Biologic Characteristics of Bone Substituting Tissue Engineering Construction Based on Calcium Phosphate Ceramics, Autologous Mesenchymal Stromal Cells and Fibrin Hydrogel

Abstract


Biological characteristics of bone substituting tissue engineering construction (TEC) that contained porous calcium phosphate ceramic granulate (CPC) of phase structure ((tricalcium phosphate (TCP)), fibrin hydrogel and autologous multipotent mesenchymal stromal cells (auto-MMSC) induced and non-induced to osteogenic differentiation were studied in vivo. The following characteristics of TEC were determined: ability to transfer within its structure the viable auto-MMSC with preservation of their regeneration potential; ability to osteogenesis only under conditions of orthotopic implantation; ability of induced to osteogenic differentiation auto-MMSC to participate in the reparative processes for not more than within 6 weeks after implantation; negative affect of fibrin hydrogel on the osteoinductive properties of CPC within TCP structure. It was shown that to provide osteogenesis in the implanted TEC not only the viable auto-MMSC but simultaneous presence of osteoinductive and osteoconductive factors was required. No bone formation in a critical bone defect and in ectopic implantation takes place without observance of these conditions.

Full Text

Введение. Создание биоматериалов с остеогенными свойствами является актуальной задачей при органотипическом замещении критических костных дефектов [1-3]. Большие надежды в ее решении возлагают на использование мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) в составе тканеинженерной конструкции на основе биоматериалов третьего поколения, которые, согласно классификации L. HenchL и J. Polak (2002), должны обеспечивать перенос и фиксацию в месте костного дефекта жизнеспособных ММСК с сохранением их регенеративного потенциала [4-7]. В большей степени этим характеристикам соответствуют композиционные биоматериалы на основе биогеля и неорганического субстрата [8-10]. Как правило, для этих целей используют пористую кальцийфосфатную керамику (КФК) на основе трикальцийфосфата (ТКФ), которая обладает остеокондуктивными свойствами [7, 11, 12]. Целью работы являлось исследование in vivo костезамещающего биоматериала, состоящего из пористой КФК фазового состава ТКФ, аутологичных ММСК (ауто-ММСК) и фибринового гидрогеля (ФГ). При создании данного биоматериала использовали компоненты отечественного производства: гранулят пористой резорбируемой КФК на основе ТКФ, высокоактивные, очищенные и вирусинактивированные препараты фибриногена и тромбина. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использовали взрослых кроликов породы «Советская шиншилла», самцы и самки массой 2,8-3,5 кг в возрасте 10-12 мес в начале эксперимента, которых доставляли из филиала «Белый мох» Научного центра биомедицинских технологий РАМН. Животных содержали в индивидуальных сетчатых клетках, они получали стандартный комбикорм из травяной муки и сочные корма. Эксперименты были одобрены комиссией по биомедицинской этике при институте медико-биологических проблем РАН, (протокол № 257). Синтез порошка ТКФ. Для получения порошка ТКФ был использован метод осаждения из растворов, основанный на осаждении из 0,5М раствора нитрата кальция Ca(NO3)2×4H2O и 0,5М раствора фосфата аммония (NH4)2HPO4. Реакцию проводили при температуре 25°С. Значение рН = 7 реакционной смеси поддерживали добавлением NH4OH. Взаимодействие реагентов происходит по реакции: 3Ca(NO3)+ 2(NH4)2HPO4 + 2NH4OH → Ca3(PO4)2 + 6NH4NO3 + 2H2О. В реакционный сосуд, снабженный механической