MicroRNA in the diagnosis of chronic heart failure: state of the problem and the results of a pilot study

Full Text

Введение Более 10 лет прошло со времен открытия микроРНК Виктором Амбросом, Розалинд Ли и Рондой Феинбом во ходе исследования гена lin-14 в развитии Caenorhabditis ele- gans [1]. Бурный всплеск интереса к этим молекулам привел к тому, что по последним подсчетам стало известно более чем о 1 тыс. микроРНК, регулирующих около 60% белок-ко- дирующих генов человека (http://www.mirbase.org/). МикроРНК - это класс некодирующих РНК из 19-24 нуклеотидов, которые негативно регулируют экс- прессию генов-мишеней. Из этого следует, что микроРНК участвуют в регуляции многочисленных и самых разно- образных клеточных функций и вовлечены в развитие многих заболеваний. Действие микроРНК опосредовано их неполной гибри- дизацией с 3’-нетранслируемой областью целевой мат- ричной РНК (мРНК), имеющей комплементарные сайты. При взаимодействии микроРНК и целевой мРНК основ- ную роль играют 2-7 нуклеотидов, локализованных на 5’-конце микроРНК, названных Lewis «зерном микроРНК» [2]. В отличие от других известных эпигене- тических механизмов регуляции биологических процес- сов, таких как метилирование ДНК, гистоновая модифи- кация, АТФ-зависимое ремоделирование хроматина и др., микроРНК контролируют экспрессию генов на посттран- скрипционном уровне. Приблизительно половина мик- роРНК-кодирующих генов представлена независимыми транскрипционными единицами, в то время как другая половина локализуется в интронах белок-кодирующих генов. Некоторые гены микроРНК формируют кластеры, с которых происходит транскрипция более чем одной микроРНК (полицистронные микроРНК). Большинство микроРНК транскрибируется с помощью РНК-полимеразы II с последующим полиаденилированием первичного транскрипта, подобным таковому у мРНК (при-мик- роРНК). Длина при-микроРНК составляет несколько ты- сяч пар нуклеотидов. На первом этапе процессинга РНК- нуклеаза (РНКаза III), названная Drosha, совместно с дру- гими факторами рестрицирует при-микроРНК на более короткие фрагменты, длина которых составляет прибли- зительно 70 пар нуклеотидов. Полученные шпилькообо- разные фрагменты являются предшественниками мик- роРНК (пре-микроРНК). При помощи экспортина-5 шпилькообразная пре-микроРНК экспортируется в цито- плазму, где c участием РНКазы III, названной Dicer, про- исходит расщепление пре-микроРНК на короткие (18-24 п.н.) фрагменты. В результате образуются двуце- почечные РНК - дуплексы. В дальнейшем одна из цепей (ведущая цепь) инкорпорируется в ферментативный комплекс RISC (RNA-Induced Silencing Complex), в то вре- мя как другая подвергается деградации. Каждая микроРНК контролирует несколько сотен генов, при этом один и тот же ген может являться мишенью для нескольких мик- роРНК. Такая многофакторность воздействия значитель- но осложняет изучение механизма действия каждой мик- роРНК в отдельности и понимание взаимоотношений в сложных системах микроРНК-ген, микроРНК-мРНК. Учитывая остающиеся невыясненные механизмы влия- ния всего класса некодирующих РНК, к которым относят- ся микроРНК, по-прежнему справедливо закрепившееся за ними название «темной материи биологии» [3]. Однако сегодня уже совершенно очевидно, что они играют кри- тическую роль в регуляции множества биологических процессов, таких как контроль экспрессии генов, диффе- ренциации, пролиферации и апоптоз клеток как при нормальном развитии организма, так и при патологии. Это объясняет неуклонно растущий интерес и все боль- шее число исследований, посвященных изучению мик- роРНК. Первыми, кто обнаружил микроРНК в биологических жидкостях, были S.Chim и соавт., которые выявили пла- центарные микроРНК в крови беременных женщин в концентрациях, легко поддающихся детекции [4]. В 2008 г. X.Chen и соавт. подтвердили присутствие мик- роРНК, устойчивых к нуклеазам, в крови и продемон- стрировали, что их уровни воспроизводимы и одинако- вы среди здоровых индивидуумов [5]. Определение уровней внеклеточных микроРНК не ограничилось об- разцами крови. Серии работ посвящены обнаружению микроРНК во всех жидкостях человека, включая слюну, мочу, грудное молоко, слезную и семенную жидкость, бронхиальный лаваж, цереброспинальную жидкость, перитонеальный и плевральный выпот, в которых и об- щая концентрация микроРНК, и их соотношение значи- тельно варьируют, вероятно, в зависимости от особен- ностей патологического или физиологического статуса организма [6]. Обладая большинством свойств идеаль- ных биомаркеров, включая устойчивость к ненуклеазам, уникальную последовательность нуклеотидов, ткане- специфичность, малоинвазивность и общедоступность получения проб, относительную стабильность при ком- натной температуре и неоднократных циклах замора- живаний/размораживаний образцов крови, микроРНК заслуженно рассматриваются в качестве перспективных биомаркеров. Однако до настоящего времени единое мнение о происхождении и биологических функциях внеклеточных микроРНК не сформировано. Это может быть связано с тем, что формы внеклеточного суще- ствования микроРНК негомогенны и отличаются спосо- бом «упаковки» [7]. Требуется больше информации о ме- ханизмах и причинах высвобождения микроРНК из клеток, в раскрытии которой помогут, прежде всего, анализ корреляций циркулирующих и тканевых кон- центраций микроРНК. Сердце взрослого человека - это орган, способный к значительному ремоделированию под воздействием па- тологических факторов. Гемодинамический стресс или нейроэндокринные влияния, как одни из основных фак- торов неблагоприятного воздействия, вызывают патоло- гический ответ сердца в виде ремоделирования за счет активации внутриклеточных