Biologic Characteristics of Bone Substituting Tissue Engineering Construction Based on Calcium Phosphate Ceramics, Autologous Mesenchymal Stromal Cells and Fibrin Hydrogel

Full Text

Введение. Создание биоматериалов с остеогенными свойствами является актуальной задачей при органотипическом замещении критических костных дефектов [1-3]. Большие надежды в ее решении возлагают на использование мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) в составе тканеинженерной конструкции на основе биоматериалов третьего поколения, которые, согласно классификации L. HenchL и J. Polak (2002), должны обеспечивать перенос и фиксацию в месте костного дефекта жизнеспособных ММСК с сохранением их регенеративного потенциала [4-7]. В большей степени этим характеристикам соответствуют композиционные биоматериалы на основе биогеля и неорганического субстрата [8-10]. Как правило, для этих целей используют пористую кальцийфосфатную керамику (КФК) на основе трикальцийфосфата (ТКФ), которая обладает остеокондуктивными свойствами [7, 11, 12]. Целью работы являлось исследование in vivo костезамещающего биоматериала, состоящего из пористой КФК фазового состава ТКФ, аутологичных ММСК (ауто-ММСК) и фибринового гидрогеля (ФГ). При создании данного биоматериала использовали компоненты отечественного производства: гранулят пористой резорбируемой КФК на основе ТКФ, высокоактивные, очищенные и вирусинактивированные препараты фибриногена и тромбина. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использовали взрослых кроликов породы «Советская шиншилла», самцы и самки массой 2,8-3,5 кг в возрасте 10-12 мес в начале эксперимента, которых доставляли из филиала «Белый мох» Научного центра биомедицинских технологий РАМН. Животных содержали в индивидуальных сетчатых клетках, они получали стандартный комбикорм из травяной муки и сочные корма. Эксперименты были одобрены комиссией по биомедицинской этике при институте медико-биологических проблем РАН, (протокол № 257). Синтез порошка ТКФ. Для получения порошка ТКФ был использован метод осаждения из растворов, основанный на осаждении из 0,5М раствора нитрата кальция Ca(NO3)2×4H2O и 0,5М раствора фосфата аммония (NH4)2HPO4. Реакцию проводили при температуре 25°С. Значение рН = 7 реакционной смеси поддерживали добавлением NH4OH. Взаимодействие реагентов происходит по реакции: 3Ca(NO3)+ 2(NH4)2HPO4 + 2NH4OH → Ca3(PO4)2 + 6NH4NO3 + 2H2О. В реакционный сосуд, снабженный механической мешалкой, помещали 0,5М раствор Ca(NO3)2. Затем медленно, при постоянном перемешивании по каплям добавляли 0,5М раствор (NH4)2HPO4. Осадок отфильтровывали, сушили в сушильном шкафу при температуре 100°С. Последующее прокаливание порошка проводили при температуре 700°С. Получение объемных керамических материалов. Из полученной массы порошка готовили шликер: суспензию порошок/биополимер смешивали с водным раствором полиакриламида (ПАА) в соотношении порошок:вода:ПАА 1:1:1, полученным шликером пропитывали заготовки из ячеистой полимерной матрицы. Обжиг формовок ТКФ проводили в силитовой печи сопротивления, в атмосфере воздуха, со скоростью нагрева по режиму: до 300°С за 30 мин без выдержки, до 600°С за 2,5 ч с последующей выдержкой в течение 30 мин, до 1300°С за 1,5 ч с выдержкой 2 ч (с целью выжигания органической составляющей, с сохранением целостной структуры керамики). Охлаждение образцов до комнатной температуры проводили в выключенной печи. Для дальнейших экспериментов in vivo отбирали фракцию размером 250х50 мкм, которую подвергали стерилизации автоклавированием при температуре 180±50°С в течение 1 ч согласно МУ-287-113. Получение концентратов тромбина и фибриногена. Препарат фибриногена получали из криопреципитата свежезамороженной плазмы доноров. Раствор криопреципитата обрабатывали гелем гидроокиси алюминия, что снижало активность факторов протромбинового комплекса с 0,7 до 0,01 МЕ/мл и предотвращало активацию фибриногена в процессе дальнейшего выделения [13]. Фибриноген осаждали, добавляя полиэтиленгликоль до концентрации 2-3 г/л. Осадок растворяли в цитратном буфере до концентрации 25-30 г/л, поддерживая рН в диапазоне 7,5-8,0. В полученном растворе проводили инактивацию вирусов, добавляя Твин-80 и три-н-бутил фосфат до концентраций 