Clonal analysis of bone marrow stromal cells in multiple exostotic chondrodysplasia and systemic osteoporosis: features of cell cloning efficiency

Full Text

Известно, что многие патологические процессы связаны с генетически детерминированными нарушениями элементарных клеточных функций, таких как пролиферация, дифференцировка, локомоция, клеточные контакты и т.д. В настоящее время в связи с теоретическими и практическими достижениями в области культивирования клеток in vitro в культивированных клетках можно продемонстрировать не только морфологические аномалии, характеризующие данную болезнь, но и физиологические нарушения (например, эффективность клонообразования). При болезнях соединительной ткани (в том числе костно-суставного аппарата) исследуют фибробласты — главные клеточные компоненты соединительной ткани. Основными клеточными элементами специализированных типов соединительной ткани (костной и хрящевой) служат остеогенные и хрящевые клетки, общие предшественники которых находятся среди стромальных фибробластоподобных клеток костного мозга, что доказано в опытах их обратной пересадки в организм, а также при культивировании по методу органных культур на мембранных фильтрах [5]. Эти особенности костномозговых фибробластов позволяют использовать информацию об их колониеобразующих свойствах в изучении патогенеза заболеваний костной и хрящевой ткани [7].
Под этим углом зрения в настоящем исследовании рассматриваются две нозологические формы системных заболеваний скелета: множественная экзостозная хондродисплазия (МЭХД) — гиперпролиферативный процесс с костно-хрящевыми разрастаниями и системный остеопороз (СОП), при котором уменьшается масса кости (остеопения); с этой точки зрения СОП можно считать оппозитным состоянием по отношению к МЭХД.
Изучалось одно из фундаментальных генотипических свойств клеток и клеточных сообществ — пролиферативный потенциал.
Представление о пролиферативном потенциале как о генетическом признаке организма достаточно хорошо обосновано. Суть его заключается в том, что диплоидные клетки человека и животных, культивируемые in vitro, имеют ограниченную, определенную способность размножаться митозом [9, 10]. Одним из основных показателей пролиферативной активности клеток является эффективность их клонирования, которую можно использовать для характеристики гипо и гиперпролиферативных процессов [3].
В основе такого анализа лежит способность колониеобразующих фибробластоподобных клеток костного мозга (КОКф) в результате пролиферации в монослойных культурах давать дискретные колонии, каждая из которых состоит из потомков одной КОКф, т.е. является клеточным клоном |1, 4, 6]. Отношение числа колоний к числу эксплан тированных клеток отражает эффективность коло ниеобразования, или клонирования — ЭКОф.
Вместе с тем костномозговые фибробласты являются единственным типом фибробластов, которым для пролиферации в культуре не хватает ростстимулирующих факторов, поэтому требуется их добавление извне [6]. Один из таких ростстимулирующих факторов для КОКф содержится в тромбоцитах и мегакариоцитах костного мозга [8, 11]. Добавление его при культивировании КОКф вызывает так называемое подкармливающее, "фидерное" действие на культуру. Оптимальным источником дополнительного фидера для КОКф человека являются нестромальные ксеногенные костномозговые клетки кролика.
Для исследования эффективности клонирования колонисобразующих клеток костного мозга принципиально взаимодействие их с ростстимулирую щими факторами.
Материал и методы исследования. Костный мозг был получен из крыла подвздошной кости 16 больных МЭХД, 28 больных СОП и 4 больных в отдаленном периоде после травмы (контрольная группа) во время операции или при диагностической биопсии.
Клонирование стромальных фибробластов костного мозга (КОКф) проводилось по методу, описанному А.Я. Фриденштейном |6 ].
Для оценки индукционно-морфогенетических взаимоотношений пролиферативной активности КОКф и биологических индукторов, содержащихся в фидерных клетках, изучали зависимость клеточных колоний от фидера по разработанной нами методике [2], которая даст возможность рассмотреть влияние ауто и ксснофидсра, а также состояние самих клеток-мишеней (при смене среды, т.е. "сбросе" фидера), когда устраняется влияние внешних для КОКф ростстимулирующих факторов.
Таким образом, клонирование проводили в.З экспериментальных вариантах (см. таблицу): 1-й вариант — смена среды, т.е. удаление ("сброс") аутофидера без добавления ксенофидера; 2-й вариант — смена среды не производилась, т.е. сохранялся аутофидер, ксенофидер нс добавляли; 3-й вариант — смена среды ("сброс"), добавление ксенофидера.
Сравнительная характеристика эффективности клонирования стромальных клеток костного мозга при МЭХД и СОП
Диагноз Число наблюдений 1й вариант — смена среды 2-й вариант — без смены среды 3-й вариант — смена среды; добавление ксенофидера
М±т Р М±ш Р М±т Р