мешалкой, помещали 0,5М раствор Ca(NO3)2. Затем медленно, при постоянном перемешивании по каплям добавляли 0,5М раствор (NH4)2HPO4. Осадок отфильтровывали, сушили в сушильном шкафу при температуре 100°С. Последующее прокаливание порошка проводили при температуре 700°С. Получение объемных керамических материалов. Из полученной массы порошка готовили шликер: суспензию порошок/биополимер смешивали с водным раствором полиакриламида (ПАА) в соотношении порошок:вода:ПАА 1:1:1, полученным шликером пропитывали заготовки из ячеистой полимерной матрицы. Обжиг формовок ТКФ проводили в силитовой печи сопротивления, в атмосфере воздуха, со скоростью нагрева по режиму: до 300°С за 30 мин без выдержки, до 600°С за 2,5 ч с последующей выдержкой в течение 30 мин, до 1300°С за 1,5 ч с выдержкой 2 ч (с целью выжигания органической составляющей, с сохранением целостной структуры керамики). Охлаждение образцов до комнатной температуры проводили в выключенной печи. Для дальнейших экспериментов in vivo отбирали фракцию размером 250х50 мкм, которую подвергали стерилизации автоклавированием при температуре 180±50°С в течение 1 ч согласно МУ-287-113. Получение концентратов тромбина и фибриногена. Препарат фибриногена получали из криопреципитата свежезамороженной плазмы доноров. Раствор криопреципитата обрабатывали гелем гидроокиси алюминия, что снижало активность факторов протромбинового комплекса с 0,7 до 0,01 МЕ/мл и предотвращало активацию фибриногена в процессе дальнейшего выделения [13]. Фибриноген осаждали, добавляя полиэтиленгликоль до концентрации 2-3 г/л. Осадок растворяли в цитратном буфере до концентрации 25-30 г/л, поддерживая рН в диапазоне 7,5-8,0. В полученном растворе проводили инактивацию вирусов, добавляя Твин-80 и три-н-бутил фосфат до концентраций 1% и 0,03% соответственно. Процесс инактивации вирусов осуществляли при температуре 25°С в течение 6 ч. Вирусинактивирующие реагенты удаляли трехкратной экстракцией раствора фибриногена вазелиновым маслом. Затем фибриноген двукратно переосаждали, добавляя в раствор глицин до концентрации 1,5 М/л. Фибриноген выпадал в осадок, а большинство балластных белков удаляли. После переосаждения фибриноген растворяли в цитратном буфере до концентрации 25 г/л, фильтровали через стерилизующий фильтр, разливали во флаконы по 2 мл и лиофилизировали. Для получения раствора фибриногена к лиофилизированному концентрату фибриногена добавляли 2 мл дистиллированной воды для инъекций и помешивали на водяной бане при 37°С в течение 5 мин до полного растворения препарата. Криосупернатант нативной плазмы (КСН) доноров использовали в качестве сырья для получения тромбина. Из КСН выделяли протромбиновый комплекс сорбцией на DEAE-Sepharose FF методом колоночной хроматографии или на DEAE-Sephadex A-50 методом хроматографии в объеме [14]. В результате получали раствор, содержащий 8-12 МЕ/мл протромбина. Для активации протромбина раствор диализовали для доведения концентрации хлорида натрия в нем до физиологического уровня 0,15 М, затем добавляли хлорид кальция и оставляли на 18 ч при перемешивании при температуре 10-15°С [15]. В процессе инкубации под действием ионов кальция и компонентов протромбинового комплекса происходила трансформация протромбина в активный тромбин, причем из 1 МЕ протромбина удалось получить 70-80 МЕ тромбина. В растворе тромбина проводили инактивацию вирусов в условиях, описанных выше. Очистку тромбина от продуктов вирусной инактивации и балластных белков проводили хроматографией на СM-Sepharose FF [16]. В результате был получен высокоочищенный тромбин с активностью 2-3 тыс. МЕ/мл. Полученный