сигнальных путей и медиа- торов транскрипции в кардиомиоцитах. Активация по- добных молекулярных механизмов может приводить к увеличению размеров кардиомиоцитов, изменению син- теза белков и реэкспрессии фетальных генов. С одной стороны, подобное ремоделирование миокарда в ответ на остро возникший или хронический стресс направлено на адаптацию сердца к патологическим условиям и может на определенное время поддерживать его адекватную ра- боту, обеспечивая достаточное кровоснабжение организ- ма. С другой стороны, продолжительность патологиче- ского воздействия или чрезмерная выраженность адап- тивных процессов, не всегда скооперированных, не- избежно влечет за собой развитие сердечной недостаточ- ности (СН). Каждый из процессов, запускаемых в клетке под воздействием патологических факторов, невозможен без участия микроРНК. Обнаружение специфичных для конкретных нозологий микроРНК и создание эффектив- ных и безопасных методов влияния на них открывает но- вые горизонты в диагностике и лечении сердечно-сосу- дистых заболеваний. МикроРНК-423 На сегодняшний день установлено, что микроРНК свя- заны с ремоделированием миокарда пациентов с СН и что специфические микроРНК могут экскретироваться из клеток сердца в кровь. По результатам многих работ некоторые микроРНК признаны достаточно чувствитель- ными и специфичными биомаркерами инфаркта миокарда. Немало выполнено исследований, оценивавших прогностическую силу определенных микроРНК и при других разных повреждениях и патологических состоя- ниях. Определение биомаркеров СН, например BNP, поз- воляет не только правильно и быстро установить диагноз, но и способствует успешному ведению пациентов. Тем не менее поиск новых маркеров, обладающих большей чув- ствительностью и специфичностью, продолжается. А.Tij- sen и соавт., веря в перспективу использования микроРНК в качестве подобного маркера, одними из первых сравни- ли образцы крови пациентов с декомпенсацией СН и здо- ровых добровольцев [8]. Среди 16 микроРНК, уровень ко- торых достоверно отличался между группами, особое внимание привлекла микроРНК-423-5р, которая оказа- лась серьезным предиктором диагноза СН в множествен- ной логистической регрессионной модели. Уровень мик- роРНК-423-5р специфично повышался в крови пациен- тов с СН в отличие от здоровых добровольцев, а также группы пациентов с некардиальной одышкой. Мик- роРНК-423-5р отличала случаи СН от группы контроля с площадью под кривой (AUC) 0,91 (95% доверительный интервал - ДИ 0,84-0,98). Предсказующая сила мик- роРНК-423-5р оказалась столь же высокой при сравне- нии пациентов с одышкой, вызванной СН и другими при- чинами (AUC 0,83; 95% ДИ 0,71-0,94). Для уровней мик- роРНК-423-5р была обнаружена прямая взаимосвязь с NT-proBNP, фракцией выброса левого желудочка (ФВ ЛЖ) и классом СН по New York Heart Assosiation (NYHA). Экспрессия микроРНК-423-5р непосредственно в самом миокарде пациентов с СН оказалась в 3 раза выше по сравнению со здоровыми сердцами, исходя из чего ав- торы предположили, что локальная гиперэкспрессия микроРНК-423-5р в миокарде пораженного сердца и есть причина ее повышенного уровня в крови. Впрочем, сами исследователи сомневаются в справедливости этого предположения, так как некоторые другие микроРНК, для которых ранее была доказана гиперэкспрессия в миокар- де, в данном исследовании обнаружены не были. Рассмат- ривая недостатки этой работы, нельзя не указать на ма- лый объем выборки и некорректность использования ROC-анализа в качестве статистического метода, а также на существенную возрастную разницу групп. Тем не ме- нее, схожие результаты были воспроизведены через 2 го- да Y.Goren и соавт. при стабильном течении хронической СН (ХСН) [9]. Хотя им не удалось выявить статистически значимой связи между отдельно взятой микроРНК-423- 5р и BNP, но для панели микроРНК (суммы 4 микроРНК: микроРНК-423-5р, -320а, -22, 92b) была обнаружена даже более сильная корреляция с BNP (R=0,63 против 0,43 у А.Tijsen). Кроме того, уровень микроРНК-423-5р также сильно коррелировал с такими прогностически важными факторами СН, как ширина комплекса QRS, конечно-диа- столический размер ЛЖ и левого предсердия. Исследова- ние Y.Goren и соавт. положительно отличается большим объемом выборки и соответствием групп по возрасту, по- лу и национальности. Возможность отдельных микроРНК регулировать сердечный фенотип позволяет предположить, что регу- лируемая экспрессия микроРНК есть скорее причина, нежели следствие ремоделирования сердца. Однако большая предсказующая сила панели микроРНК, как продемонстрировали Y.Goren и соавт., при том или ином фенотипе, в данном случае стабильной СН, отра- жает комбинированное содружественное действие не- скольких микроРНК, а не эффективность лишь одной микроРНК. В последующих исследованиях были получены анало- гичные результаты, не только в целом для пациентов с си- столической СН, но и при конкретной нозологии - дила- тационной кардиомиопатии (ДКМП) [10]. При этом сле- дует отметить, что степень повышения микроРНК-423-5р у пациентов с ДКМП оказалась не столь высока, а диагно- стическая ценность заметно меньше, чем в более ранних исследованиях, в которых в основном рассматривались пациенты с ишемической кардиопатией. О влиянии этио- логии ХСН на уровень микроРНК упоминалось также в исследовании О.Tutarel и соавт. [11]. Согласно их результа- там уровни микроРНК-423-5р оставались неизменными, несмотря на сниженную ФВ системного правого желу- дочка (ПЖ). Возможным объяснением могут служить су- щественные патофизиологические отличия право- и ле- вожелудочковой недостаточности. Даже на анатомиче- ском уровне преимущественно продольная ориентация