1% и 0,03% соответственно. Процесс инактивации вирусов осуществляли при температуре 25°С в течение 6 ч. Вирусинактивирующие реагенты удаляли трехкратной экстракцией раствора фибриногена вазелиновым маслом. Затем фибриноген двукратно переосаждали, добавляя в раствор глицин до концентрации 1,5 М/л. Фибриноген выпадал в осадок, а большинство балластных белков удаляли. После переосаждения фибриноген растворяли в цитратном буфере до концентрации 25 г/л, фильтровали через стерилизующий фильтр, разливали во флаконы по 2 мл и лиофилизировали. Для получения раствора фибриногена к лиофилизированному концентрату фибриногена добавляли 2 мл дистиллированной воды для инъекций и помешивали на водяной бане при 37°С в течение 5 мин до полного растворения препарата. Криосупернатант нативной плазмы (КСН) доноров использовали в качестве сырья для получения тромбина. Из КСН выделяли протромбиновый комплекс сорбцией на DEAE-Sepharose FF методом колоночной хроматографии или на DEAE-Sephadex A-50 методом хроматографии в объеме [14]. В результате получали раствор, содержащий 8-12 МЕ/мл протромбина. Для активации протромбина раствор диализовали для доведения концентрации хлорида натрия в нем до физиологического уровня 0,15 М, затем добавляли хлорид кальция и оставляли на 18 ч при перемешивании при температуре 10-15°С [15]. В процессе инкубации под действием ионов кальция и компонентов протромбинового комплекса происходила трансформация протромбина в активный тромбин, причем из 1 МЕ протромбина удалось получить 70-80 МЕ тромбина. В растворе тромбина проводили инактивацию вирусов в условиях, описанных выше. Очистку тромбина от продуктов вирусной инактивации и балластных белков проводили хроматографией на СM-Sepharose FF [16]. В результате был получен высокоочищенный тромбин с активностью 2-3 тыс. МЕ/мл. Полученный раствор разводили буфером для лиофилизации до активности тромбина около 500 МЕ/мл, добавляли для стабилизации человеческий альбумин до концентрации 10 г/л, стерильно фильтровали, разливали во флаконы по 1 мл и лиофилизировали. Для получения раствора тромбина к лиофилизированному концентрату тромбина добавляли 5 мл физиологического раствора. Получение, культивирование, индукция к остеогенной дифференцировке и маркирование ММСК кролика. Для получения ауто-ММСК под футлярной новокаиновой блокадой 20 мл 0,5% раствора новокаина (ОАО «Органика») аспирировали костный мозг из дистальных мыщелков бедренных костей кролика. Получали 1,5-2 мл костного мозга в пробирки с 500 Ед/мл гепарина («Sigma»). Для выделения ядросодержащих клеток костный мозг помещали в питательную среду αМЕМ («ICN») с 0,1 % метилцеллулозы (1500 сП, «Sigma») и оставляли на 40 мин при комнатной температуре. За это время большая часть эритроцитов и гранулоцитов оседала, а ядросодержащие клетки оставались во взвеси. Надосадочную жидкость собирали и осаждали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 мин. Количество ядерных клеток определяли при подсчете с генциан-виолетом (1% раствор на 3% уксусной кислоте). Среднее количество ядросодержащих клеток составило 22∙106. Затем клетки взвешивали в полной питательной среде αMEM с 10% фетальной бычьей сыворотки («Hyclone»), 2 мМ L-глутамина («ICN»), 100 ед/мл пенициллина («Ферейн»), 50 мкг/мл стрептомицина («Ферейн») из расчета 3∙106 клеток на флакон с площадью дна 25 см2. После формирования конфлуентного монослоя клетки снимали 0,25% раствором трипсина, приготовленного на 0,02% EDTA («ICN») в физиологическом растворе («Sigma»), и рассаживали из расчета 4∙103 клеток на 1 см2 поверхности дна флакона. Остеогенную дифференцировку индуцировали добавлением 0,1 мкM дексаметазона, 0,15 мM 2-фосфата аскорбиновой кислоты тринатриевой соли («Sigma») и 3 мM NaH2PO4 («Sigma») в среду для культивирования ММСК. Клетки культивировали в течение 2-5 дней. Для маркирования ММСК использовали лентивекторы третьего поколения LeGo, содержащие ген зеленого белка eGFP и красного белка Cherry (C2), с делетированным промотором. Вирусные стоки получали с помощью кальциевофосфатной трансфекции плазмид phCMVC-VSV-G (R861), pGpur(R1246), pMDLg/pRRE и pRSVRevв клетки PhoenixGP, любезно предоставленных проф. Б. Фейзе (B. Fehse; Universitity Hospital