раствор разводили буфером для лиофилизации до активности тромбина около 500 МЕ/мл, добавляли для стабилизации человеческий альбумин до концентрации 10 г/л, стерильно фильтровали, разливали во флаконы по 1 мл и лиофилизировали. Для получения раствора тромбина к лиофилизированному концентрату тромбина добавляли 5 мл физиологического раствора. Получение, культивирование, индукция к остеогенной дифференцировке и маркирование ММСК кролика. Для получения ауто-ММСК под футлярной новокаиновой блокадой 20 мл 0,5% раствора новокаина (ОАО «Органика») аспирировали костный мозг из дистальных мыщелков бедренных костей кролика. Получали 1,5-2 мл костного мозга в пробирки с 500 Ед/мл гепарина («Sigma»). Для выделения ядросодержащих клеток костный мозг помещали в питательную среду αМЕМ («ICN») с 0,1 % метилцеллулозы (1500 сП, «Sigma») и оставляли на 40 мин при комнатной температуре. За это время большая часть эритроцитов и гранулоцитов оседала, а ядросодержащие клетки оставались во взвеси. Надосадочную жидкость собирали и осаждали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 мин. Количество ядерных клеток определяли при подсчете с генциан-виолетом (1% раствор на 3% уксусной кислоте). Среднее количество ядросодержащих клеток составило 22∙106. Затем клетки взвешивали в полной питательной среде αMEM с 10% фетальной бычьей сыворотки («Hyclone»), 2 мМ L-глутамина («ICN»), 100 ед/мл пенициллина («Ферейн»), 50 мкг/мл стрептомицина («Ферейн») из расчета 3∙106 клеток на флакон с площадью дна 25 см2. После формирования конфлуентного монослоя клетки снимали 0,25% раствором трипсина, приготовленного на 0,02% EDTA («ICN») в физиологическом растворе («Sigma»), и рассаживали из расчета 4∙103 клеток на 1 см2 поверхности дна флакона. Остеогенную дифференцировку индуцировали добавлением 0,1 мкM дексаметазона, 0,15 мM 2-фосфата аскорбиновой кислоты тринатриевой соли («Sigma») и 3 мM NaH2PO4 («Sigma») в среду для культивирования ММСК. Клетки культивировали в течение 2-5 дней. Для маркирования ММСК использовали лентивекторы третьего поколения LeGo, содержащие ген зеленого белка eGFP и красного белка Cherry (C2), с делетированным промотором. Вирусные стоки получали с помощью кальциевофосфатной трансфекции плазмид phCMVC-VSV-G (R861), pGpur(R1246), pMDLg/pRRE и pRSVRevв клетки PhoenixGP, любезно предоставленных проф. Б. Фейзе (B. Fehse; Universitity Hospital Eppendorf, Гамбург). Вирусные частицы концентрировали в 100 раз путем центрифугирования в течение 3,5 ч при 18000 об/мин. Определение титра вируса проводили на клетках линий 293T и PhoenixGP. Для заражения ММСК лентивирусным вектором из флаконов полностью отбирали среду для культивирования и наносили на подслои вирусные частицы из расчета примерно 3∙107 на флакон с площадью дна 175 см2 в 7 мл среды альфа-MEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 8 мкг/мл полибрена («Sigma»). Через 6 ч среду заменяли на 25 мл полной питательной среды. Заражению подвергали примерно 60% культивированных ММСК. Перед имплантацией ММСК снимали трипсином. Маркерные гены С2 или GFP использовали поочередно в популяции ММСК как индуцированных к остеогенной дифференцировке, так и не индуцированных для исключения влияния генетического маркера на регенеративную функцию культивированных ММСК. Получение ТИК на основе ФГ и ММСК. Первый компонент двухкомпонентной системы получали при добавлении ауто-ММСК в количестве от 1 до 19,8∙106 (в среднем 6,3∙106), взвешенные в 0,5 мл питательной среды к 1 мл раствора фибриногена. Второй компонент представлял собой раствор тромбина с активностью 50 Ед в объеме 0,5 мл. Оба компонента системы