Element homeostasis of blood plasma as a diagnostic and prognostic criterion of oncological diseases

Full Text

Введение Роль микроэлементов в процессах роста, диф-ференцировки, репарации, регенерации, апоптоза, некроза, выживаемости клеток и, как следствие, в патогенезе опухолевых заболеваний [1] не вызывает сомнений. По мнению M. Valko и соавторов [2] именно дисбаланс микроэлементов лежит в основе инициации и промоции опухолевой патологии не только через модуляцию метаболизма и репарации ядерной и митохондриальной ДНК, но и различных ферментативных и белковых молекул, иммунных клеток и активности анти-оксидантной системы. Однако литературные данные о нарушении элементного гомеостаза плазмы крови при канцерогенезе достаточно противоречивы. Цель исследования: анализ нарушений минерального гомеостаза плазмы крови при канцерогенезе и рецидиве злокачественных новообразований эпителиальной ткани в зависимости от эффективности проводимой терапии. Материал и методы Исследовалась плазма крови 73 больных, ранее не подвергавшихся противоопухолевому лечению: 46 мужчин (47-74 лет) и 27 женщин (34- 67 лет). После оперативного вмешательства проводилось гистологическое исследование опухолевого материала методом иммуногистохимии. Анализ распределения больных по диагнозам и стадиям показал, что рак почки имел место у 16 человек (22%), рак мочевого пузыря - у 12 (16%), рак простаты - у 16 (22%), рак яичников - у 14 (19%), рак гортани - у 7 (10%), рак кишечника - у 3 (4%), рак тела матки - у 2 (3%), рак поджелудочной железы - у 2 (3%), рак желчного пузыря - у 1 (1%). I стадия установлена у 18 % пациентов, соответственно II стадия - у18%, III стадия - у 46 %, ^стадия - у 18%. Контролем служила плазма крови 31 практически здоровых человек: 12 мужчин (24-74 лет) и 19 женщин (25-65 лет). Также были проанализированы образцы крови 14 больных с рецидивом рака эпителиальных тканей, подтвержденным гистологически, до лечения и после проведения первого курса химиотерапии. Первая группа включала пациентов с рецидивом рака толстого кишечника: 3 мужчин и 4 женщины в возрасте 57-62 лет. Все входящие в нее больные имели IV стадию заболевания. Вторая группа состояла из больных рецидивом 10 Функциональная диагностика и диагностические технологии в восстановительной медицине и медицинской реабилитации,способы резервометрии Вестник восстановительной медицины № 5·2014 рака мочевого пузыря: 5 мужчин и 2 женщин в возрасте 48-64 года. Все входящие в нее больные имели III стадию заболевания, установленную в соответствие с международной классификацией TNM. Лечение при рецидиве рака толстого кишечника включало 8 курсов полихимиотерапии (ПХТ) по схеме FOLFIRI: иринотекан (Teva Pharmaceutical Industries, Израиль), фторурацил (ООО «Лэнс-фарм», Россия), лейковорин (ООО «Лэнс-фарм», Россия), при рецидиве рака мочевого пузыря - 6 курсов ПХТ по схеме CMV: карбоплатин (ООО «Лэнс-фарм», Россия), метотрексат (ОАО «Верофарм», Россия), винбластин (ООО «Лэнс-фарм», Россия). Для оценки клинического эффекта пациенты обеих групп наблюдались на протяжении года и в зависимости от отдаленных результатов лечения были разделены на две подгруппы: с достигнутым объективным эффектом (частичный ответ или стабилизация) или прогрессией заболевания. Оценку результатов лечения опухоли проводили с помощью компьютерной томографии с использованием критериев RESIST (версия 1.0), исследование выполнялось до начала лечения и через каждые 8 недель на протяжении терапии и последующего наблюдения. Определение концентрации макроэлементов проводили на анализаторе «КонеЛаб 20/20i» (Финляндия). Анализ уровня микроэлементов осуществляли методом атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной плазмой на спектрометре iСАР6300Duo (Thermo Scientific, США). Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета программ BIOSTAT. При оценке массива данных биохимических показателей пациентов со злокачественными опухолями эпителиальных тканей по критерию Шапиро-Уилка нормальность распределения не была подтверждена, поэтому для оценки значимости различий с данными контрольной группы использовали методы непараметрической статистики: тесты Манна-Уитни и Колмогорова-Смирнова. Результаты и их обсуждение При анализе содержания макроэлементов уже на начальных стадиях канцерогенеза обнаружено статистически значимое снижение уровня Na в плазме крови. Однако, при терминальных стадиях уровень натрия в крови значимо от практически здоровых людей не отличается (табл.1). Понижение уровня натрия ниже уровня 133 мМ/л (гипонатриемия) встречается у 3-4% онкологических больных, причем зачастую это состояние предшествует выявлению злокачественных новообразований [3]. Причиной такого явления может быть эктопическая продукция вазопрессина, наблюдающаяся как компонент паранеопластического синдрома при плоскоклеточных раках головы и шеи, нейроэндокринных опухолях, мезоте-лиомах, опухолях мочеточников, мочевого пузыря, предстательной железы, эндометрия [4]. С другой стороны, на возникновение гипонатриемии могут оказывать влияние цитокины и моноклональные антитела [5]. Следует учитывать, что элементный гомеостаз более корректно оценивать в комплексе, поскольку обмен одних элементов может зависеть от обмена других - в данном случае избыток в организме кальция и калия (табл. 1) может приводить к понижению уровня натрия [6]. Концентрации K и Сі имеет тенденцию к повышению у онкологических больных, но различия этих показателей статистически не значимы. По сравнению с показателями практически здоровых людей при злокачественных новообразованиях значимо повышается содержание Ca, Р, Mg (табл. 1). Фосфор играет фундаментальную роль во многих основных клеточных процессах, таких как биоэнергетика, внутриклеточная сигнализация и минерализация костей и зубов, входит в состав нуклеиновых кислот, клеточных мембран [7]. На сегодняшний день в качестве основных причин гиперфосфатемии при онкологических заболеваниях упоминается острая почечная недостаточность и перераспределение фосфатов между внутриклеточным и внеклеточным простран Таблица 1. Содержание макроэлементов в плазме крови больных со злокачественными новообразованиями эпителиальных тканей Исследованные группы Na, мМ/л K, мМ/л 08,мМ/л 01,мМ/л Мд,мМ/л P, мМ/л Практически здоровые люди (контрольная группа) 142,31±0,75 4,21±0,09 2,21±0,02 103,98±0,35 0,82±0,02 1,10±0,03 Онкологические больные I стадия 137,93±1,67* ■ p=0,037 ▲ p=0,022 4,36±0,16 ■ p=0,576 ▲ p=0,725 2,51±0,20* ■ p=0,107 ▲ p=0,04 101,97±2,09 ■ p=0,6924 ▲ p=0,227 0,89±0,06* ■ p=0,0485 ▲ p=0,0083 1,24±0,03* ■ p=0,0111 ▲ p=0,0317 II стадия 138,00±1,03* ■ p=0,003 ▲ p=0,04 4,28±0,14 ■ p=0,541 ▲ p=0,573 2,38±0,03* ■ p=0,004 ▲ p=0,001 103,14±1,29 ■ p=0,063 ▲ p=0,0681 0,98±0,07* ■ p=0,0125 ▲ p=0,011 1,22±0,02* ■ p=0,0268 ▲ p=0,603 III стадия 139,56±0,64* ■ p=0,016 ▲ p=0,065 4,36±0,11 ■ p=0,257 ▲ p=0,492 2,34±0,03* ■ p=0,012 ▲ p=0,039 104,17±3,41 ■ p=0,385 ▲ p=0,5863 1,27±0,08* ■ p=0,0473 ▲ p=0,0317 1,27±0,09* ■ p=0,0331 ▲ p=0,278 IV стадия 140,12±0,99 ■ p=0,122 ▲ p=0,126 4,38±0,08* ■ p=0,153 ▲ p=0,386 2,49±0,11 ■ p=0,013 ▲ p=0,014 104,20±1,51 ■ p=0,3798 ▲ p=0,1794 1,79±0,50 ■ p=0,6111 ▲ p=0,3169 1,79±0,5* ■ p=0,0334 ▲ p=0,1257 ■ - уровень значимости различий по тесту Манна-Уитни ▲ - уровень значимости различий по тесту Колмогорова-Смирнова * - различия с показателями контрольной группы достоверны (р<0,05) Функциональная