кардиомиоцитов ПЖ отличается от циркулярной в ЛЖ. Кроме того, играют роль геометрия системного ПЖ, ме- нее приспособленная к постоянно высокой постнагруз- ке, ишемия миокарда, частично обусловленная аномаль- ными коронарными артериями, а также возможные арит- мии. Соответственно для большинства пациентов с си- стемным ПЖ характерна минимальная активация ренин- ангиотензин-альдостероновой системы - ключевого зве- на в патогенезе левожелудочковой СН. Достоверно до настоящего времени не изучены не только причины повышения микроРНК-423 в крови, но и ее конкретная роль в развитии СН. Более того, в неко- торых исследованиях отрицается значимое ее участие в ремоделировании миокарда. Так, C.Bauters и соавт., сравнивая уровни микроРНК-133а и 423-5р в крови па- циентов в разные сроки после инфаркта миокарда, полу- чили неожиданные результаты, не выявив их потенциал в оценке степени ремоделирования ЛЖ [12]. Одновре- менно с этим динамика изменения высокочувствитель- ного тропонина, креатинфосфокиназы и NT-proBNP со- ответствовала и коррелировала с выраженностью ремо- делирования миокарда, в отличие от уровней микроРНК. Пытаясь объяснить подобное несоответствие, авторы выдвигают гипотезу возможного вклада полноценной медикаментозной терапии. Предыдущие исследования в основном сравнивали уровни микроРНК у пациентов с СН и контрольной группы. Исследование C.Bauters и со- авт. отличается тем, что все пациенты в обеих группах получали максимальную терапию антиагрегантами, ста- тином, ингибиторами ангиотензинпревращающего фермента и -адреноблокатором. На сегодняшний день в литературе отсутствуют данные о характере измене- ния экспрессии микроРНК в зависимости от той или иной терапии, что затрудняет правильную трактовку по- добных результатов. МикроРНК-21 Известно, что микроРНК-21 высоко экспрессируется во всех клетках сердечно-сосудистой системы, включая гладкомышечные клетки [13], эндотелиальные клетки [14], кардиомиоциты [15], сердечные фибробласты [16]. К известным на сегодняшний день генам-мишеням мик- роРНК-21 относятся SPRY1, SFRS8, PPARA, TIMP3, NFIB, SPRY2, PDCD4, ARID1A, Bcl-2. Среди них гены PDCD4, PTEN, spry1 и spry2 ассоциированы с сердечно-сосуди- стыми заболеваниями. МикроРНК принимают участие в развитии сердца с первых месяцев жизни организма. Полагают, что она контролирует развитие клапанов сердца [17]. Экспрессия микроРНК-21 быстро меняется в зависимости от кровотока. Вазоконстрикция и возрас- тающее касательное напряжение приводят к ее эктопи- ческой экспрессии в магистральных сосудах и сердце. Потокзависимая экспрессия микроРНК-21, исследован- ная у рыб, определяет формирование клапанов путем изменения экспрессии тех же генов-мишеней, что и для мышиной/человеческой микроРНК-21 (sprouty, pdcd4, ptenb) и индуцирует пролиферацию клеток эндокарда в местах констрикции сердечной трубки - там, где каса- тельное напряжение наиболее выражено. Несмотря на важные открытия, связанные с этой микроРНК, остается множество вопросов, в том числе неопределенность преимущественной локализации микроРНК-21. Т.Thum и соавт. утверждают, что уровни микроРНК-21 в кардиомиоцитах не максимальны [18], однако другие авторы настаивают на преимущественной ее активности имен- но в кардиомиоцитах [15, 19]. Одной из возможных при- чин столь противоположных взглядов может служить возрастная разница изучавшихся клеток. Известно, что экспрессия микроРНК-21 зависит от этапа развития клетки. Наибольший уровень экспрессии отмечен в кар- диомиоцитах новорожденных крыс по сравнению со зрелыми клетками [18]. От типа клетки зависит и спектр генов-мишеней. Так Sry1 - является мишенью мик- роРНК-21 в сердечных фибробластах [18], но не в кар- диомиоцитах [20]. МикроРНК-21 играет важную роль не только в процес- сах нормальной физиологии сердца. Уровни ее экспрес- сии отличаются при многих сердечно-сосудистых забо- леваниях, в частности при СН. Согласно данным литера- туры в профилях микроРНК, так или иначе заинтересо- ванных в СН, часто встречается микроРНК-21 [21, 22]. Т.Thum и соавт., пытаясь прояснить конкретные меха- низмы участия микроРНК-21 в развитии СН, обнаружи- ли, что 87% гиперэкспрессированных микроРНК и 84% подавленных микроРНК аналогичны профилям мик- роРНК фетальных тканей сердца (включая микроРНК-21), что дает основание предполагать о запуске программы активации фетальных генов - отличительной пато- физиологической черты при гипертрофии и СН, при- водящей к ремоделированию ЛЖ. T.Thum и соавт. уда- лось подтвердить эту концепцию, продемонстрировав активацию программы фетальных генов и изменения, подобные таковым при СН, при одновременной реэкспрессии трех микроРНК (микроРНК-21, -129, -212) [23]. Отмечено, что среди фетальных генов, регули- руемых микроРНК, замечены гены ANP, BNP, B-MHC, - актина и MEF2a. Это исследование пролило свет на важ- ные аспекты реактивации фетальных генов в ходе СН и выявило возможных молекулярных участников патоло- гического ремоделирования ЛЖ, послужив толчком к дальнейшим многочисленным исследованиям мик- роРНК-21 в моделях стрессовых условий для миокарда. Например, D.Sayed и соавт. определяли уровни экспрес- сии микроРНК в разные временные отрезки при гипер- трофии миокарда вследствие констрикции аорты [24]. В результатах среди прочих привлекла внимание мик- роРНК-21, уровень которой постепенно повышался, на- чиная с 2-кратного увеличения на 7-й день и вплоть до 8-кратного к 14-му дню. Ранее, опираясь на исследова- ния онкологических заболеваний, была установлена ан- тиапоптотическая роль микроРНК-21. Применительно к сердечным заболеваниям эта роль имеет не меньшее значение. Избыточная постнагрузка, являясь состоянием стресса