Eppendorf, Гамбург). Вирусные частицы концентрировали в 100 раз путем центрифугирования в течение 3,5 ч при 18000 об/мин. Определение титра вируса проводили на клетках линий 293T и PhoenixGP. Для заражения ММСК лентивирусным вектором из флаконов полностью отбирали среду для культивирования и наносили на подслои вирусные частицы из расчета примерно 3∙107 на флакон с площадью дна 175 см2 в 7 мл среды альфа-MEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 8 мкг/мл полибрена («Sigma»). Через 6 ч среду заменяли на 25 мл полной питательной среды. Заражению подвергали примерно 60% культивированных ММСК. Перед имплантацией ММСК снимали трипсином. Маркерные гены С2 или GFP использовали поочередно в популяции ММСК как индуцированных к остеогенной дифференцировке, так и не индуцированных для исключения влияния генетического маркера на регенеративную функцию культивированных ММСК. Получение ТИК на основе ФГ и ММСК. Первый компонент двухкомпонентной системы получали при добавлении ауто-ММСК в количестве от 1 до 19,8∙106 (в среднем 6,3∙106), взвешенные в 0,5 мл питательной среды к 1 мл раствора фибриногена. Второй компонент представлял собой раствор тромбина с активностью 50 Ед в объеме 0,5 мл. Оба компонента системы можно было ввести через официнальные медицинские иглы диаметром от 0,6 мм и более. При смешивании двух компонентов происходила полимеризация фибриногена, что способствовало фиксации ММСК в составе плотно-эластичного сгустка в полости костного дефекта. Получение ТИК на основе гранулята пористой КФК и ФГ. В состав композиционного материала входили пористые гранулы КФК размером 250 мкм, общей пористостью 70%, (размер пор от 10 до 50 мкм). Первый компонент системы получали следующим образом: в 1 мл раствора фибриногена помещали от 3,4 до 9,9∙106 ММСК в виде взвеси в 0,5 мл питательной среды. Далее к полученному объему добавляли 1 мл гранулята пористой КФК. Добавление керамических гранул в состав данного компонента ТИК делало невозможным инъекционное введение через стандартный медицинский шприц типа Luer. После добавления к первому компоненту 50 Ед тромбина в 0,5 мл физиологического раствора получали плотно-эластичную субстанцию, которая могла быть малоинвазивно введена в костный дефект мыщелка через тубус пластикового медицинского шприца. Пластичность материала позволяла полноценно заполнять полость костного дефекта сложной геометрической формы. Эктопическая подкожная и ортотопическая имплантация в критический дефект спонгиозной кости (мыщелковая модель). Для профилактики инфекционных осложнений всем животным за 3 ч до операции вводили энрофлоксацин в дозе 10 мг/кг подкожно, затем в течение последующих 5 дней в той же дозе подкожно 1 раз в сутки. В качестве модели критического дефекта губчатой кости использовали модель дефекта мыщелков бедренной кости. Всего выполнено 50 операций на 25 животных (использовали обе конечности). Операции проводили в асептических условиях под футлярной анестезией бедра, для чего использовали 20 мл 0,5 % раствора новокаина (ОАО «Органика», Россия). Из проекционного разреза длиной 2 см выделяли наружный мыщелок бедра. Сверлом диаметром 5 мм производили рассверливание наружного мыщелка бедренной кости в поперечном направлении на глубину 1-1,2 см до кортикальной пластинки внутреннего мыщелка. Костный дефект заполняли исследуемым биоматериалом. Рану послойно ушивали наглухо. Иммобилизацию конечности не выполняли. Подкожную эктопическую имплантацию осуществляли из тех же доступов. Тупым путем формировали подкожный тоннель 4 см в проксимальном направлении. Биоматериал имплантировали в сформированный подкожный тоннель. Подкожную имплантацию осуществляли только для ТИК с КФК. Методы оценки полученных результатов. Полноту заполнения костного дефекта, динамику костеобразования и резорбции керамических гранул оценивали рентгенологически. При выведении животных из эксперимента выполняли аутопсию с фотографированием цифровым фотоаппаратом. При использовании мыщелковой модели кролика выполняли поперечный срез в зоне рассверливания мыщелка. Оценивали органолептические характеристики, васкуляризацию, прочность материала в сравнении с окружающей костью, сращение материала со стенками костного дефекта. Новообразование костной