CHANGES OF THE MORPHOLOGICAL PROPERTIES OF YEAST S. CEREVISIAE IN CONDITIONS OF STRESS

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Современное понимание механизмов адаптации дрожжей и их регуляция имеют не только важное научное, но и прикладное значение, поэтому в настоящее время актуально изучение динамики стрессовых реакций и адаптации дрожжей в условиях природной среды и биотехнологических производств [1 - 3]. Основные биохимические процессы, происходящие в клетке при различного рода экологических стрессах, отражают адаптацию к конкретным экстремальным ситуациям [4, 5]. Температурная адаптация сопровождается модуляциями в изомерном составе жирных кислот и длине их цепей; изменениями в микровязкости липидного бислоя и корреляцией степени ненасыщенности микровязкости полярных и нейтральных липидов [6, 7], увеличением активности антиоксидантных ферментов [8], повышением уровня трегалозы среди углеводов цитозоля [9]. В рН - адаптации важную роль играют ферменты антиоксидантной защиты [8, 10 - 12], перегруппировка и изменение содержания липидов, углеводов клеточной стенки, изменение концентрации белков митохондрий относительно белков цитоплазмы [13, 14]. В условиях солевого стресса в дрожжах S. cerevisiae происходит изменение потенциала плазматической мембраны и внутриклеточного рН; снижение объема клеток; накопление в цитозоли глицерина; увеличение гликолитических соединений [14 - 16]. Известно, что происходящие в экстремальных условиях изменения в биохимических процессах, предопределяющие жизнеспособность клеток, оказывают влияние и на морфологические характеристики дрожжей [17, 18], в том числе на свойства гигантских колоний [19]. Поэтому важным параметром, по которому можно оценивать действие стресс - факторов на физиологические особенности дрожжей, является морфология гигантских колоний. Ранее были изучены морфолого - культуральные свойства дрожжей Saccharomyces в экстремальных условиях [20, 21]. Установлен факт морфологических изменений клеток и гигантских колоний штаммов S. cerevisiae Y-503 и S. cerevisiae DAW-За в результате раздельного влияния рН - и осмо - стресса. Представляет интерес исследование морфологических особенностей гигантских колоний дрожжей в условиях одновременного действия нескольких стресс-факторов. Изучение стрессовых воздействий и механизмов регуляции метаболизма клеток в процессе адаптации необходимо для поиска экстремофильных штаммов - перспективных объектов различных биотехнологий. Целью работы является исследование влияния различных значений рН, температуры и концентрации NaCl в среде на морфологические особенности штамма Saccharomyces cerevisiae DAW-3a. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектом исследований являлся штамм S. cerevisiae DAW-За, хранящийся в коллекции лаборатории биохимии и биотехнологии ПИБР ДНЦ РАН и Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика. Штамм DAW-3a является потомком линии штамма ВКПМ Y- 503, полученного в результате лазерного воздействия в Прикаспийском институте биологических ресурсов ДНЦ РАН [22]. Принадлежность штаммов S. cerevisiae Y-503 (гетерозиготный тетраплоид) и S. cerevisiae DAW-3а (гетероталличный гаплоид) к таксону S. cerevisiae была подтверждена с помощью молекулярно-генетических методов [23]. Гигантские колонии дрожжей выращивались на твердой среде YPD, содержащей дрожжевой экстракт - 0,5 % (BD, США), пептон - 0,5 % (BD, США), глюкозу (D-глюкоза) - 2,0 % (Merk, Германия), агар-агар - 2,5 % (Difco, Нидерланды), при различных значениях температуры (30 и 37°С), pH (3,0; 4,5; 7,0; 9,0; 11,0) и концентрации NaCl (0 и 5%) в течение двадцати суток на чашках Петри. Морфология клеток колоний (форма, величина клеток, способ вегетативного размножения) изучалась с использованием светового микроскопа. Основным критерием для определения морфологического типа колоний служила совокупность стандартных признаков: формы, размеров, цвета, поверхности, профиля, края, структуры. В работе использовались приборы: ламинарный бокс ВЛ-12 1000 (Россия), микробиологический инкубатор BINDER BF 115 (Германия), сушильный шкаф SNOL 67/350 (Utenos, Литва), микроскоп CХ21 (Olympus, Япония), pH - метр Анион 4100 (Анион, Россия); весы аналитические DV215CD (Ohaus Discovery, Швейцария). Кислотность среды корректировалась 1N НС1 или 4М КОН (Россия). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ В результате исследования процесса адаптации DAW-3а к широкому диапазону значений рН среды при отсутствии соли и температуре 30°С обнаружены морфологические изменения гигантских колоний и образующих их клеток. Установлено, что значение рН 4,5 являлось оптимальным для роста дрожжей (таблица). Повышение или уменьшение рН среды культивирования по сравнению с оптимальными значениями этого показателя сначала снижает, а затем приостанавливает рост дрожжевых клеток. В щелочных условиях отмечалось небольшое уменьшение размеров по сравнению с рН 4,5, при культивировании на средах с низким значением pH - существенное уменьшение размеров клеток. Однако нами обнаружена способность дрожжевых клеток DAW-3а достаточно активно развиваться в неблагоприятных условиях. Исследования показали, что во всех вариантах обнаружены почкующиеся клетки (до 5%), в клетках наибольшего размера - наличие зернистой цитоплазмы, подтверждающей присутствие запасных питательных веществ; определенная часть клеток (до 3%) содержала крупную вакуоль (рис. 1, а). Известно, что от рН зависит и термоустойчивость клеток. В литературе имеются сведения об изменении содержания субстратов энергетического обмена в клетках при низкой температуре [24], увеличении размера клеток при температуре 37°С [25]; появлении множества глобулярных структур на поверхности клеточной стенки при тепловом стрессе [7]. В нашем случае в условиях повышенной температуры 37°С и при отсутствии соли обнаружена однородность формы клеток во всех вариантах и небольшое увеличение размеров при рН 3,0 по сравнению с клетками при 30°С (таблица; рис. 2, а), что, возможно, отражает уровень их устойчивости к гипертермии. При рассмотрении морфологических свойств гигантских колоний штамма DAW-3а в широком диапазоне значений рН, отсутствии соли и показаниях температуры 30 и 37°С во всех вариантах наблюдается сохранение округлой, в виде цветка формы, радиально исчерченной поверхности, плоского, со слегка выпуклым центром профиля; незначительное изменение цвета (оттенки бежевого) и структуры (небольшое уплотнение при pH 11,0). При этом выявлено существенное изменение размеров гигантских колоний DAW-3a в зависимости от температуры и pH среды. Если при температуре 30°С значение рН 4,5 являлось оптимальным для роста колоний, то при 37°С ситуация меняется. В условиях повышенной температуры на средах с низким значением pH 3,0 размер колоний был максимальным, что коррелирует с размерами клеток и отражает адаптивный ответ DAW-3а на тепловое воздействие. Данные специфические особенности дрожжей S. cerevisiae DAW-3а представляют интерес для поиска штаммов, толерантных к кислой среде и повышенной температуре. Известно, что высокая толерантность определенных штаммов S. cerevisiae к кислой среде является важным фактором для использования в промышленной биотехнологии [26]. В остальных вариантах дрожжи также проявили достаточную устойчивость к различным значениям рН, изменение размеров колоний варьировало в пределах 5 - 42% (рис. 3). В целях исследования адаптации S. cerevisiae DAW-3а к солевому стрессу были изучены морфологические особенности гигантских колоний и образующих их клеток при различных значениях рН, 5% NaCl, температуре 30 и 37ºС. Обнаружено, что при температуре 30ºС в кислой среде все клетки имели округлую форму; характерно появление липидных включений; размер клеток уменьшался (таблица). Известно, что при критических значениях pH и высокой концентрации NaCl дрожжи отображают сложный набор стресс - ответов, в том числе корректировку свойств поверхности, морфогенеза, роста [27] и регулируемое изменение объема клеток [28]; клетки приобретают более округлую форму [29]. В нейтральных и щелочных условиях культивирования установлена несколько большая толерантность S. cerevisiae DAW-3а к солевому стрессу по сравнению с рН 3.0; отмечались однородность и незначительное уменьшение размеров клеток (рис. 1, б), что также находит подтверждение в литературе [30]. Обнаружено наличие зернистой цитоплазмы, в отдельных клетках - крупные вакуоли; происходит накопление липидов, что, очевидно, дает возможность клетке нейтрализовать повышенное содержание соли в среде культивирования. Кроме того, одновременное воздействие нескольких критических факторов могло привести к перекрестной устойчивости [31] и повышению толерантности дрожжей DAW-3а. В условиях повышенной температуры 37°С, различных значений рН и 5% NaCl существенного изменения размеров клеток по сравнению с вариантом при 30°С не происходит (таблица). Отмечены наличие зернистой цитоплазмы во многих клетках и их однородность (рис. 2, б). Для гигантских колоний DAW-3a в условиях солевого стресса (5% NaCl), различных значений рН и 30°С характерно уменьшение размеров, незначительное изменение цвета, формы, поверхности и структуры. Обнаружена определенная закономерность: дрожжи в вариантах с щелочным и нейтральным рН среды легче переносили солевой стресс. В результате одновременного воздействия температуры 37°С и 5% NaCl при широком диапазоне значений рН обнаружено, что штамм DAW-3a проявил устойчивость к данным экстремальным условиям. Во всех вариантах колоний сохранились форма, поверхность, профиль и структура. Выявлено изменение светло - бежевого цвета на более темный и уменьшение размеров гигантских колоний DAW-3a. Максимальный размер колоний отмечен при pH 11,0, минимальный - при pH 3,0 (рис. 4). ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, обнаружено изменение морфологических параметров клеток и гигантских колоний S. cerevisiae DAW-3а в условиях экстремальных значений температуры, pH и концентрации NaCl. Установлено, что характерной особенностью штамма являлась округлая форма клеток при всех режимах культивирования. Во всех исследованных вариантах минимальные размеры клеток отмечены в кислых средах при pH 3,0. Повышение концентрации NaCl в среде также приводило к уменьшению размера клеток; выявлено наличие зернистой цитоплазмы, липидных включений, в отдельных клетках - крупных вакуолей. Накопление запасных веществ, очевидно, способствует формированию адаптивного ответа клеток дрожжей на повышенное содержание соли в среде культивирования. Для гигантских колоний DAW-3a в условиях солевого стресса характерно уменьшение размеров, незначительное изменение контура, поверхности, цвета, профиля и структуры. При отсутствии соли и 30°С оптимальным для роста гигантских колоний дрожжей являлся рН 4,5, при 37°С - рН 3,0. В результате одновременного воздействия NaCl и температуры при широком диапазоне значений рН выявлена закономерность: дрожжи в вариантах с щелочным и нейтральным рН среды легче переносили солевой стресс. Устойчивость к экстремальным факторам имеет важное значение для исследования адаптивных способностей штамма S. cerevisiae DAW-3a с целью его возможного использования в пищевых биотехнологиях. Таблица. Влияние различных значений рН, температуры и 5% NaCl на размеры (мкм) клеток S. cerevisiae DAW-3a Рис. 1. Влияние рН на морфологические свойства клеток S. cerevisiae DAW-3a при 30°С в отсутствии (а) и присутствии (б) 5% NaCl Рис. 2. Влияние рН на морфологические свойства клеток S. cerevisiae DAW-3a при 37°С в отсутствии (а) и присутствии (б) 5% NaCl Рис. 3. Динамика изменения размеров гигантских колоний дрожжей S. cerevisiae DAW-3а в зависимости от рН и температуры Рис. 4. Морфологические свойства гигантских колоний S. cerevisiae DAW-3а в зависимости от рН при температуре 37°С в отсутствии (а) и присутствии (б) 5% NaCl