для сердца, индуцирует ту или иную степень апоптоза, которая, согласно данным D.Sayed и соавт., коррелирует с объемом и продолжительностью задан- ной нагрузки. На ранних стадиях сердце преодолевает это бремя за счет компенсаторных механизмов, вклю- чающих гипертрофию и активацию антиапоптотиче- ских путей. Благодаря способности микроРНК-21 регу- лировать множество проапоптотических генов, можно ожидать, что ее гиперэкспрессия в сердце открывает об- ширные антиапоптотические каналы. Процессы ремоделирования при СН не ограничены контрактильными клетками сердца. Кардиомиоциты составляют не более 40% всего клеточного состава здо- рового сердца, в то время как большую половину зани- мают эндотелиоциты и сердечные фибробласты, при- чем доля последних составляет 90% от всех немиоцитов сердца. В условиях стресса фибробласты под воздей- ствием широкого спектра стимулов (например, трансформирующий фактор роста - ТФР-) дифференцируются в активные миофибробласты, которые регули- руют секрецию компонентов внеклеточного матрикса и разрушающих их ферментов (матриксных металлопро- теиназ), а также склонны к пролиферации и миграции, что в совокупности способствует ремоделированию ин- терстиция сердца. Этот процесс может завершиться сердечным фиброзом, важным патологическим процес- сом при гипертрофии и СН, который проявляется ано- мальной пролиферацией сердечных фибробластов и избыточным накоплением белков экстрацеллюлярного матрикса в интерстиции и периваскулярном простран- стве миокарда, что в конечном счете нарушает сердеч- ную функцию. Ряд исследований указывает на измене- ние профилей экспрессии микроРНК при СН не только в кардиомиоцитах, но и сердечных фибробластах, что приводит к развитию фиброза. В частности в исследова- нии T.Thum и соавт. было показано, что микроРНК-21 главным образом проявляет активность в фибробластах миокарда пациентов с СН [18]. Было установлено, что повышенная активность микроРНК-21 в ответ на стресс усиливает ERK-MAP-киназный сигнальный путь, приво- дя к пролиферации фибробластов и фиброзу. Подавле- ние микроРНК-21 антагомиром в мышиной модели ги- пертрофии и СН привело к снижению активности ERK- MAP-киназы, ингибировало интерстициальный фиброз и ослабило дисфункцию миокарда. Примечательно, что ингибирование микроРНК-21 не только препятствует развитию гипертрофии, но даже способно иницииро- вать обратное ремоделирование миокарда. Сходные эф- фекты микроРНК-21 по отношению к фиброзу были об- наружены S.Roy и соавт. в модели ишемии-реперфузии, причем ингибирование микроРНК-21 также приводило к уменьшению фиброза миокарда [16]. МикроРНК-21 участвует в межклеточной коммуника- ционной системе миокарда, описанной в детальной ра- боте C.Bang и соавт. [25]. Их результаты подтверждают более ранние наблюдения о микроРНК-содержащих эк- зосомсвязанных ответах в других клеточных популя- циях и микроРНК-опосредованное межклеточное «об- щение» в ткани сердца. В частности было выявлено, что микроРНК-21, которая обычно подвергается деградации в цитоплазме, специфичным образом упаковывается и переносится в экзосомах от сердечных фибробластов к кардиомиоцитам, в которых запускает гипертрофиче- ский ответ. Обращает на себя внимание, что, согласно результатам C.Bang, эти экзосомы селективно обогаще- ны микроРНК-21, а поглощение экзосом кардиомиоци- тами зависит от температуры и актина. Доставленные экзосомами микроРНК-21, оказавшись в кардиомиоци- те, запускают процессы, влекущие к значительному уве- личению размера кардиомиоцитов. Не остановившись на найденном, C.Bang и соавт. выполнили протеомное профилирование, по результатам которого установили мишени микроРНК-21: саркоплазматический белок сор- бин и SH3-доменсодержащий белок 2 (SORBS2), а также PDZ и LIM домен 5 (PDLIM5). SORBS2 локализуется в области Z-дисков, где влияет на сократительную и эла- стические свойства саркомеров. Интересно, что высво- бождение SORBS2 в кровоток из поврежденной сердеч- ной ткани недавно было описано при фатальном ин- фаркте миокарда [25]. PDLIM5, как и SORBS2, колокализу- ется в области Z-дисков и непосредственно связан с раз- витием ДКМП. В совокупности эти данные поднимают вопрос о роли микроРНК-21 в развитии СН в моделях с повреждением Z-дисков, в первую очередь, при ДКМП [26]. Помимо этого, C.Bang и соавт. удалось обнаружить микроРНК-21 в перикардиальной жидкости мышей с ги- пертрофией миокарда, вызванной констрикцией аорты, что in vivo подтвердило важную роль микроРНК-21 в ре- гуляции секретома сердечных фибробластов и пред- определении гипертрофического ответа. МикроРНК-21 участвует также в вирусном воспалении миокарда. При этом наибольший интерес представляет вирус Коксаки В3, который является одной из основных причин воспаления и повреждения миокарда, приводя- щих к 20% внезапной сердечной смертности среди моло- дых людей и подростков. X.Ye и соавт. в результате методичного исследования изменений микроРНК-21 при ин- фекции вируса Коксаки продемонстрировали, что гипер- экспрессия микроРНК-21 снижает уровни компонентов межклеточных соединений как путем деградации белков, так и путем прямого подавления их синтеза [27]. Мик- роРНК-21, опосредованная дезорганизация десмосом и fascia adherens, по-видимому, одно из звеньев патогенеза вирусного миокардита. Ингибирование микроРНК-21 может уменьшить повреждение миокарда, вызванное ви- русом Коксаки В3. Определенное место микроРНК-21 занимает и в арит- мологии, а именно при фибрилляции предсердий (ФП). Не углубляясь в детали участия микроРНК-21 в ФП, ко- торые по-прежнему еще весьма призрачны, следует за- метить, что одним из ключевых процессов вновь высту- пает фиброз, в данном случае - фиброз миокарда пред- сердий. Опубликованные в 2012 г. результаты исследо- вания S.Cardin и соавт. указывают на то, что уровень микроРНК-21 повышается в предсердиях при ишемиче- ской СН, а подавление гиперэкспрессии микроРНК-21 предупреждает развитие фиброза предсердий и ФП [28]. Чтобы избежать косвенного протективного влияния после системного введения антимикроРНК, авторы предпочли использовать инъекцию непосредственно в ткань предсердия. Обращает на себя внимание и то, что, несмотря на дилатацию ЛП, антимикроРНК-21 удалось подавить развитие ФП. Позитивная взаимосвязь уровня микроРНК-21 и степени фиброза правого предсердия при ФП также была продемонстрирована H.Nishi и со- авт., при этом экспрессия микроРНК-21 была наиболь- шей в группе пациентов с постоянной ФП или с неудач- ной операцией «лабиринт», снижаясь в группе с успеш- ным оперативным лечением ФП и достигая минимума в группе с исходным синусовым ритмом [29]. Возмож- ность предопределения степени фиброза по уровню микроРНК-21 в крови может дать дополнительную ин- формацию хирургам для выбора показаний к оператив- ному лечению ФП. МикроРНК-34а МикроРНК-34а - важный регулятор клеточного цикла и апоптоза. Будучи элементом SIRT1-p53 сигнального пути, ассоциированного с механизмами онкогенеза [30], стала предметом изучения в многочисленных ис- следованиях в сфере онкологии. Немало работ посвя- щено проблеме старения и апоптоза кардиомиоцитов. Само по себе старение является фактором риска сердеч- но-сосудистых заболеваний и предрасполагает к значи- тельно худшим исходам у пациентов с острым инфарк- том миокарда. Выдвинув гипотезу о влиянии нарушен- ной экспрессии микроРНК в ходе старения как причи- ны возрастзависимого падения сердечной функции, R.Boon и соавт. установили, что микроРНК-34а участву- ет в процессах старения кардиомиоцитов, что было подтверждено in vivo [31]. Так, «замолкание» или генети- ческая делеция микроРНК-34а снижала возрастопосре- дованную смерть кардиомиоцитов. Следует отметить, что первая доза антагомира вводилась через 3 ч после индуцированного инфаркта миокарда, что заставляет усомниться в сформировавшемся ремоделировании миокарда. Этот недостаток был учтен в серии работ B.Bernardo и соавт. Первоначально они продемонстри- ровали терапевтический успех ингибирования всего се- мейства микроРНК-34 в двух моделях дисфункции и значительного ремоделирования ЛЖ - вызванной ин- фарктом миокарда и констрикцией аорты [32], а в своей следующей работе оценили самостоятельное влияние микроРНК-34а [33]. Оказалось, что ингибирование мик- роРНК-34а при умеренном ремоделировании миокарда сопровождалось повышением экспрессии SIRT1, кото- рый обладает защитными свойствами при старении и стрессе. Однако на модель тяжелой СН этот защитный эффект не распространялся. Таким образом авторы пришли к выводу, что ингибирование микроРНК-34а может быть успешно либо в случае острого кардиально- го стресса, либо при умеренно выраженном патологи- ческом ремоделировании, но не при хроническом или тяжелом поражении миокарда. Y.Huang и соавт. продемонстрировали, что семейство микроРНК-34, а в наибольшей степени микроРНК-34а, играет важную роль в прогрессировании фиброза сердца [34]. Гиперэкспрессия микроРНК-34а сопровожда- лась активацией ТФР-1 в фибробластах сердец, подверг- шихся инфаркту миокарда. Свое влияние микроРНК-34а, по мнению авторов, оказывает через Smad4. Авторы полагают, что микроРНК-34а может быть использована в буду- щем в качестве маркера прогрессирования фиброза. Бо- лее того, положительные результаты ингибирования мик- роРНК-34а in vivo в виде снижения степени фиброза в сердцах мышей дают надежду на успешное применение антагомиров микроРНК-34а в лечении фиброза миокар- да [35]. Авторами также была открыта новая мишень мик- роРНК-34а - PNUTS (также известный как PPP1R10), эф- фект которого заключается в подавлении процесса уко- рочения теломер. Схожие результаты получены еще в трех исследованиях [32, 36, 37]. МикроРНК-208а, -499 Семейство микроРНК-208 (-а, -b, -с) и микроРНК-499 получили название мио-микроРНК за регуляцию синте- за тяжелых цепей - и -миозина [38]. МикроРНК-208 за- кодирована в интроне гена тяжелой цепи -миозина (Myh6), в то время как микроРНК-208b - в интроне гена тяжелой цепи -миозина (Myh7) [38, 39]. Повышенный уровень микроРНК-208а наблюдался при гипертрофии сердца [40] и повреждении миокарда [41]. Так, в ответ на перевязку аорты у мышей отмечалось развитие гипер- трофии и фиброза, сопровождаемых изменением уров- ня микроРНК-208. В случае использования микроРНК- 208-нокаутных мышей гипертрофия кардиомиоцитов и фиброз не были выражены, при этом повышения экс- прессии Мyh7 после перевязки аорты также не наблю- далось. Согласно данным, представленным Т.Callis и со- авт., трансгенной гиперэкспресии микроРНК-208а было достаточно для индукции гипертрофии сердца у мы- шей, что отразилось на подавлении мишеней мик- роРНК-208, а именно тиреоидсвязанного протеина-1, миостатина, двух негативно регулирующих факторов мышечного роста и гипертрофии [40]. Кроме того, под- кожное применение специфичного антагомира у крыс с декомпенсированным гипертоническим сердцем до- зозависимо способствовало обратному ремоделирова- нию миокарда, улучшению сердечной функции и повы- шению выживаемости [42]. В ряде исследований установлено, что повышенная экспрессия микроРНК-499 при гипертрофии сердца или кардиомиопатии способна спровоцировать развитие СН за счет ускорения дезадаптивных процессов в ответ на стресс [43]. Статистически значимое повышение мик- роРНК-499 у пациентов с острой СН и вирусным миокар- дитом было продемонстрировано в исследовании М.Cor- sten и