The value of the Formol-Müller fluid in the hardening and staining of brain preparations

Abstract

In March 1896, an article by Professor Orth appeared in the Berliner Klinische Wochenschrift, in which he proposes a new sealing liquid, consisting of formalin and Müller's liquid and named after Formol-Müller's. Its composition: 100 parts of Müllerian liquid + 10 parts of formalin (by volume). Judging by Orta's article, preparations compacted in his liquid should be stored for a very long time.

Full Text

Въ мартѣ 1896 года въ „Berliner klinische Wochenschrift“ появилась статья проф. Орта, въ которой онъ предлагаетъ новую уплотняющую жидкость, состоящую изъ формалина и Мюллеровской жидкости и названную имъ Formol- Мüllеr’овской. Составъ ея: 100 ч. Мюллеровской жидкости + 10 ч. формалина (по объему). Судя по статьѣ Орта, препараты, уплотненные въ его жидкости, должны сохраняться очень долго.

Изъ статьи Орта почти не видно, какъ окрашиваются срѣзы мозга, уплотненнаго въ его жидкости. Прежде чѣмъ изложить результаты своихъ наблюденій въ этомъ направленіи, считаю нелишнимъ сказать, почему я обратилъ вниманіе на Formol-Müller’oвскyю жидкость.

За послѣднее время въ окраскѣ центральной нервной системы пріобрѣлъ большое и вполнѣ заслуженное значеніе способъ окраски метиленовой синькой по Nissl’ю. Къ сожалѣнію, noNissl’ю красятся нервныя клѣтки, но не красится бѣлое вещество мозга; между тѣмъ спиртовое уплотненіе препаратовъ, требуемое Nissl᾿eвскою окраскою, сильно ограничиваетъ примѣненіе къ тѣмъ же кусочкамъ мозга другихъ способовъ окраски; разрѣзать же свѣжій мозгъ на отдѣльные кусочки, уплотняя часть ихъ въ Мюллеровской жидкости, часть въ спиртѣ, не всегда бываетъ удобно, особенно въ тѣхъ случаяхъ, гдѣ требуется непрерывный рядъ срѣзовъ изъ небольшого объекта. Въ виду этого вполнѣ понятно стремленіе получить Nissl᾿eвскую) окраску срѣзовъ мозга, уплотненнаго въ жидкости, позволяющей красить по Палю, Вейгерту и др. или совмѣстить ее, такъ или иначе, съ окраскою нервныхъ волоконъ.

Мнѣ удалось получить удовлетворительную Nissl᾿eвскую¹) окраску срѣзовъ мозга, уплотненнаго въ насыщенномъ растворѣ сулемы +acid. acetic. glaciale; нѣкоторые товарищи по лабораторіи, какъ и я самъ, получали удовлетворительную окраску по Nissl’ю срѣзовъ мозга, уплотненнаго въ формалинѣ. Сулемовое уплотненіе не годится для окраски гематоксилиномъ по способу Паля и Вейгерта; что же касается формалина, то хотя онъ и даетъ возможность красить по Палю и Вейгерту, если кусочки мозга выдержать передъ этимъ нѣкоторое время въ растворѣ двухромокаліевой соли, но эта окраска по чистотѣ и отчетливости уступаетъ окраскѣ мозга, уплотненнаго въ Мюллеровской жидкости. Пробовали также красить по Nissl’ю срѣзы мозга, уплотненнаго въ Мюллеровской жидкости, но результаты получились отрицательные и, какъ мнѣ кажется, по слѣдующей причинѣ: окраска клѣтокъ по Nissl’ю основана на томъ, что, при дѣйствіи спиртоваго раствора анилина на окрашенный синькою срѣзъ, краска удерживается въ клѣткахъ, извлекаясь въ тоже время изъ другихъ элементовъ мозга; а при дѣйствіи анилиноваго раствора на окрашенный синькою срѣзъ мозга, уплотненнаго въ Мюллеровской жидкости, происходитъ равномѣрное извлеченіе- краски какъ изъ нервныхъ волоконъ, такъ и изъ клѣтокъ (она удерживается дольше въ бѣлыхъ кровяныхъ шарикахъ); понятно, что голубая клѣтка не выдѣляется на голубомъ фонѣ мозгового вещества. Мои попытки окрасить синькою по Nissl’ю срѣзы, уже окрашенные по Палю, пока не увѣнчались успѣхомъ.