можно было ввести через официнальные медицинские иглы диаметром от 0,6 мм и более. При смешивании двух компонентов происходила полимеризация фибриногена, что способствовало фиксации ММСК в составе плотно-эластичного сгустка в полости костного дефекта. Получение ТИК на основе гранулята пористой КФК и ФГ. В состав композиционного материала входили пористые гранулы КФК размером 250 мкм, общей пористостью 70%, (размер пор от 10 до 50 мкм). Первый компонент системы получали следующим образом: в 1 мл раствора фибриногена помещали от 3,4 до 9,9∙106 ММСК в виде взвеси в 0,5 мл питательной среды. Далее к полученному объему добавляли 1 мл гранулята пористой КФК. Добавление керамических гранул в состав данного компонента ТИК делало невозможным инъекционное введение через стандартный медицинский шприц типа Luer. После добавления к первому компоненту 50 Ед тромбина в 0,5 мл физиологического раствора получали плотно-эластичную субстанцию, которая могла быть малоинвазивно введена в костный дефект мыщелка через тубус пластикового медицинского шприца. Пластичность материала позволяла полноценно заполнять полость костного дефекта сложной геометрической формы. Эктопическая подкожная и ортотопическая имплантация в критический дефект спонгиозной кости (мыщелковая модель). Для профилактики инфекционных осложнений всем животным за 3 ч до операции вводили энрофлоксацин в дозе 10 мг/кг подкожно, затем в течение последующих 5 дней в той же дозе подкожно 1 раз в сутки. В качестве модели критического дефекта губчатой кости использовали модель дефекта мыщелков бедренной кости. Всего выполнено 50 операций на 25 животных (использовали обе конечности). Операции проводили в асептических условиях под футлярной анестезией бедра, для чего использовали 20 мл 0,5 % раствора новокаина (ОАО «Органика», Россия). Из проекционного разреза длиной 2 см выделяли наружный мыщелок бедра. Сверлом диаметром 5 мм производили рассверливание наружного мыщелка бедренной кости в поперечном направлении на глубину 1-1,2 см до кортикальной пластинки внутреннего мыщелка. Костный дефект заполняли исследуемым биоматериалом. Рану послойно ушивали наглухо. Иммобилизацию конечности не выполняли. Подкожную эктопическую имплантацию осуществляли из тех же доступов. Тупым путем формировали подкожный тоннель 4 см в проксимальном направлении. Биоматериал имплантировали в сформированный подкожный тоннель. Подкожную имплантацию осуществляли только для ТИК с КФК. Методы оценки полученных результатов. Полноту заполнения костного дефекта, динамику костеобразования и резорбции керамических гранул оценивали рентгенологически. При выведении животных из эксперимента выполняли аутопсию с фотографированием цифровым фотоаппаратом. При использовании мыщелковой модели кролика выполняли поперечный срез в зоне рассверливания мыщелка. Оценивали органолептические характеристики, васкуляризацию, прочность материала в сравнении с окружающей костью, сращение материала со стенками костного дефекта. Новообразование костной ткани, остеокондуктивные свойства КФК оценивали посредством гистологического исследования образцов биологических материалов. Полученные образцы фиксировали в формалине, декальцинировали, приготавливали срезы толщиной 5 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином (по Романовскому - Гимзе) и по Ван Гизону. Выполняли микрофотограммы с увеличением 50, 100, 200 на световом микроскопе Leica DM LB. Для ПЦР-анализа ДНК на наличие гена eGFP использовали праймеры EGFP-w1: 5’-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’ (прямой) и EGFP-C1: 5’-AGACGTTGTGGCTGTTGTAG-3’ (обратный), позволяющие