соавт. [43]. Цель исследования Анализ экспрессии микроРНК-21-5р, микроРНК-423- 5р, микроРНК-499-5р, микроРНК-208а-5р, микроРНК-34а у пациентов с СН, развившейся вследствие воспалитель- ной кардиомиопатии (ВКМП) и СН другой этиологии. Материал и методы В работе использованы плазма крови 16 пациентов с СН, у 8 из которых диагностирована ВКМП, а также био- псийный материал 2 пациентов с ВКМП. В качестве конт- роля были исследованы образцы плазмы крови 10 здоро- вых добровольцев. С помощью ПЦР-анализа в режиме ре- ального времени рассчитано количество копий микроРНК-21-5р, микроРНК-423-5р, микроРНК-499а-5р, микроРНК-208а-5р, микроРНК-34а-5р относительно синтетического аналога. Результаты В результате сравнения уровней экспрессии исследуемых микроРНК с группой контроля статистически значимые различия были получены для микроРНК-21-5р и микроРНК- 34а-5р. Так, средний уровень экспрессии микроРНК-21-5р в группе СН составил 2 032 783 копий/мкл против 268 565 ко- пий/мкл в группе контроля. В меньшей степени уровень дан- ной микроРНК повышен в группе пациентов с ВКМП (1 932 978 копий/мкл), и достигает наибольшего своего значения непосредственно в 2 миокардиальных биоптатах пациентов с ВКМП (6 670 504 копий/мкл). Экспрессия микроРНК-34а-5р в образцах крови паци- ентов с СН и ВКМП по сравнению с кровью добровольцев была в 150 и 100 раз выше соответственно, о чем судили по средним значениям экспрессии данной микроРНК. Тенденция к более высоким значениям была отмечена для уровня микроРНК 423-5р в плазме крови у пациентов с ХСН и ВКМП по сравнению с контрольной группой, превосходя в 4 и 10 раз соответственно. По другим микроРНК (микроРНК-499-5р, 208а-5р) ста- тистически значимой разницы между средними уровня- ми экспрессии среди пациентов с СН, ВКМП и здоровыми добровольцами не отмечено. Соотношение микроРНК биоптат/плазма у больных с ВКМП больше 1, за исключением микроРНК-423-5р, для которой это соотношение составило 0,54. Обсуждение В настоящей работе изучались профили микроРНК-21, мироРНК-34а, микроРНК-423, микроРНК-499, мик- роРНК-208а при ХСН. С учетом неопределенных к на- стоящему времени нормальных их уровней, сравнение проводилось с контрольной группой здоровых добро- вольцев. Все нарастающий интерес к вопросу значимости фено- мена РНК-интерференции в развитии кардиальной пато- логии, а также данные литературы позволили нам рас- сматривать микроРН-21, -34а, -423, -208а и -499 как наи- более перспективные в развитии СН. Результаты многочисленных исследований, изучаю- щих роль данных микроРНК, весьма противоречивы, а сравнение подобных исследований не всегда право- мочно. В каждом конкретном случае необходимо учи- тывать целый ряд факторов, влияющих на конечный результат исследования. Нельзя не принимать в расчет преаналитические вариации, связанные с различиями в сборе и подготовке образцов, их хранении, степени ге- молиза и эффективности экстракции. Сегодня по- прежнему нет единого мнения о предпочтительном ис- пользовании плазмы или цельной крови в качестве биоматериала. Известно, что в своей работе Wong и со- авт. выполнили микроРНК-профилирование как в цель- ной крови, так и плазме, однако в заключительном от- чете не представили сравнение двух методов и не указа- ли, какой тип образцов более подходит для обнаруже- ния и количественного определения микроРНК. В на- шей работе мы предпочли использовать плазму с целью минимизации искажения результатов за счет присут- ствия всех фракций крови. Исследования могут отли- чаться и методом обнаружения микроРНК. Наиболее часто используются полимеразная цепная реакция (ПЦР) и анализ микрочипов. Последний обладает пре- имуществами в обнаружении большого числа мик- роРНК одновременно. В то же время количественная ПЦР является золотым стандартом для определения микроРНК и проверки предварительных данных, полу- ченных методом микрочипов. Ввиду низких значений некоторых микроРНК в плазме крови крайне важным представляется аккуратная нормализация полученных уровней микроРНК. При этом следует помнить, что да- же небольшого количества микроРНК (нескольких мо- лекул на клетку) достаточно для полного «выключения» целевого гена, что указывает на существование каскад- ного механизма катализа и/или амплификации. МикроРНК-423 - одна из наиболее излюбленных мик- роРНК при СН. Благодаря работе А.Tijsen и соавт., а впо- следствии и исследованию Y.Goren и соавт., ей стали про- чить место наравне с BNP за счет ее способности диффе- ренцировать пациентов с одышкой кардиального и не- кардиального генеза, а также коррелировать с важными прогностическими факторами СН. Полученные нами ре- зультаты выявили лишь тенденцию к повышению уровня микроРНК-423 у пациентов с СН и ВКМП в сравнении с группой контроля. Возможно, это связано с воспалитель- ным генезом кардиопатии. Подобное расхождение ре- зультатов наблюдали и K.Fan и соавт. при изучении мик- роРН-423 у пациентов с ДКМП. Одно из главных отличий нашего исследования от работы K.Fan заключается в ра- совом отличии пациентов, а именно европеоидов и мон- голоидов. Разумеется, это не дает основания утверждать об отсутствии вариабельности микроРНК среди предста- вителей разных рас и/или национальностей, однако поз- воляет сконцентрироваться в первую очередь на вопросе генеза СН как основного фактора, определяющего про- фили микроРНК. Неожиданными для нас оказались данные тканевых уровней микроРНК-423. Она оказалась единственной, для которой соотношение биоптат/плазма составило мень- ше 1, что противоречит логике повышения уровней мик- роРНК вследствие избыточной их экспрессии в той или иной ткани, но не отрицает ее, так как возможным объ- яснением может служить