkinson Disease. Bioessays. 2002; 24(4): 308–18. https://doi.org/10.1002/bies.10067
  5. De Miranda B.R., Fazzari M., Rocha E.M., Castro S., Greenamyre J.T. Sex differences in rotenone sensitivity reflect the male-to-female ratio in human Parkinson’s disease incidence. Toxicol Sci. 2019; 170(1): 133−43. https://doi.org/10.1093/toxsci/kfz082
  6. Caboni P., Sarais G., Vargiu S., Luca M.A., Garau V.L., Ibba A., Cabras P. LC–MS–MS Determination of Rotenone, Deguelin, and Rotenolone in Human Serum. Chromatographia. 2008; 68: 739−45. https://doi.org/10.1365/s10337-008-0830-0
  7. Di Donna L., Grassi G., Mazzotti F., Perri E., Sindona G. High-throughput assay of rotenone in olive oil using atmospheric pressure chemical ionization tandem mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry. 2004; 39(12): 1437−40. https://doi.org/10.1002/jms.694
  8. Taylor M.J., Keenan G.A., Reid K.B., Fernandez D.U. The utility of ultra-performance liquid chromatography/electrospray ionisation time-of-flight mass spectrometry for multi-residue determination of pesticides in strawberry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2008; 22(17): 2731−46. https://doi.org/10.1002/rcm.3671
  9. Huang J., Liu H., Gu W., Yan Z., Xu Z., Yang Y., et al. A delivery strategy for rotenone microspheres in an animal model of Parkinson’s disease. Biomaterials. 2006; 27: 937−46. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2005.07.005
  10. Черных И.В, Щулькин А.В., Мыльников П.Ю., Гацанога М.В., Есенина А.С., Градинарь М.М., Якушева Е.Н. Функциональная активность гликопротеина-P в гематоэнцефалическом барьере на фоне экспериментального паркинсонического синдрома. Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2019; 27(2): 150−9. https://doi.org/10.23888/PAVLOVJ2019272150-159
  11. Мыльников П.Ю., Черных И.В., Щулькин А.В., Попова Н.М., Якушева Е.Н. ВЭЖХ-методика количественного анализа фексофенадина в печени кроликов. Фармация и фармакология. 2020; 8(1): 40–7. https://doi.org/10.19163/2307-9266-2020-8-1-40-47

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Градинарь М.М., Щулькин А.В., Черных И.В., Якушева Е.Н., 2023


СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 81728 от 11 декабря 2013.