синтезировать фрагмент длиной 454 пн. В качестве внутреннего контроля для подтверждения наличия и целостности анализируемой ДНК использовали праймеры, комплементарные гену Smc: SmcVD 5’-GAGAGGAGGATCTTGGACCT -3’ (прямой) и SmcUR 5’-CACCGACGGTCCTTGCAGAT-3’ (обратный), позволяющие синтезировать фрагмент длиной 360 пн с копии гена, локализованной на X-хромосоме. Обе пары праймеров использовали в мультиплексном варианте в концентрации 0,5 мкМ каждого. Возможно также использование праймеров Smc в концентрации 0,125 мкМ. Полимеразную цепную реакцию проводили в 32-36 циклов в следующих условиях: денатурация 94°С - 1 мин, отжиг 62°С - 1 мин, синтез 72°С - 2 мин. Полученные фрагменты анализировали при помощи электрофореза в 2% агарозном геле. Для ПЦР-анализа ДНК на наличие гена Cherry использовали праймеры Ch-com-R: 5’-CAC-ATA-GCG-TAA-AAG-GAG-CAA-C -3’ (прямой) и Ch-D : 5’-ACC-CAG-GAC-TCC-TCC-CTG-CA -3’ (обратный), позволяющие синтезировать фрагмент длиной 559 пар нуклеотидов. Полимеразную цепную реакцию проводили в 32 цикла в следующих условиях: денатурация 94°С - 1 мин, отжиг 64°С - 1 мин, синтез 72°С - 2 мин. Полученные фрагменты анализировали по электрофоретической подвижности в 2% агарозном геле. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ В экспериментах in vivo на модели критического дефекта губчатой кости мыщелков бедра кролика была изучена способность ФГ переносить в своем составе в очаг критического костного дефекта культивированные ауто-ММСК. Их жизнеспособность в составе ТИК подтверждена данными ПЦР-анализа, выявившего наличие маркерного гена в регенерирующих тканях в различные сроки после имплантации (табл. 1). По данным аутопсии и визуальной оценки не отмечено полноценного восстановления кости в полости критического дефекта мыщелков бедра кролика ни в одном случае введения ауто-ММСК в очаг критического костного дефекта, который замещался тканью жирового костного мозга независимо от индукции ауто-ММСК к остеогенной дифференцировке (рис. 1). На микроскопическом уровне остеогенез не был выявлен также и в образцах, в которых определяли наличие генетической метки культивированных ауто-ММСК (см. табл. 1). Таким образом, отсутствие остеокондуктивного компонента в полости костного дефекта не позволило осуществить восстановление костной структуры, даже при наличии остеоиндуктивных и остеогенных компонентов. Добавление гранулята КФК в состав ТИК способствовало восстановлению костной ткани в критическом дефекте губчатой кости (рис. 2, 3). При использовании генетического маркера показано, что потомки маркированных ауто-ММСК выявлялись посредством ПЦР в регенерирующих тканях даже через 12 мес после имплантации (см. табл. 1). Процессы неоостеогенеза внутри ТИК происходили только в случае присутствия в регенерирующих тканях меченных ауто-ММСК, независимо от индукции их к остеогенной дифференцировке (см. табл. 1, рис. 3). Маркированные клетки в регенерирующих тканях не выявлялись в трети случаев, когда не было отмечено восстановления костной ткани в дефекте. Как и во всех вариантах бесклеточного контроля, гранулы КФК в составе биоматериала были окружены фиброзной тканью. Процессы остеогенеза определялись только в месте непосредственного контакта гранул КФК со стенками костного дефекта. Процессы неоостеогенеза в ТИК происходили только при ее ортотопической имплантации в свежесформированный костный дефект, когда в зоне дефекта присутствует большое количество остеоиндуктивных факторов, провоспалительных цитокинов и факторов роста. При критических размерах дефекта собственных ресурсов для восстановления костной ткани недостаточно, что