ткани, остеокондуктивные свойства КФК оценивали посредством гистологического исследования образцов биологических материалов. Полученные образцы фиксировали в формалине, декальцинировали, приготавливали срезы толщиной 5 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином (по Романовскому - Гимзе) и по Ван Гизону. Выполняли микрофотограммы с увеличением 50, 100, 200 на световом микроскопе Leica DM LB. Для ПЦР-анализа ДНК на наличие гена eGFP использовали праймеры EGFP-w1: 5’-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’ (прямой) и EGFP-C1: 5’-AGACGTTGTGGCTGTTGTAG-3’ (обратный), позволяющие синтезировать фрагмент длиной 454 пн. В качестве внутреннего контроля для подтверждения наличия и целостности анализируемой ДНК использовали праймеры, комплементарные гену Smc: SmcVD 5’-GAGAGGAGGATCTTGGACCT -3’ (прямой) и SmcUR 5’-CACCGACGGTCCTTGCAGAT-3’ (обратный), позволяющие синтезировать фрагмент длиной 360 пн с копии гена, локализованной на X-хромосоме. Обе пары праймеров использовали в мультиплексном варианте в концентрации 0,5 мкМ каждого. Возможно также использование праймеров Smc в концентрации 0,125 мкМ. Полимеразную цепную реакцию проводили в 32-36 циклов в следующих условиях: денатурация 94°С - 1 мин, отжиг 62°С - 1 мин, синтез 72°С - 2 мин. Полученные фрагменты анализировали при помощи электрофореза в 2% агарозном геле. Для ПЦР-анализа ДНК на наличие гена Cherry использовали праймеры Ch-com-R: 5’-CAC-ATA-GCG-TAA-AAG-GAG-CAA-C -3’ (прямой) и Ch-D : 5’-ACC-CAG-GAC-TCC-TCC-CTG-CA -3’ (обратный), позволяющие синтезировать фрагмент длиной 559 пар нуклеотидов. Полимеразную цепную реакцию проводили в 32 цикла в следующих условиях: денатурация 94°С - 1 мин, отжиг 64°С - 1 мин, синтез 72°С - 2 мин. Полученные фрагменты анализировали по электрофоретической подвижности в 2% агарозном геле. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ В экспериментах in vivo на модели критического дефекта губчатой кости мыщелков бедра кролика была изучена способность ФГ переносить в своем составе в очаг критического костного дефекта культивированные ауто-ММСК. Их жизнеспособность в составе ТИК подтверждена данными ПЦР-анализа, выявившего наличие маркерного гена в регенерирующих тканях в различные сроки после имплантации (табл. 1). По данным аутопсии и визуальной оценки не отмечено полноценного восстановления кости в полости критического дефекта мыщелков бедра кролика ни в одном случае введения ауто-ММСК в очаг критического костного дефекта, который замещался тканью жирового костного мозга независимо от индукции ауто-ММСК к остеогенной дифференцировке (рис. 1). На микроскопическом уровне остеогенез не был выявлен также и в образцах, в которых определяли наличие генетической метки культивированных ауто-ММСК (см. табл. 1). Таким образом, отсутствие остеокондуктивного компонента в полости костного дефекта не позволило осуществить восстановление костной структуры, даже при наличии остеоиндуктивных и остеогенных компонентов. Добавление гранулята КФК в состав ТИК способствовало восстановлению костной ткани в критическом дефекте губчатой кости (рис. 2, 3). При использовании генетического маркера показано, что потомки маркированных ауто-ММСК выявлялись посредством ПЦР в регенерирующих тканях даже через 12 мес после имплантации (см. табл. 1). Процессы неоостеогенеза внутри ТИК происходили только в случае присутствия в регенерирующих тканях меченных ауто-ММСК, независимо от индукции их к остеогенной дифференцировке (см. табл. 1, рис. 3). Маркированные клетки в регенерирующих тканях не выявлялись в трети случаев, когда не было отмечено восстановления костной ткани в дефекте. Как и во всех вариантах бесклеточного контроля, гранулы КФК в составе биоматериала были окружены фиброзной тканью. Процессы остеогенеза определялись только в месте непосредственного контакта гранул КФК со стенками костного дефекта. Процессы неоостеогенеза в ТИК происходили только при ее ортотопической имплантации в свежесформированный костный дефект, когда в зоне дефекта присутствует большое количество остеоиндуктивных факторов, провоспалительных цитокинов и факторов роста. При критических размерах дефекта собственных ресурсов для восстановления костной ткани недостаточно, что было