Послѣ всего вышесказаннаго оставалось испробовать комбинацію уплотняющихъ жидкостей. Тогда я обратился къ предложенной Ортомъ Formol-Мüllеr’овской жидкости.

По словамъ Орта, препараты, помѣщенные въ его жидкость, уплотняются очень скоро: большіе препараты (органы) требуютъ до 4 дней, а маленькіе, около ¹/₃— ¹/₂ снтм.  толщиною, уплотняются въ термостатѣ въ теченіе 3-хъ часовъ, причемъ пріобрѣтаютъ замѣчательно удобную консистенцію для производства срѣзовъ на микротомѣ. Если кусочки остаются въ жидкости долѣе, это не вредитъ. Далѣе, кусочки промываются въ водѣ (лучше въ проточной) до тѣхъ поръ, пока вода перестанетъ окрашиваться въ желтый цвѣтъ (извлеченіе хромовыхъ солей). Чѣмъ лучше промыты препараты, тѣмъ лучше потомъ они окрашиваются. Затѣмъ препараты переносятъ въ 93% спиртъ на время отъ 12—24 часовъ при комнатной температурѣ; если ихъ оставить въ спиртѣ на 3 — 4 дня. окрашиваемость срѣзовъ получается особенно хорошая. Далѣе слѣдуетъ обычное заключеніе препаратовъ въ параффинъ. Срѣзы окрашиваются очень хорошо карминными красками (квасцовый, литіевый, цикролитіевый карминъ), „но также и гематоксилинъ, и высокоцѣнимая мною метиленовая синька“, говоритъ авторъ, „даютъ хорошую картину“. Хорошіе результаты получаются при окраскѣ по van-Gieson’y.

Я воспользовался жидкостью Орта для уплотненія свѣжаго мозга собаки, положивъ въ жидкость тонкіе кусочки спинного и продалговатаго мозга. Часть кусочковъ мозга, послѣ соотвѣтственной обработки²), я заключилъ въ параффинъ, часть—въ целлоидинъ. Срѣзы дѣлались на микротомѣ Schanze. Здѣсь я долженъ подтвердить заявленіе Орта, что препараты, уплотненные въ его жидкости, пріобрѣтаютъ замѣчательно удобную консистенцію для рѣзанія на микротомѣ: мозгъ пріобрѣтаетъ эластичность и не рвется на бритвѣ; срѣзы довольно большой величины (поперечные срѣзы изъ мозга взрослой собаки на уровнѣ перехода продолговатаго мозга въ Варольевъ мостъ) изъ мозга, заключеннаго въ целлоидинъ, дѣлаются легко толщиною въ 1 дѣленіе микротома.

Я испробовалъ слѣдующіе способы окраски: Nissl’a, Раl`я, Кульчицкаго, Вейгерта, Van-Gieson’a, нейтральный карминъ, Marchi.

Окраска по Nissl’ю удается хорошо. Кромѣ нервныхъ и невроглійныхъ клѣтокъ, лейкоцитовъ и палочкообразныхъ ядеръ гладкихъ мышечныхъ волоконъ въ стѣнкахъ сосудовъ, окрашеннымъ представляется и содержимое сосудовъ, кровяные шарики, въ желтый цвѣтъ. Въ протоплазмѣ клѣтокъ замѣчается частью зернистость, частью исчерченность; исчерченность представляется, въ большинствѣ случаевъ, не столь рѣзкою, какъ при спиртовомъ уплотненіи мозга.

Окраска срѣзовъ по способу Паля и Вейгерта не удалось: послѣ обработки срѣзовъ растворомъ марганце-каліевой соли и щавелевой кислоты получились совершенно бѣлые срѣзы. Имѣя въ виду, что подобные случаи бываютъ съ препаратами, свѣжеуплотненными въ растворѣ двухромокаліевой соли, если хромовыя соли извлекаются ихъ нихъ продолжительнымъ промываніемъ въ водѣ и затѣмъ въ слабомъ спиртѣ, я нѣсколько отступилъ отъ начертанной Ортомъ программы и кусочки мозга, уплотненные въ его жидкости, перенесъ прямо въ крѣпкій спиртъ (95%), лишь сполоснувъ ихъ въ водѣ. Послѣ 2 хъ дневнаго пребыванія въ спиртѣ кусочки заключены въ целлоидинъ.

При такой обработкѣ окраска срѣзовъ по Палю получилась, хотя не такая отчетливая, какъ окраска срѣзовъ мозга, уплотненнаго въ Мюллеровской жидкости. Особенно неотчетливо³) красятся отдѣльныя мякотныя волокна въ сѣромъ веществѣ спинного мозга. Нѣсколько лучше получается окраска квасцовымъ гематоксилиномъ съ послѣдующей обработкой срѣзовъ по Вейгерту. Совершенно тоже, что о способѣ Паля, я могу сказать о способѣ окраски уксуснокислымъ гематоксилиномъ по Кульчицкому. При всѣхъ этихъ способахъ обращаетъ на себя вниманіе окраска сосудовъ мозга, получающаяся постоянно: красится содержимое сосудовъ, начиная съ крупныхъ, до мельчайшихъ капилляровъ включительно, въ темно-бурый, почти черный цвѣтъ; отдѣльные кровяные шарики—желто-бураго цвѣта. Стѣнки сосудовъ не окрашиваются.

Окраска по способу Van-Gieson’a получается удовлетворительно. Содержимое сосудовъ окрашивается въ желтый цвѣтъ иногда съ розовымъ оттѣнкомъ, стѣнки—въ красный, палочкообразныя ядра гладкихъ мышечныхъ волоконъ, содержащихся въ стѣнкахъ сосудовъ, —въ насыщенно-красный цвѣтъ,

Нейтральнымъ корминомъ срѣзы не окрашиваются; въ сосудахъ красные кровяные шарики, тѣмъ не менѣе, представляются окрашенными въ желтый цвѣтъ.

Окрашивая срѣзы по способу Nissl’я, я получилъ окраску, не получающуюся ни при спиртовомъ уплотненіи препаратовъ, ни при уплотненіи въ жидкости Орта съ послѣдующимъ промываніемъ кусочковъ мозга въ водѣ; а именно: кромѣ вышеупомянутыхъ элементовъ, т е. клѣтокъ, лейкоцитовъ и сосудовъ, окрасилось бѣлое мозговое вещество и нервные корешки въ фіолетовый цвѣтъ.

Съ цѣлью получить объекты для окраски по способу Marchi была произведена слѣдующая операція: маленькой собачкѣ я сдѣлалъ продольный разрѣзъ спинного мозга, около 2 снтм. длиною, на уровнѣ 10—11 грудныхъ позвонковъ. Собака прожила послѣ операціи два дня. Для изслѣдованія были взяты кусочки мозга вблизи области операціи и положены въ жидкость Орта. Длина кусочковъ не превышала 1 снтм. Изъ Formol-Мüllеr’овской жидкости кусочки перенесены въ жидкость Marchi, гдѣ оставались 8 дней. Послѣ обычнаго промыванія въ водѣ и заключенія въ целлоидинъ были сдѣланы срѣзы. Локализація обнаруженнаго перерожденія не составляетъ задачи моего изслѣдованія, поэтому я ограничусь оцѣнкою качества окраски. Окраска перерожденныхъ міэлиновыхъ волоконъ получилась очень рѣзкая, чистая, ничуть не уступающая окраскѣ послѣ уплотненія мозга въ Мюллеровской жидкости. Содержимое сосудовъ окрасилось въ желто-бурый цвѣтъ. Очень красиво и отчетливо выступила при описываемой окраскѣ жировая дегенерація клѣтокъ переднихъ роговъ: однѣ клѣтки, повидимому, совершенно здоровы, въ протоплазмѣ другихъ видимъ скопленіе бурыхъ зернышекъ въ одномъ или нѣсколькихъ мѣстахъ, особенно у мѣста отхожденія отростковъ; въ третьихъ — поражены и ядра, и протоплазма, въ четвертыхъ—вся клѣтка состоитъ изъ зернышекъ, частью сливающихся между собою, и уже начинаетъ утрачивать свои очертанія и т. д.