было отчетливо видно в контрольных образцах. Использование ТИК повышало остеогенный потенциал в зоне дефекта. Ауто-ММСК в составе ТИК, независимо от предварительной индукции к остеогенной дифференцировке, полноценно участвовали в остеогенезе (табл. 2). В присутствии ауто-ММСК остеогенез отмечали не только внутри костного дефекта, но и в виде костно-хрящевого регенерата в месте рассверливания (остеоперфорации) кортикальной пластинки, через которое ТИК вводили в костный дефект (рис. 4). При эктопической имплантации мы наблюдали прорастание ТИК фиброзной тканью независимо от наличия ауто-ММСК, предварительно индуцированных к остеогенной дифференцировке (см. табл. 1, 2, рис. 5). Этот факт исключает наличие остеоиндуктивных факторов внутри ТИК, опровергая, таким образом, некоторые данные литературы [3, 17, 18]. Как показано в табл. 1, ауто-ММСК, индуцированные к остеодифференцировке (генетическая метка С2), наблюдали на сроках не более 6 нед после операции, не индуцированные к остеодифференцировке клетки выявляли в вариантах эктопической и ортотопической имплантации через 3 и 12 мес. Отсутствие индуцированных к остеодифференцировке ауто-ММСК на поздних сроках после имплантации указывает на то, что подобные клетки, в отличие от более ранних клеток-предшественников, из которых в основном состоит популяция ММСК, со временем исчерпывают свой регенеративный потенциал и не участвуют в процессах восстановления и ремоделирования новообразованной кости в дефекте. Анализ биологических характеристик ТИК с включением КФК показал, что новообразование костных балок происходило непосредственно на поверхности керамических гранул ТКФ в составе ТИК, в зоне их контакта со стенками костного дефекта, а также при непосредственном заполнении костного дефекта гранулятом КФК. Гранулы КФК подвергались практически полной резорбции через 12 мес после имплантации (рис. 5, 6). Заключение. Результаты исследования позволяют сделать вывод о неоднозначной роли ФГ в составе композиционного костезамещающего биоматериала. С одной стороны, он способствует переносу в составе ТИК культивированных ауто-ММСК в очаг костного дефекта, сохраняя их жизнеспособность и регенеративный потенциал. С другой стороны, быстрое прорастание биоматериала соединительной тканью приводит к образованию на поверхности гранул КФК фиброзной капсулы, которая значительно снижает либо полностью блокирует его остеокондуктивный потенциал. Однозначно показана необходимость присутствия резорбируемой КФК в составе костезамещающей ТИК. Кроме того, для обеспечения неоостеогенеза в свежесформированном дефекте губчатой кости достаточно остеокондуктивных свойств гранулята пористой КФК на основе ТКФ. Ауто-ММСК, индуцированные к остеодифференцировке, в составе ТИК проявляли свой остеогенный потенциал на сроках до 12 нед. Дальнейшие репаративные процессы в костном дефекте происходили без их участия. Ауто-ММСК в составе ТИК при эктопической имплантации не проявляют свои остеогенные свойства вне зависимости от индукции к остеодифференцировке. Таким образом, необходимым условием, обеспечивающим остеогенез в имплантированной ТИК, является одновременное присутствие остеоиндуктивных и остеокондуктивных факторов. Без соблюдения этих условий новообразования кости как в критическом костном дефекте, так и при эктопической имплантации не происходит. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 13-04-12025 офи_м Благодарности: сотрудникам патологоанатомического отделения (зав. - доктор биол. наук А.М. Ковригина), сотрудникам отделения рентгенорадиологии (зав. - канд. мед. наук И.Э. Костина) ФГБУ ГНЦ Минздрава России.