About the authors

Elvira Akhmedovna Islammagomedova

Caspian Institute of Biological Resources of Dagestan Scientific Center RAS

Email: islammagomedova@mail.ru
Candidate of Biological Sciences, Senior Researcher of Biochemistry and Biotechnology Laboratory Makhachkala

Eslanda Abdurakhmanovna Khalilova

Caspian Institute of Biological Resources of Dagestan Scientific Center RAS

Email: eslanda61@mail.ru
Candidate of Biological Sciences, Leading Researcher of Biochemistry and Biotechnology Laboratory Makhachkala

Svetlana Tsalistinovna Kotenko

Caspian Institute of Biological Resources of Dagestan Scientific Center RAS

Candidate of Biological Sciences, Leading Researcher of Biochemistry and Biotechnology Laboratory Makhachkala

Rasul Zakirovich Gasanov

Caspian Institute of Biological Resources of Dagestan Scientific Center RAS

Email: gacanov@bk.ru
Minor Researcher of Biochemistry and Biotechnology Laboratory Makhachkala

Aida Alevdinovna Abakarova

Caspian Institute of Biological Resources of Dagestan Scientific Center RAS

Senior Assistant of Biochemistry and Biotechnology Laboratory Makhachkala

Dinara Alievna Aliverdieva

Caspian Institute of Biological Resources of Dagestan Scientific Center RAS

Email: aliverdieva_d@mail.ru
Candidate of Biological Sciences, Deputy Director on Scientific Work, Head of Biochemistry and Biotechnology Laboratory Makhachkala

References

Supplementary files