отчетливо видно в контрольных образцах. Использование ТИК повышало остеогенный потенциал в зоне дефекта. Ауто-ММСК в составе ТИК, независимо от предварительной индукции к остеогенной дифференцировке, полноценно участвовали в остеогенезе (табл. 2). В присутствии ауто-ММСК остеогенез отмечали не только внутри костного дефекта, но и в виде костно-хрящевого регенерата в месте рассверливания (остеоперфорации) кортикальной пластинки, через которое ТИК вводили в костный дефект (рис. 4). При эктопической имплантации мы наблюдали прорастание ТИК фиброзной тканью независимо от наличия ауто-ММСК, предварительно индуцированных к остеогенной дифференцировке (см. табл. 1, 2, рис. 5). Этот факт исключает наличие остеоиндуктивных факторов внутри ТИК, опровергая, таким образом, некоторые данные литературы [3, 17, 18]. Как показано в табл. 1, ауто-ММСК, индуцированные к остеодифференцировке (генетическая метка С2), наблюдали на сроках не более 6 нед после операции, не индуцированные к остеодифференцировке клетки выявляли в вариантах эктопической и ортотопической имплантации через 3 и 12 мес. Отсутствие индуцированных к остеодифференцировке ауто-ММСК на поздних сроках после имплантации указывает на то, что подобные клетки, в отличие от более ранних клеток-предшественников, из которых в основном состоит популяция ММСК, со временем исчерпывают свой регенеративный потенциал и не участвуют в процессах восстановления и ремоделирования новообразованной кости в дефекте. Анализ биологических характеристик ТИК с включением КФК показал, что новообразование костных балок происходило непосредственно на поверхности керамических гранул ТКФ в составе ТИК, в зоне их контакта со стенками костного дефекта, а также при непосредственном заполнении костного дефекта гранулятом КФК. Гранулы КФК подвергались практически полной резорбции через 12 мес после имплантации (рис. 5, 6). Заключение. Результаты исследования позволяют сделать вывод о неоднозначной роли ФГ в составе композиционного костезамещающего биоматериала. С одной стороны, он способствует переносу в составе ТИК культивированных ауто-ММСК в очаг костного дефекта, сохраняя их жизнеспособность и регенеративный потенциал. С другой стороны, быстрое прорастание биоматериала соединительной тканью приводит к образованию на поверхности гранул КФК фиброзной капсулы, которая значительно снижает либо полностью блокирует его остеокондуктивный потенциал. Однозначно показана необходимость присутствия резорбируемой КФК в составе костезамещающей ТИК. Кроме того, для обеспечения неоостеогенеза в свежесформированном дефекте губчатой кости достаточно остеокондуктивных свойств гранулята пористой КФК на основе ТКФ. Ауто-ММСК, индуцированные к остеодифференцировке, в составе ТИК проявляли свой остеогенный потенциал на сроках до 12 нед. Дальнейшие репаративные процессы в костном дефекте происходили без их участия. Ауто-ММСК в составе ТИК при эктопической имплантации не проявляют свои остеогенные свойства вне зависимости от индукции к остеодифференцировке. Таким образом, необходимым условием, обеспечивающим остеогенез в имплантированной ТИК, является одновременное присутствие остеоиндуктивных и остеокондуктивных факторов. Без соблюдения этих условий новообразования кости как в критическом костном дефекте, так и при эктопической имплантации не происходит. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 13-04-12025 офи_м Благодарности: сотрудникам патологоанатомического отделения (зав. - доктор биол. наук А.М. Ковригина), сотрудникам отделения рентгенорадиологии (зав. - канд. мед. наук И.Э. Костина) ФГБУ ГНЦ Минздрава России.

About the authors

V. E Mamonov

National Research Center for Hematology, Moscow

Email: vasily-mamonov@yandex.ru

A. G Chemis

National Research Center for Hematology, Moscow

V. S Komlev

Institute of Metallurgy and Material Science named after A.A. Baykov, Moscow

A. L Berkovskiy

National Research Center for Hematology, Moscow

E. M Golubev

National Research Center for Hematology, Moscow

N. V Proskurina

National Research Center for Hematology, Moscow

N. V Sats

National Research Center for Hematology, Moscow

N. I Drize

National Research Center for Hematology, Moscow

References

Supplementary files