About the authors

V. E Mamonov

National Research Center for Hematology, Moscow

Email: vasily-mamonov@yandex.ru

A. G Chemis

National Research Center for Hematology, Moscow


V. S Komlev

Institute of Metallurgy and Material Science named after A.A. Baykov, Moscow


A. L Berkovskiy

National Research Center for Hematology, Moscow


E. M Golubev

National Research Center for Hematology, Moscow


N. V Proskurina

National Research Center for Hematology, Moscow


N. V Sats

National Research Center for Hematology, Moscow


N. I Drize

National Research Center for Hematology, Moscow


References

  1. Goshima K., Nakase J., Xu Q., Matsumoto K., Tsuchiya H. Repair of segmental bone defects in rabbit tibia promoted by a complex of b-tricalcium phosphate and hepatocyte growth factor. J. Orthop. Sci. 2012; 17: 639-48.
  2. Mastrogiacomo M., Muraglia A., Komlev V., Peyrin F., Rustichelli F., Crovace A., Cancedda R. Tissue engineering of bone: search for a better scaffold. Orthod. Craniofacial. Res. 2005; 8: 277-84.
  3. Scott M.A., Levi B., Askarinam A., Nguyen A., Rackohn T., Ting K. et al. Brief review of models of ectopic bone formation. Stem Cells Dev. 2012; 21 (5): 655-67.
  4. Hench L.L., Polak J.M. Third-generation biomedical materials. Science. 2002; 295 (5557): 1014-7.
  5. Jiang B., Akar B., Waller T.M., Larson J.C., Appel A.A., Brey E.M. Design of a composite biomaterial system for tissue engineering applications. Acta Biomater. 2014; 10 (3): 1177-86.
  6. Shao X., Goh J.C., Hutmacher D.W., Lee E.H., Zigang G. Repair of large articular osteochondral defects using hybrid scaffolds and bone marrow-derived mesenchymal stem cells in a rabbit model. Tissue Engineering. 2006; 12 (6): 1539-51.
  7. Wu H., Kang N., Wang Q., Dong P., Lv X., Cao Y., Xiao R. The dose-effect relationship between the seeding quantity of human marrow mesenchymal stem cells and in vivo tissue engineered bone yield. Cell Transplant. 2015; 24 (10): 1957-68. doi: 10.3727/096368914X685393.
  8. Breidenbach A.P., Dyment N.A., Lu Y., Rao M., Shearn J. T., Rowe D.W. et al. Fibrin gels exhibit improved biological, structural, and mechanical properties compared with collagen gels in cell-based tendon tissue-engineered constructs. Tissue Eng. Part A. 2015; 21 (3-4): 438-450.
  9. Carmagnola D., Berglundh T., Lindhe J. The effect of a fibrin glue on the integration of Bio-OssA with bone tissue. An experimental study in labrador dogs. J. Clin. Periodontol. 2002; 29: 377-83.
  10. Weinand C., Pomerantseva I., Neville C.M., Gupta R., Weinberg E., Madisch I. et al. Hydrogel-beta-TCP scaffolds and stem cells for tissue engineering bone. Bone. 2006; 38 (4): 555-63.
  11. Dorozhkin S.V. Bioceramics of calcium orthophosphates. Biomaterials. 2010; 31 (7): 1465-85.
  12. Horowitz R.A., Mazor Z., Foitzik C. Beta-tricalcium phosphate as bone substitute material: properties and clinical applications. Titanium. 2009; 1 (2): 1-11.
  13. Meidler R., Raver-Shapira N., Bar L., Belyaev O., Nur I. Method for removing a lytic enzyme from a heterogeneous mixture. WO 2013001524 A1; 2011.
  14. Aizawa P., Winge S., Karlsson G. Large-scale preparation of thrombin from human plasma. Thromb. Res. 2008; 122 (4): 560-7.
  15. Jorquera N.J.I., Ristol D.P., Fernandez R.J., Brava C.I., Lopez G.R. Stable thrombin composition. EP 1649867 A1; 2004.
  16. Hanada S., Honda Y., Morisada Y., Miyake S., Matsumoto I. Process for producing thrombin. US 5945103 A; 1994.
  17. Barradas A.M.C., Yuan H., van Blitterswijk C.A., Habibovic P. Osteoinductive biomaterials: current knowledge of properties, experimental models and biological mechanisms. Eur. Cells Mater. 2011; 21: 407-49.
  18. Song G., Habibovic P., Bao C., Hua J., van Blitterswijk C.A., Yuan H. et al. The homing of bone marrow MSCs to non-osseous sites for ectopic bone formation induced by osteoinductive calcium phosphate. Biomaterials. 2013; 34 (2013): 2167-76.

Statistics

Views

Abstract - 22

Cited-By


Article Metrics

Metrics Loading ...

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2015 Mamonov V.E., Chemis A.G., Komlev V.S., Berkovskiy A.L., Golubev E.M., Proskurina N.V., Sats N.V., Drize N.I.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies