ВЛИЯНИЕ СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД И РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА ПРИ КЛОНАЛЬНОМ МИКРОРАЗМНОЖЕНИИ НЕКОТОРЫХ ПОЛИПЛОИДНЫХ ФОРМ РОДА VACCINIUM L.

Полный текст

Род Vaccinium L., включает в себя значительное количество видов, ягоды которых, используются человеком в пищу и при помощи селекции получены сорта для возделывания в культуре. Однако, наибольшее распространение получили три вида - это Клюква болотная (Vaccinium oxycoccos L.), Голубика высокорослая (Vaccinium corymbosum L.) и Брусника (Vaccinium vitis-idaea L.), различные сорта, которых, выращиваются на ягодных плантациях [1, 2, 3]. Спрос на ягоды и сами растения этих культур постоянно растёт, об этом говорит появление новых сортов, закладка плантаций, селекционная работа, направленная на механизированную уборку Голубики [4, 5], создание новых сортов Клюквы [6, 7], исследования по плантационному выращиванию брусники [8]. Из-за специфики селекционного процесса и биологических особенностей получение посадочного материала производят вегетативным методом. Все эти растения как плантационные культуры начали активно использовать относительно недавно. В различных американских и европейских изданиях есть описания специфики клонального микроразмножения видов рода Vaccinium, однако, из-за генетических особенностей сортов и видов (сорта клюквы американской селекции относятся к другому виду и отличаются по количеству хромосом), методов их получения, например гибридизации разных видов Vaccinium corymbosum x Vaccinium uliginosum, по этим причинам методики клонального микроразмножения будут сильно различаться [9, 10, 11, 12, 13, 14, 15]. Остается много проблемных вопросов по эффективности введения в культуру, составу питательных сред и регуляторов роста, мере активности ионов водорода в питательной среде. Исходя из этого цель нашей работы - подбор питательной среды и регуляторов роста, для размножения различных сортов клюквы болотной, голубики высокорослой и брусники в культуре in vitro. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В работе нами были использованы сорта клюквы болотной полученные селекционерами Центрально-европейской лесной опытной станции г. Костромы: Алая заповедная, Дар Костромы, Сазоновская, Краса Севера. Два сорта брусники костромской селекции - Костромичка, Костромская розовая и перспективный сеянец № 11. Три формы голубики - № 122, № 201, № 203, полученные от опыления сортов Норд Лэнд и Норд Кантри. В качестве донорных эксплантов использовали метамеры побега с пазушными почками. Для снижения количества контаминации при введении в культуру in vitro, использовали молодые побеги возрастом до одного месяца, при этом сами растения находились в контролируемых условиях вегетационной комнаты, а побеги получали используя метод выгонки [16]. Метамеры длиной 5 мм с почкой в чашке Петри переносят в ламинарный бокс и стерилизуют в 70% водном растворе этанола в течение 1 минуты, после 15 минут стерилизуют в 5% водном растворе гипохлорита натрия или калия и промывают в трех сосудах со стерильной водой, объемами не менее 100 мл. После стерилизации скальпелем отсекаем лишние ткани побега, оставляя только узел с почкой, который сажаем на питательные среды. Технология клонального микроразмножения включает в себя несколько этапов, на каждом из которых меняется состав питательной среды и используемые регуляторы роста [17]. При введении в культуру in vitro для активации пазушных меристем нами использовалась питательная среда WPM [18], дополненная 100 мг/л мезоинозита, 2 мг/л глицина, 0,5 мг/л тиамина, 0,5 мг/л пиридоксина, 20 г/л сахарозы и 5,0 г/л агара, рН 4,5. В качестве регуляторов роста использовали 2-изопентиладенин в концентрации 5 мг/л и β-индолилуксусную кислоту в концентрации 0,5 мг/л. На этапе введения в культуру in vitro, нами исследовался вид питательной среды подходящий для отобранных сортов и форм, регуляторы роста при этом были подобраны по литературным источникам, отдавая предпочтение наиболее часто используемым [9, 10, 11, 12]. Для изучения влияния состава питательной среды и регуляторов роста на активацию пазушных меристем на этапе элонгации и микрочеренкования, нами использовались питательные среды: Andersona и WPM [12, 18]. В состав питательных сред были включены 100 мг/л мезоинозита, 2 мг/л глицина, 0,5 мг/л тиамина, 0,5 мг/л пиридоксина, 20 г/л сахарозы и 5,0 г/л агара. Уровень рН питательной среды измерялся при помощи стационарного рН-метра Hanna HI-2210 после добавления всех компонентов, кроме агара, и доводился до значения 4,0-4,8. В качестве регуляторов роста для геммогенеза использовались 2-изопентиладенин в концентрациях для клюквы от 1 до 5 мг/л, голубики от 6 до 14 мг/л, брусники от 1 до 5 мг/л, в этом опыте деление на сорта не проводили. Культивирование растений-регенерантов проводили при освещении 1500 Лк и периоде 16 ч (день)/8 ч (ночь) при температуре не выше 25ºС. На этапе введения в культуру in vitro использовали стеклянные культуральные сосуды, объемом 10 мл. На этапе элонгации, микрочеренковании и укоренения использовали пластиковые одноразовые сосуды объёмом 100 мл, в каждом сосуде было 50 мл питательной среды и от 180 до 250 растений-регенерантов. Каждый пассаж клонального микроразмножения проводили через 45 суток, к этому времени побеги в культуральных сосудах достигали высоты: клюква 5-7 см, голубика 4-5 см, брусника 3-4 см. Фотографирование растущих в культуре in vitro растений-регенерантов проводили с использованием цифровой камеры «Samsung». Статистическую обработку данных проводили по стандартным методикам при помощи Microsoft Excel и Matrix. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ При оценке влияния различных питательных сред на активность морфогенеза в момент введения в культуру in vitro, в качестве основных показателей, по которым проводили анализ, нами использовались такие как - число образовавшихся почек на одном экспланте, начало геммогенеза, так же проводили оценку появления витрифицированных побегов. В опыте по влиянию вида используемой питательной среды на морфогенез трёх сортов клюквы было установлено, что из двух взятых для работы питательных сред, все три сорта на питательной среде Andersona начинали расти уже на 22-23 сутки и образовывали большее число побегов в лучших вариантах, в то время как на питательной среде WPM, процесс образования новых побегов происходил на 24 сутки с образованием меньшего числа побегов (табл. 1). В аналогичном предыдущему опыте только с тремя формами голубики, было установлено, что для отобранных форм голубики по всем показателям предпочтительнее использование питательной среды WPM. В лучшем варианте, побегообразование начиналось уже на 27 сутки и через 40 суток культивирования получали по 2,8 побегов на эксплант (табл. 2). При работе с донорными эксплантами брусники нами было установлено, что для введения в культуру необходимо использовать питательную среду Andersona, при использовании на этапе введения этой питательной среды удалось добиться начала роста на 27-30 сутки, а к 40 суткам культивирования в лучшем варианте эксперимента образовывалось по 3,2 почки на эксплант. В работах посвящённых размножению голубики и клюквы содержаться различные данные об используемых регуляторах роста, на основе предыдущего опыта нами было установлено положительное влияние на морфогенез регулятора роста 2-изопентиладенина (2-ip). Нами проводился опыт по определению разных концентраций этого регулятора роста на на активность морфогенеза при клональном микроразмножении. В результате было установлено, что большее число побегов и метамеров клюква образовывала на питательной среде с концентрацией 2-ip составляющим 3 мг/л, голубика - 8 мг/л; брусника 4 мг/л (табл. 4). Клональное микроразмножение представителей рода проводили через каждые 45-50 суток, к этому времени побеги достигали высоты 4-6 см и имели от 5 до 9 узлов. В результате опыта была установлена чёткая зависимость в первую очередь скорости роста микрорастений от уровня рН (табл. 4, рис.1). Таким образом, наиболее перспективной питательной средой для индукции морфогенеза и клонального микроразмножения трех сортов Vaccinium oxycoccos L. была питательная среда Andersona содержащая 2-ip в концентрации 3 мг/л ; для трёх селекционных образцов Vaccinium corymbosum L. - WPM, дополненная 2-ip в концентрации 8 мг/л; для Vaccinium vitis-idaea L. питательная среда Andersona, дополненная 2-ip в концентрации 4 мг/л. Выполненные исследования по клональному микроразмножению девяти селекционных образцов рода Vaccinium L., можно использовать для получения посадочного материала данных культур при создании ягодных плантаций, а уже имеющийся материал в селекционной работе по созданию новых сортов и гибридов. Таблица 1. Влияние вида используемой питательной среды на морфогенез клюквы, сахароза 20 г/л, рН 4,8 Таблица 2. Влияние вида используемой питательной среды на морфогенез форм голубики, используемых в работе, сахароза 20 г/л, рН 4,8 Таблица 3. Влияние вида используемой питательной среды на морфогенез брусники, сахароза 20 г/л, рН 4,8 Таблица 4. Влияние концентрации регулятора роста 2-изопентиладенина (2-ip) на морфогенез видов используемых в работе, голубика на питательной среде WPM, брусника и клюква - Andersona, сахароза 20 г/л Рис 1. Культивирование Брусники (1), Голубики (2) и Клюквы (3) на питательных средах с оптимальным составом для культивирования

Об авторах

Дмитрий Николаевич Зонтиков

Костромской государственный университет

Email: zontikovdn@mail.ru
кандидат сельскохозяйственных наук, старший научынй сотрудник

Светлана Анатольевна Зонтикова

Костромской государственный университет

Email: antennaria@mail.ru
кандидат сельскохозяйственных наук, доцент кафедры биологии и экологии

Ксения Вячеславовна Малахова

Костромской государственный университет

аспирант

Эдуард Владимирович Марамохин

Костромской государственный университет

ассистент кафедры биологии и экологии, аспирант

Список литературы

Дополнительные файлы