апрегуляция микроРНК не толь- ко в кардиомиоцитах, но и в эндотелиоцитах кровенос- ных сосудов, создающая дополнительный источник плаз- менного пула микроРНК. Принимая во внимание неотде- лимость эндотелиальной дисфункции и синдрома СН, вклад этого альтернативного источника микроРНК может оказаться существенным. МикроРНК-21 - широко изученная микроРНК, пред- ставляющая интерес во многих сферах биологии меди- цины, таких как развитие организма, онкология, воспа- ление и сердечно-сосудистые заболевания. Несмотря на неоднозначные выводы множества исследований, по- священных ее роли при СН, ишемической болезни серд- ца, гипертрофии миокарда и аритмиях, неизменным остается положение о ее способности регулировать ак- тивность фибробластов. Как известно, изменение тка- невого баланса в миокарде в сторону увеличения доли компонентов внеклеточного матрикса характерно для СН, вызванной любыми патологическими факторами - механическими, нейрогуморальными или цитокиновы- ми. В нашей работе уровень экспрессии микроРНК-21 значимо отличался от группы контроля. С учетом ис- пользования гомогенизата ткани сердца мы не можем судить о точном происхождении микроРНК-21, кардио- миоцитарном или фибробластном, тем не менее, полу- ченные результаты согласуются с данными большин- ства исследований и также объясняются чрезмерным кардиальным фиброзом. Важная роль в фиброзе, а также апоптозе отводится микроРНК-34. Дебаты относительно весомости отдель- но взятого представителя этого семейства (микроРНК- 34а) при СН продолжаются. При опоре на имеющиеся данные литературы создается впечатление о большей информативности при анализе уровней семейства в це- лом. Тем не менее важно убедительно очертить потен- циал микроРНК-34а, поскольку в будущем идея мик- роРНК-ассоциированного лечения столкнется с труд- ностями, обусловленными многочисленностью мише- ней микроРНК, и как следствие, потенциальными по- бочными эффектами. Так как семейство микроРНК-34 регулирует на 31-55% больше генов-мишеней, чем отдельно взятая микроРНК-34а, вмешательства, модули- рующие все семейство, заведомо сопряжены с большим числом неожиданных последствий. В связи с этим тера- певтическая состоятельность воздействия исключи- тельно на одного представителя семейства позволит минимизировать нежелательные осложнения. Результа- ты нашей работы подтверждают значимое отклонение экспрессии микроРНК-34а при СН вследствие ВКМП, что, по-видимому, предопределяет чрезмерную готов- ность кардиомиоцитов к активации программы апопто- за и усугубляет ремоделирование миокарда. МикроРНК-208а и микроРНК-499, являясь кардиоспе- цифичными, закономерно привлекают внимание иссле- дователей в области острого повреждения миокарда. Вместе с тем обнаруженная связь микроРНК-208 не толь- ко с тропонином плазмы при остром инфаркте миокарда, но и с ФВ ЛЖ [44], а также связь микроРНК-208 и мик- роРНК-499 с риском смерти, в том числе от СН, после пе- ренесенного инфаркта миокарда [45], послужили основа- нием рассматривать повреждение миокарда как состав- ляющую СН, прежде всего ее тяжелых стадий. Однако со- гласно нашим результатам закономерностей в уровнях экспрессии микроРНК-499 или микроРНК-208а в сравне- нии с кровью здоровых доноров выявлено не было. По- видимому, потенциал дальнейшего изучения этих мик- роРНК сосредоточен в рамках острого повреждения мио- карда, когда сразу после гибели кардиомиоцитов про- исходит их выход в общий кровоток в значительных кон- центрациях. Это определяет их перспективность в каче- стве маркеров острого инфаркта миокарда. Одновремен- но с этим существует противоположное мнение о непри- годности микроРНК-208а в качестве биомаркера ввиду подозрений на ее короткий период полужизни. Именно этим О.Gidlöf и соавт. объясняют нерезультативность определения микроРНК-208а в крови пациентов через 12 ч и более после инфаркта миокарда [44] в противовес исследованию G.Wang и соавт., в котором образцы крови были взяты через 4 ч [46]. Однако надо понимать, что фак- тор времени - не единственная возможная причина раз- личий уровней микроРНК. В представленных исследова- ниях не учтено присутствие гепарина в образцах крови, как известно, затрудняющего детекцию микроРНК. Надо полагать, что вероятность применения гепарина уве- личивается со временем, прошедшим от диагностики ин- фаркта миокарда, что может быть истинной причиной неуспеха О.Gidlöf и соавт. в обнаружении микроРНК-208а. Таким образом, данный вопрос остается открытым и тре- бует детального исследования. Заключение Частое несоответствие, а порой и противоречивые ре- зультаты исследований обусловлены сложностями опре- деления функциональной причастности определенной микроРНК в развитии того или иного процесса из-за ее воздействия одновременно на несколько генов-мише- ней. До момента установления точных взаимосвязей ге- нов и микроРНК их применение в диагностических це- лях будет ограничено. Большие надежды связаны с соз- данием новых методов лечения на основе микроРНК. Однако прежде чем эти перспективные методы лечения могут быть успешно и безопасно применены у пациен- тов, необходимо преодолеть ряд ограничений, суще- ствующих сегодня. Во-первых, модуляция микроРНК, имеющей широкий спектр мишеней, с высокой долей вероятности может повлиять на другие, иногда не- известные мРНК, приведя к непредвиденным побочным эффектам и патологическим последствиям. Во-вторых, терапевтические подходы с использованием микроРНК должны быть улучшены в плане фармакокинетики, био- распределения и тканевого проникновения для дости- жения целевой тканеспецифичности. Таким образом, диагностический и терапевтический потенциал каждой микроРНК еще предстоит изучить.

