Клональный анализ стромальных клеток костного мозга при множественной экзостозной хондродисп лазии и системном остеопорозе: особенности эффективности клонирования клеток

Обложка


Цитировать

Полный текст

Аннотация

Изучали клональные особенности стромальных клеток костного мозга, полученных при биопсии крыла подвздошной кости больных с системными заболеваниями скелета: множественной экзостозной хондродисплазией (16 больных) и системным остеопорозом (24 больных). Исследовали пролиферативный потенциал клеток, основным показателем которого является эффективность клонирования. Анализировали индукционно-морфогенетические взаимоотношения между эффективностью клонирования и биологическими индукторами, содержащимися в аутологичной и добавляемой взвеси костномозговых клеток (так называемом фидере). Быстрый рост и пролиферация экзостозов при множественной экзостозной хондродисплазии, по-видимому, обусловлены как повышенной пролиферативной активностью самих культивируемых клеток, так и (особенно) усилением ростстимулирующего влияния аутологичного "фидера", что отличает быстрорастущие экзостозы от так называемых спокойных, при которых собственно пролиферативная активность клеток увеличена (но в меньшей степени), причем усиления влияния аутофидера не обнаруживается. При системном остеопорозе установлено резкое снижение эффективности клонирования собственно клеток-мишеней, что, вероятно, связано с ослаблением их колониеобразующих свойств и/или уменьшением их количества в эксплантируемой взвеси.

Полный текст

Известно, что многие патологические процессы связаны с генетически детерминированными нарушениями элементарных клеточных функций, таких как пролиферация, дифференцировка, локомоция, клеточные контакты и т.д. В настоящее время в связи с теоретическими и практическими достижениями в области культивирования клеток in vitro в культивированных клетках можно продемонстрировать не только морфологические аномалии, характеризующие данную болезнь, но и физиологические нарушения (например, эффективность клонообразования). При болезнях соединительной ткани (в том числе костно-суставного аппарата) исследуют фибробласты — главные клеточные компоненты соединительной ткани. Основными клеточными элементами специализированных типов соединительной ткани (костной и хрящевой) служат остеогенные и хрящевые клетки, общие предшественники которых находятся среди стромальных фибробластоподобных клеток костного мозга, что доказано в опытах их обратной пересадки в организм, а также при культивировании по методу органных культур на мембранных фильтрах [5]. Эти особенности костномозговых фибробластов позволяют использовать информацию об их колониеобразующих свойствах в изучении патогенеза заболеваний костной и хрящевой ткани [7].
Под этим углом зрения в настоящем исследовании рассматриваются две нозологические формы системных заболеваний скелета: множественная экзостозная хондродисплазия (МЭХД) — гиперпролиферативный процесс с костно-хрящевыми разрастаниями и системный остеопороз (СОП), при котором уменьшается масса кости (остеопения); с этой точки зрения СОП можно считать оппозитным состоянием по отношению к МЭХД.
Изучалось одно из фундаментальных генотипических свойств клеток и клеточных сообществ — пролиферативный потенциал.
Представление о пролиферативном потенциале как о генетическом признаке организма достаточно хорошо обосновано. Суть его заключается в том, что диплоидные клетки человека и животных, культивируемые in vitro, имеют ограниченную, определенную способность размножаться митозом [9, 10]. Одним из основных показателей пролиферативной активности клеток является эффективность их клонирования, которую можно использовать для характеристики гипо и гиперпролиферативных процессов [3].
В основе такого анализа лежит способность колониеобразующих фибробластоподобных клеток костного мозга (КОКф) в результате пролиферации в монослойных культурах давать дискретные колонии, каждая из которых состоит из потомков одной КОКф, т.е. является клеточным клоном |1, 4, 6]. Отношение числа колоний к числу эксплан тированных клеток отражает эффективность коло ниеобразования, или клонирования — ЭКОф.
Вместе с тем костномозговые фибробласты являются единственным типом фибробластов, которым для пролиферации в культуре не хватает ростстимулирующих факторов, поэтому требуется их добавление извне [6]. Один из таких ростстимулирующих факторов для КОКф содержится в тромбоцитах и мегакариоцитах костного мозга [8, 11]. Добавление его при культивировании КОКф вызывает так называемое подкармливающее, "фидерное" действие на культуру. Оптимальным источником дополнительного фидера для КОКф человека являются нестромальные ксеногенные костномозговые клетки кролика.
Для исследования эффективности клонирования колонисобразующих клеток костного мозга принципиально взаимодействие их с ростстимулирую щими факторами.
Материал и методы исследования. Костный мозг был получен из крыла подвздошной кости 16 больных МЭХД, 28 больных СОП и 4 больных в отдаленном периоде после травмы (контрольная группа) во время операции или при диагностической биопсии.
Клонирование стромальных фибробластов костного мозга (КОКф) проводилось по методу, описанному А.Я. Фриденштейном |6 ].
Для оценки индукционно-морфогенетических взаимоотношений пролиферативной активности КОКф и биологических индукторов, содержащихся в фидерных клетках, изучали зависимость клеточных колоний от фидера по разработанной нами методике [2], которая даст возможность рассмотреть влияние ауто и ксснофидсра, а также состояние самих клеток-мишеней (при смене среды, т.е. "сбросе" фидера), когда устраняется влияние внешних для КОКф ростстимулирующих факторов.
Таким образом, клонирование проводили в.З экспериментальных вариантах (см. таблицу): 1-й вариант — смена среды, т.е. удаление ("сброс") аутофидера без добавления ксенофидера; 2-й вариант — смена среды не производилась, т.е. сохранялся аутофидер, ксенофидер нс добавляли; 3-й вариант — смена среды ("сброс"), добавление ксенофидера.
Сравнительная характеристика эффективности клонирования стромальных клеток костного мозга при МЭХД и СОП
Диагноз Число наблюдений 1й вариант — смена среды 2-й вариант — без смены среды 3-й вариант — смена среды; добавление ксенофидера
М±т Р М±ш Р М±т Р
МЭХД: "спокойные" экзостозы 4 63,2±11,1 0,05 60,02±5,9 > 0,05 73,2±5,7 > 0,05
быстрорастущие ЭКЗОСТОЗЫ 12 71,0±11,9 < 0,02 111,8±7,8 < 0,001 113,0±11,8 < 0,001
СОП 24 25,5±3,5 < 0,05 34,04±4,95 < 0,02 56,6±3,6 >0,05
Контроль травм) (отдаленные последствия 4 36,0±3,2 53,4±4,9 64,0±4,6
Примечание, р по отношению к контролю.
Результаты исследования. Распределение ЭКОф в норме (контроле) можно охарактеризовать следующими закономерностями (см. таблицу): "сброс" уменьшает ЭКОф. Если это так, то аутофидер стимулирует пролиферативную активность КОКф; добавление ксенофидера увеличивает ЭКОф, и это увеличение более выражено, чем увеличение за счет аутофидера.
У больных со "спокойными" экзостозами пролиферативный потенциал собственно клеток-мишеней (1-й вариант) был повышен по сравнению с контролем (на границе достоверности, р = 0,05). Учитывая относительно невысокую способность КОКф пролиферировать и давать колонии без фидера в норме, можно полагать, что это указывает на аномально усиленную способность к пролиферации собственно КОКф больных МЭХД. В то же время присутствие как ауто (2-й вариант), так и ксенофидера (3-й вариант) существенно не влияло на ЭКОф, и ЭКОф во 2-м и 3-м вариантах практически не отличалась от контроля.
Другую картину мы наблюдали у больных с быстрорастущими экзостозами. Во всех 3 вариантах опытов ЭКОф была высокодостоверно больше, чем в контроле (см. таблицу). При этом обнаруживалось необычно сильное влияние аутофидера на ЭКОф (2-й вариант) по сравнению с ксенофидером (3-й вариант). ЭКОф собственно культивируемых клеток (1-й вариант) была повышена еще более значительно, чем при "спокойных" экзостозах.
При изучении эффективности клонирования стромальных фибробластов от больных СОП (см. таблицу) обращала на себя внимание низкая ЭКОф собственно культивируемых клеток, нс подвергающихся влиянию ни ауто-, ни ксеногенных ростстимулирующих факторов (1-й вариант опыта), т.е. можно полагать, что выявленный эффект связан преимущественно с колонисобра зующими свойствами самих клеток, а нс с фидерным воздействием. В то же время сохранялся нормальный ответ клеток на воздействие ростстимулирующих факторов, содержащихся как в ауто-, так и в ксснофидсрах (2-й и 3-й варианты опытов).
Таким образом, состояния можно считать оппозитными как с точки зрения основных клинических проявлений заболевания (костно-хрящевые разрастания при МЭХД и остеопения при СОП), так и под углом зрения клональных особенностей клеток, имеющих непосредственное отношение к гистогенезу костной и хрящевой ткани. Механизмы этих изменений могут быть различными, чему представлены первые доказательства.
Складывается впечатление, что при СОП выявленное резкое уменьшение эффективности клонирования связано преимущественно с уменьшением числа колониеобразующих клеток в единице объема костного мозга и/или ослаблением их пролиферативной активности.
Быстрый рост и пролиферация экзостозов при МЭХД, по-видимому, обусловлены как повышением пролиферативной активности самих культивируемых клеток, так и (особенно) усилением ростстимулирующего влияния аутофидера.
Приведенные данные показывают необходимость дальнейшего изучения причин наблюдаемых феноменов.
Так, можно предполагать, что аутофидерное влияние может быть обусловлено не только специфичным для КОКф ростовым фактором, содержащимся в тромбоцитах и мегакариоцитах костномозговой взвеси [8, И], но и другими ростстимулирующими факторами, содержащимися в клетках этой взвеси. Причины повышения или понижения активности самих культивируемых клеток, вероятно, следует искать в наследственных дефектах клеток, рецепторов, в дефектах продукции факторов (в том числе ростстимулирующих), способствующих пролиферации и вырабатываемых самими клетками-мишенями.
При рассмотрении многих болезней костно-суставной системы, в том числе МЭХД и СОП, как следствия генетически детерминированных нарушений морфогенеза любой из выявленных показателей может оказаться тестом на костно хрящевую патологию.