Изъ настоящаго изложенія можно было замѣтить, что для жидкости Орта является характерною окраска сосудовъ, получающаяся съ постоянствомъ при различныхъ способахъ окраски срѣзовъ, въ ней уплотненныхъ. Эта окраска зависитъ отъ двухромокаліевой соли, удерживающейся въ красныхъ кровяныхъ шарикахъ, благодаря формалину. Справедливость этого доказывается, во-первыхъ, тѣмъ, что кровяные шарики вездѣ окрашиваются въ желтый цвѣтъ (разница въ оттѣнкахъ); во-вторыхъ, тѣмъ, что при окраскѣ карминомъ, гдѣ срѣзъ остается почти совершенно бѣлымъ, сосуды все-таки окрашены въ желтый цвѣтъ.

Резюмируя все вышесказанное, я прихожу къ слѣдующимъ выводамъ:

1.             Жидкость, предложенная Ортомъ и названная имъ Fоrmоl-Мüllеr’овской, пригодна для быстраго уплотненія мозга.
2.             Особенно рекомендуется примѣнять ее, если имѣется въ виду изслѣдованіе сосудовъ мозга.
3.             Такъ какъ въ составъ Fоrmоl-Мüllеr’овской жидкости входитъ формалинъ, то препараты, въ ней уплотненные, представляются эластичными и удобными для производства самыхъ тонкихъ срѣзовъ.
4.             Срѣзы мозга, уплотненнаго въ жидкости Орта, красятся по приведеннымъ способамъ, при чемъ, если желательно при окраскѣ по Nissl’ю получить окраску волоконъ, нужно поступать слѣдующимъ образомъ:

а)   уплотненіе кусочковъ мозга въ жидкости Орта;

б)   промываніе въ водѣ въ теченіе 1—2 минутъ;

в)   перенесеніе кусочковъ въ крѣпкій спиртъ (95%—97%) на 1—2 дня, причемъ лучше держать сосудъ въ темнотѣ⁴);

г)    заключеніе въ целлоидинъ обычнымъ способомъ;

д)   когда сдѣланы срѣзы, они окрашиваются растворомъ Nissl᾿евской синьки, хорошо промываются въ водѣ, переносятся въ 10% растворъ анилина въ спиртѣ, гдѣ черезъ нѣкоторое время пріобрѣтаютъ блѣдно-синій, почти голубой, цвѣтъ; тогда срѣзы переносятся въ ol. Origani vulgaris, не извлекающее синьки, но растворяющее целлоидинъ. Заключеніе срѣзовъ въ канадскій бальзамъ.

Окраска моихъ препаратовъ въ теченіи 3-хъ мѣсяцевъ нисколько не измѣнилась.

Если имѣется въ виду сохранить препараты, уплотненные въ жидкости Орта, въ теченіи продолжительнаго времени (послѣднее особенно относится къ микроскопическимъ препаратамъ), то черезъ 3—4 дня Ортъ совѣтуетъ переносить ихъ въ жидкость слѣдующаго состава:

100 ч. 60% спирта + l ч. формалина или:

125 ч. (по объему) 93% спирта

90 ч.               —            —        глицерина

200 ч.                —            —        воды

10 ч.               —            —        формалина.

Это дѣлается потому, что въ Fоrmоl-Мüllеr’овской жидкости черезъ 3—4 дня выпадаетъ кристаллическій осадокъ, вслѣдствіе чего жидкость становится негодною для употребленія.

¹ Я всегда пользуюсь способомъ Nissl᾿я, видоизмѣненнымъ Ф. К. Те­лятникомъ. См. Ф. К. Телятникъ. Видоизмѣненіе окраски нервныхъ клѣтокъ по Nissl’ю. —«Обозрѣніе психіатріи» 1896, № 9.

² Я поступилъ именно такъ, какъ рекомендуетъ Ортъ въ своей статьѣ.

³ На неотчетливость окраски по способу Паля указываетъ также Neudorffer, приписывая это слишкомъ сильной крѣпости раствора формалина въ жидкости Орта. См. R. Neudorffer. Dementia paralitica etc. —Arch. f. patholog. Anatom. u. Physiol. etc. Berlin, 1896. Bd. 146, S 377.

⁴ Это дѣлается во избѣжаніе образованія осадковъ хромовыхъ солей