About the authors

I V Zhirov

A.L.Myasnikov Institute of Clinical Cardiology, Russian Cardiological Scientific-Industrial Complex of the Ministry of Health of the Russian Federation

Email: izhirov@mail.ru
121552, Russian Federation, Moscow, ul. 3-ia Cherepkovskaia, d. 15a

A G Kochetov

A.L.Myasnikov Institute of Clinical Cardiology, Russian Cardiological Scientific-Industrial Complex of the Ministry of Health of the Russian Federation; People’s Friendship University of Russia

121552, Russian Federation, Moscow, ul. 3-ia Cherepkovskaia, d. 15a

A V Zaseeva

A.L.Myasnikov Institute of Clinical Cardiology, Russian Cardiological Scientific-Industrial Complex of the Ministry of Health of the Russian Federation

121552, Russian Federation, Moscow, ul. 3-ia Cherepkovskaia, d. 15a

O V Liang

People’s Friendship University of Russia

117198, Russian Federation, Moscow, ul. Miklukho-Maklaya, d. 6

A A Skvortsov

A.L.Myasnikov Institute of Clinical Cardiology, Russian Cardiological Scientific-Industrial Complex of the Ministry of Health of the Russian Federation

121552, Russian Federation, Moscow, ul. 3-ia Cherepkovskaia, d. 15a

A A Abramov

Scientific and practical center of medical aid to children with congenital abnormality of craniofacial area and congenital diseases of the nervous system

119620, Russian Federation, Moscow, ul. Aviatorov, d. 38

R R Gimadiev

A.L.Myasnikov Institute of Clinical Cardiology, Russian Cardiological Scientific-Industrial Complex of the Ministry of Health of the Russian Federation

121552, Russian Federation, Moscow, ul. 3-ia Cherepkovskaia, d. 15a

V P Masenko

A.L.Myasnikov Institute of Clinical Cardiology, Russian Cardiological Scientific-Industrial Complex of the Ministry of Health of the Russian Federation

121552, Russian Federation, Moscow, ul. 3-ia Cherepkovskaia, d. 15a

S N Tereshchenko

A.L.Myasnikov Institute of Clinical Cardiology, Russian Cardiological Scientific-Industrial Complex of the Ministry of Health of the Russian Federation

121552, Russian Federation, Moscow, ul. 3-ia Cherepkovskaia, d. 15a

References

Supplementary files