×

Об авторах

E. M. Меерсон

Центральный институт травматологии и ортопедии им. Н. Н. Приорова

Автор, ответственный за переписку.
Email: info@eco-vector.com
Россия, Москва, Россия

B. K. Ильина

Центральный институт травматологии и ортопедии им. Н. Н. Приорова

Email: info@eco-vector.com
Россия, Москва, Россия

B. H. Бурдыгин

Центральный институт травматологии и ортопедии им. Н. Н. Приорова

Email: info@eco-vector.com
Россия, Москва, Россия

C. C. Родионова

Центральный институт травматологии и ортопедии им. Н. Н. Приорова

Email: info@eco-vector.com
Россия, Москва, Россия

Л. В. Балберкин

Центральный институт травматологии и ортопедии им. Н. Н. Приорова

Email: info@eco-vector.com
Россия, Москва, Россия

С. И. Митин

Центральный институт травматологии и ортопедии им. Н. Н. Приорова

Email: info@eco-vector.com
Москва, Россия

Список литературы

  1. Лурия Е.А., Оуэн М., Фриденштейн А.Я. и др. //Бюл. экспер. биол.— 1986.— № 4.— С. 481--483.
  2. Меерсон Е.М., Ильина В.К., Барер Ф.С. и др. //Ортопед, травматол.— 1990.— № 9.— С. 43 — 48.
  3. Терехов С.М. Клональный анализ при изучении наследственной
  4. патологии: Автореф. дис. ... канд. мед. наук.— М., 1984.
  5. Фриденштейн А.Я., Лалыкина КС. Индукция костной ткани и остеогенные клетки-предшественники.— М., 1973.
  6. Фриденштейн А.Я., Лурия Е.А. Клеточные основы кроветворного микроокружения.— М., 1980.
  7. Фриденштейн Ф.Я. //Методы клонирования клеток.—Л.,1988.—С. 257 — 265.
  8. Шапошников К).Г., Меерсон Е.М., Гринберг К.II. и др. //Генетические и иммунологические методы исследования больных с заболеваниями опорно-двигательного аппарата. М., 1988.— С. 3 — 10.
  9. Castro-Malaspina II. et al. //Blood.— 1980,—Vol. 56, № 2,— P. 289 — 301.
  10. Cristofalo V.J. //Senescence, Dominant or Recessive in Somatic All Crosses/Eds Nichols, Murphy.— New York; London, 1977.—P. 13 — 21.
  11. Hayflick L. //Handbook of the Biology of Aging./Eds C. Finch, L. Hayflick.—New York, 1977.—P. 159 —179.
  12. Hirota J., Okamura S., Kimura N et al. //Europ. J. Haemal.— 1988.—Vol. 40,—№ 1.—P. 83 — 90.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML

© ООО "Эко-Вектор", 2022



СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77-76249 от 19.07.2019.