Приборное и методическое обеспечение определения водои жирорастворимых антиоксидантов

Полный текст

В условиях неблагоприятной окружающей среды, социальных заболеваний в биологических жидкостях организма возрастает концентрация высокореакционных кислородных и азотных соединений в т.ч. и свободных радикалов (супероксид, гидроксильный радикал, перекись водорода и др.). В допустимых концентрациях свободные радикалы необходимы для нормального функционирования иммунной системы человека. Однако их избыточное содержание приводит к окислительному стрессу организма – причине опасных заболеваний (сердечно-сосудистых – 30 % всех заболеваний со смертельным исходом в мире, онкологических, диабета и др.) и преждевременному старению человека. Решить острую современную проблему – разбаланс естественной антиоксидантной системы человеческого организма, можно с помощью специальной терапии природными антиоксидантами и её внедрения в клиническую профилактическую медицину. Для этого требуется: · создание и разработка приборного и методического обеспечения для надёжного и экспрессного определения антиоксидантов; · создание банка данных содержания антиоксидантов в пищевых продуктах, напитках, лекарственных препаратах, биологически активных добавках, поливитаминах, лекарствах; · определение окислительного стресса путём измерения общего антиоксидантного статуса человека. Целью работы является разработка приборного и методического обеспечения для автоматизированного суммарного и покомпонентного определения водо- и жирорастворимых антиоксидантов в пищевых продуктах. В результате сравнительного анализа современных методов (фотометрических, хемилюминесцентных, флуориметрических, электрохимических) и приборов исследования антиоксидантов установлено, что наиболее перспективным и конкурентоспособным является амперометрический метод (АМ). В качестве базы выбран прибор «ЦветЯуза-01-АА» с амперометрическим детектором для определения водорастворимых антиоксидантов. Принцип его действия основан на реализации проточно-инжекционного анализа. Основные характеристики прибора: уровень флуктуационных шумов нулевого сигнала DХ < 0,5 нА; предел детектирования по галловой кислоте (концентрация С = 1 мг/дм3) – Сmin = 1·10–8 г/см3; «мягкие» требования по метрологии случайной составляющей погрешности: 80 % погрешности приходится на пробоподготовку, 10 % – на отбор пробы и химические реактивы, 10 % – на погрешность прибора. Амперометрический детектор измеряет электрический ток в ячейке (рисунок 1) при окислении анализируемого вещества на поверхности рабочего электрода с наложенным потенциалом определённого значения. а б Рисунок 1 – Амперометрическая ячейка: а – схема ячейки с электродами типа «отражающая стенка»: 1 – рабочий электрод; 2 – вспомогательный электрод; б – внешний вид ячейки Функциональная зависимость выходного сигнала амперометрического детектора от параметров прибора (1) и пробы (2) имеет следующий вид: i = f (CAO, CНК, Ā, Ū, ξ), (1) где: i – ток; CAO – концентрация антиоксидантов; CНК – концентрация неопределяемых компонентов анализируемой пробы; Ā – параметры анализируемой пробы; Ū – конструктивные параметры ячейки и гидравлической системы прибора; ξ – шумы; , (2) где: n – число электронов, участвующих в окислении моля вещества; F – константа Фарадея; S – площадь рабочего электрода; D – коэффициент диффузии пробы в элюенте; µ – вязкость пробы; q – конструктивный параметр электрода; – скорость электрохимической реакции. Исходя из (1) исследовано влияние параметров амперометрической ячейки Ū (потенциал окисления на рисунке 2, природа поверхности электрода, скорость элюента, состав пробы и элюента, импульсный режим работы ячейки) на предел детектирования антиоксидантов. Возможности качественного определения антиоксидантов продемонстрированы на интегральной вольтамперограмме – идентификационном коде вещества (рисунок 2). Видно, что при одном и том же потенциале сигнал на разные фенольные кислоты разный. Если взять отношение сигналов при разных потенциалах, то они характеризуют природу вещества. Гидравлическая схема прибора «ЦветЯуза-01-АА» дополнена разработанным устройством для улавливания растворённых в элюенте пузырьков воздуха, отрицательно влияющих на