МЭХД: "спокойные" экзостозы 4 63,2±11,1 0,05 60,02±5,9 > 0,05 73,2±5,7 > 0,05
быстрорастущие ЭКЗОСТОЗЫ 12 71,0±11,9 < 0,02 111,8±7,8 < 0,001 113,0±11,8 < 0,001
СОП 24 25,5±3,5 < 0,05 34,04±4,95 < 0,02 56,6±3,6 >0,05
Контроль травм) (отдаленные последствия 4 36,0±3,2 53,4±4,9 64,0±4,6
Примечание, р по отношению к контролю.
Результаты исследования. Распределение ЭКОф в норме (контроле) можно охарактеризовать следующими закономерностями (см. таблицу): "сброс" уменьшает ЭКОф. Если это так, то аутофидер стимулирует пролиферативную активность КОКф; добавление ксенофидера увеличивает ЭКОф, и это увеличение более выражено, чем увеличение за счет аутофидера.
У больных со "спокойными" экзостозами пролиферативный потенциал собственно клеток-мишеней (1-й вариант) был повышен по сравнению с контролем (на границе достоверности, р = 0,05). Учитывая относительно невысокую способность КОКф пролиферировать и давать колонии без фидера в норме, можно полагать, что это указывает на аномально усиленную способность к пролиферации собственно КОКф больных МЭХД. В то же время присутствие как ауто (2-й вариант), так и ксенофидера (3-й вариант) существенно не влияло на ЭКОф, и ЭКОф во 2-м и 3-м вариантах практически не отличалась от контроля.
Другую картину мы наблюдали у больных с быстрорастущими экзостозами. Во всех 3 вариантах опытов ЭКОф была высокодостоверно больше, чем в контроле (см. таблицу). При этом обнаруживалось необычно сильное влияние аутофидера на ЭКОф (2-й вариант) по сравнению с ксенофидером (3-й вариант). ЭКОф собственно культивируемых клеток (1-й вариант) была повышена еще более значительно, чем при "спокойных" экзостозах.
При изучении эффективности клонирования стромальных фибробластов от больных СОП (см. таблицу) обращала на себя внимание низкая ЭКОф собственно культивируемых клеток, нс подвергающихся влиянию ни ауто-, ни ксеногенных ростстимулирующих факторов (1-й вариант опыта), т.е. можно полагать, что выявленный эффект связан преимущественно с колонисобра зующими свойствами самих клеток, а нс с фидерным воздействием. В то же время сохранялся нормальный ответ клеток на воздействие ростстимулирующих факторов, содержащихся как в ауто-, так и в ксснофидсрах (2-й и 3-й варианты опытов).
Таким образом, состояния можно считать оппозитными как с точки зрения основных клинических проявлений заболевания (костно-хрящевые разрастания при МЭХД и остеопения при СОП), так и под углом зрения клональных особенностей клеток, имеющих непосредственное отношение к гистогенезу костной и хрящевой ткани. Механизмы этих изменений могут быть различными, чему представлены первые доказательства.
Складывается впечатление, что при СОП выявленное резкое уменьшение эффективности клонирования связано преимущественно с уменьшением числа колониеобразующих клеток в единице объема костного мозга и/или ослаблением их пролиферативной активности.
Быстрый рост и пролиферация экзостозов при МЭХД, по-видимому, обусловлены как повышением пролиферативной активности самих культивируемых клеток, так и (особенно) усилением ростстимулирующего влияния аутофидера.
Приведенные данные показывают необходимость дальнейшего изучения причин наблюдаемых феноменов.
Так, можно предполагать, что аутофидерное влияние может быть обусловлено не только специфичным для КОКф ростовым фактором, содержащимся в тромбоцитах и мегакариоцитах костномозговой взвеси [8, И], но и другими ростстимулирующими факторами, содержащимися в клетках этой взвеси. Причины повышения или понижения активности самих культивируемых клеток, вероятно, следует искать в наследственных дефектах клеток, рецепторов, в дефектах продукции факторов (в том числе ростстимулирующих), способствующих пролиферации и вырабатываемых самими клетками-мишенями.
При рассмотрении многих болезней костно-суставной системы, в том числе МЭХД и СОП, как следствия генетически детерминированных нарушений морфогенеза любой из выявленных показателей может оказаться тестом на костно хрящевую патологию.

About the authors

E. M. Meerson

Central Institute of Traumatology and Orthopedics. N.N. Priorova

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Moscow, Russia

B. K. Ilyin

Central Institute of Traumatology and Orthopedics. N.N. Priorova

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Moscow, Russia

B. H. Burdygin

Central Institute of Traumatology and Orthopedics. N.N. Priorova

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Moscow, Russia

C. C. Rodionova

Central Institute of Traumatology and Orthopedics. N.N. Priorova

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Moscow, Russia

L. V. Balberkin

Central Institute of Traumatology and Orthopedics. N.N. Priorova

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Moscow, Russia

S. I. Mitin

Central Institute of Traumatology and Orthopedics. N.N. Priorova

Email: info@eco-vector.com
Moscow, Russia

References

Supplementary files