величину предельного тока за счёт увеличения случайной составляющей погрешности анализа с 5 до 15 – 30 %. Устройство включено в техническую документацию и теперь поставляется в составе прибора «ЦветЯуза-01-АА» (рисунок 3). Рисунок 2 – Интегральная вольтамперограмма фенольных кислот а б Рисунок 3 – Устройство для улавливания пузырьков воздуха: а – конструкция: 1 – корпус, 2 – штуцер, 3 – заглушка, 4 – регулировочный винт; б – результаты измерений от 0 до 50 секунд без использования «ловушки», с 75 до 95 секунд с её применением Прибор «ЦветЯуза-01-АА» был адаптирован для определения содержания моносахаров, полисахаридов и лигнина в процессе производства биотоплива из соломы. Определение сахаров проведено при работе амперометрического детектора в импульсном режиме, при этом выбраны детектирующий потенциал золотого электрода 0,15 В, потенциал очистки поверхности электрода 0,8 В, потенциал восстановления – 0,8 В, элюент 5 мМ NaOH, в качестве стандартного вещества – лактоза (рисунок 4). Определение лигнина проведено по методике определения водорастворимых антиоксидантов. Рисунок 4 – Градуировочный график лактозы Выбор стабильных условий работы прибора «ЦветЯуза-01-АА» с амперометрическим детектором позволил решить задачу определения антиоксидантного статуса человека по сыворотке крови, на примере больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Далее рассмотрено определение жирорастворимых антиоксидантов, которые отличаются от водорастворимых физико-химическими свойствами (вязкостью, структурой) и воздействием на клетки человеческого организма. Исходя из функциональной зависимости (1) меняются условия определения жирорастворимых антиоксидантов (новый класс соединений с точки зрения пробоподготовки Ā и модернизированная под анализ жирорастворимых антиоксидантов гидравлическая система прибора Ū «ЦветЯуза-01-АА»). Были внедрены следующие инженерные решения: заменён перистальтический насос на плунжерный, установлен новый шестиходовой кран-дозатор, заменены силиконовые коммуникации на полиэфирэфиркетонновые капилляры. Метрологическое обеспечение для модернизированного прибора «ЦветЯуза-01-АА» потребовало разработки методики определения жирорастворимых антиоксидантов, которая заключается в обоснованном выборе стандартного вещества (сильного антиоксиданта), растворителя пробы и элюента. Учитывая условия выбора стандартного вещества (окисление на поверхности рабочего электрода при заданном потенциале; растворение в тех же органических растворителях, что и жирорастворимые антиоксиданты; доступность; химическая структура вещества – природный антиоксидант), по которому производится градуировка прибора, была выбрана галловая кислота. С её использованием были получены линейные графики с высоким значением чувствительности (отношение изменения аналитического сигнала при изменении концентрации исследуемого вещества) в отличие от других стандартов, например, синтетического ионола (рисунок 5). а б Рисунок 5 – Градуировочный график: а – ионол, б – галловая кислота В результате в качестве элюента и растворителя пробы был выбран подкисленный ортофосфорной кислотой ацетон, с которым получаются наиболее точные и воспроизводимые результаты измерений. Процесс измерения содержания антиоксидантов (рисунок 6) согласно разработанной и аттестованной методике для жирорастворимых проб предусматривает приготовление элюента и стандартного вещества (галловой кислоты); формирование пробы пищевого продукта; построение градуировочного графика и уравнения Y(Х) = aX + b, где X – площадь пика выходной переменной (галловой кислоты), нА·с; Y – концентрация галловой кислоты, мг/дм3; a и b – экспериментальные коэффициенты. Анализ (регистрация и обработка результатов) проходит в режиме реального времени. Правильность и воспроизводимость анализа обеспечивается за счёт точного дозирования шестиходовым краном (СКО дозирования < 0,11 %); СКО последовательных измерений анализируемых проб меньше 5 %, что говорит о малой случайной составляющей погрешности. Рисунок 6 – Алгоритм измерения содержания антиоксидантов ССАгр – величина содержания антиоксидантов, найденная по градуировочному графику, мг/дм3; Vп – объём экстракта анализируемой пробы, см3; mпр – навеска анализируемой пробы, г; N – кратность разбавления пробы По разработанной методике на модернизированном приборе «ЦветЯуза-01-АА» определено суммарное содержание жирорастворимых антиоксидантов в орехах, растительных маслах, шоколаде и какао, впервые – в молочных, рыбных и мясных продуктах. На основе проведённых измерений создан банк данных содержания антиоксидантов в пищевых продуктах, напитках, БАДах, экстрактах лекарственных трав, приведены рекомендации по суточной дозе антиоксидантов. На основании проведённых исследований был разработан макет портативного жидкостного хроматографа (рисунки 7, 8) для суммарного и покомпонентного анализа антиоксидантов на базе прибора «ЦветЯуза-01-АА» с использованием портативного автономного плунжерного насоса на 3,5 МПа и монолитной колонки, сопротивление которой при расходе 1 мл/мин составляет 1,7 МПа. Рисунок 7 – Функциональная схема портативного жидкостного хроматографа Рисунок 8 – Общий вид портативного жидкостного хроматографа На рисунке 9 показаны возможности анализа суммарного и покомпонентного определения веществ-антиоксидантов (галловая кислота, эпикатехин, дигидрокверцетин). а б Рисунок 9 – Хроматограммы: а – разделения соединений – антиоксидантов на монолитной колонке Chromolith SpeeRod 50 – 4,6 мм, элюент: 10 % ацетонитрил, pH 3,3 (1 – галловая кислота, 2 – эпикатехин, 3 – дигидрокверцетин); б – выходные сигналы трёх последовательных анализов раствора галловой кислоты, эпикатехина и дигидрокверцетина (СКО < 3 %) Портативный жидкостный хроматограф реализует методики определения водо- и жирорастворимых антиоксидантов, а также антоцианов. Поскольку одним из критериев подлинности и качества продуктов является, с одной стороны, сумма природных антиоксидантов, а с другой – наличие действующего вещества в продукте (например, для коньяка – это соотношение сиреневого и ванилинового альдегидов, для вина – количество ресвератрола) прибор позволяет выявлять фальсификацию пищевой продукции. Представленная задача легко решается на модернизированном комплексе: экспрессно – определением суммы антиоксидантов, детально – хроматографическим анализом. Выводы В результате проведенных исследований: · выбраны оптимальные условия работы амперометрического детектора (расход, состав элюента и пробы, потенциал и расположение рабочего электрода в ячейке); · гидравлическая схема прибора «ЦветЯуза-01-АА» дополнена разработанным устройством для улавливания растворённых в элюенте пузырьков воздуха, отрицательно влияющих на величину предельного тока; · прибор «ЦветЯуза-01-АА» полностью адаптирован для экспрессного определения содержания моносахаров, полисахаридов и лигнина на основе импульсного режима работы амперометрического детектора для получения качественного промежуточного сырья в технологической линии производства биотоплива из соломы; · расширены возможности применения АМ для решения нового класса задач определения антиоксидантного статуса человека по сыворотке крови, слюне, моче человека; · осуществлена модернизация прибора, определяющего водорастворимые антиоксиданты, для анализа жирорастворимых антиоксидантов, комплекс разрешён к применению во всех медицинских учреждениях Приказом Росздравнадзора № 10169-Пр/09 от 10.12.09, прибор испытан и выпускается серийно; · разработана и аттестована методика определения жирорастворимых антиоксидантов в пищевых продуктах; · на основе прибора для автоматизированного определения водо- и жирорастворимых антиоксидантов «ЦветЯуза-01-АА» и внедрения хроматографического оборудования разработан макет универсального многоцелевого первого отечественного портативного жидкостного хроматографа; · предложен экспресс-метод оценки качества и подлинности алкогольной продукции (вина, коньяка, пива и др.); · впервые измерено суммарное содержание антиоксидантов в мясных, рыбных и молочных продуктах; расширен банк данных содержания антиоксидантов путём добавления разделов: специи и приправы, мясные, рыбные и молочные продукты; изучен вопрос об оптимальном соотношении в ежедневно употребляемых продуктах водо- и жирорастворимых антиоксидантов.

Об авторах

П. А Федина

Университет машиностроения

К. П Латышенко

Университет машиностроения

Email: kplat@mail.ru

Список литературы

Дополнительные файлы