диагностика и диагностические технологии в восстановительной медицине 11 и медицинской реабилитации, способы резервометрии Вестник восстановительной медицины № 5·2014 ством при распаде опухоли [8]. Содержание фосфора в клетках гораздо выше, чем в плазме, и при лизисе клеток высвобождается большое его количество. Однако в нашем исследовании гиперфосфатемия наблюдалась (пусть и менее значительная, чем при терминальной стадии) уже на начальных стадиях заболевания, когда вышеуказанные факторы вряд ли играют значительную роль. Вероятно, стоит принимать во внимание синдром кахексии при онкологических заболеваниях, одна из причин которой метаболическое «обкрадывание» организма опухолевыми клетками. Более вероятным представляется увеличение уровня фосфора в крови за счет разрушения немалигнизированных клеток в ходе развития опухолевого процесса. Причем обычно увеличение в сыворотке крови неорганического фосфата, как правило, снижает сывороточные уровни кальция [9]. В проведенном исследовании при злокачественных новообразованиях эпителиальных тканей наблюдалось как увеличение концентрации фосфора, так и кальция в плазме крови. Вероятно, это может быть связано с нарушением молекулярных механизмов транспорта фосфатов в клетку и из нее, причем этот транспорт может осуществляться и в виде переноса АТФ, глюкозо-6-фосфата и глицерол-3-фосфата. Гиперкальциемия встречается у онкологических больных в 15-40%, чаще всего этот синдром ассоциирован с карциномами легких, головы, шеи, пищевода, почек, мочевого пузыря, поджелудочной железы, молочных желез, яичников, шейки матки [10]. Гиперкальциемия при злокачественных новообразованиях (даже без наличия костных метастазов) является результатом секреции в кровоток специфических веществ, вызывающих гиперкальциемию. Более чем в 80% случаев таким гуморальным фактором является паратгормон-родственный протеин [11]. Паратгормон-родственный протеин имеет такую же последовательность на N-конце как и парат-гормон, в связи с чем он может связываться с теми же рецепторами, что и гормон - рецепторами паратгормона I типа [12]. Поэтому паратгормон-родственный протеин может вызывать аналогичные биохимические эффекты: усиление резорбции кости, реабсорбции кальция в дистальных почечных канальцах и снижение транспорта фосфатов в проксимальных почечных канальцах, приводящее к гипофосфатемии. В результате совместного действия этих факторов повышенные концентрации паратгормон-родственного протеина увеличивают концентрацию кальция в плазме. Гиперкальциемия индуцирует полиурию, следствием чего является дегидратация с повреждением почечных функций, что в свою очередь ведет к снижению экскреции кальция, замыкая патологический круг [13]. Прочими гуморальными продуктами, способствующими развитию гиперкальциемии, являются простагландины, трансформирующие факторы роста, ряд цитокинов (IL-1, IL-4, IL-6, TNF-alpha и TNF-β) - за счет активации остеокластов [14]. В литературных источниках показано снижение уровня магния в плазме крови онкологических больных [15], однако сами авторы причиной такого явления считают эффект от лекарственных препаратов. Несмотря на то, что магний является физиологическим антагонистом кальция [6], наше исследование демонстрирует одновременное повышение уровней и того и другого макроэлемента, что с большой долей вероятности свидетельствует о нарушении механизмов регуляции минерального гомеостаза при канцерогенезе. Анализ уровня микроэлементов в плазме крови онкологических больных показал значимое снижение концентрации Cu (в среднем на 25%), Li (в 2,5-5 раз), рост содержания Sr (до 90%) (табл. 2). Особый интерес представляют выявленные изменения концентрации Li. Литий оказывает множественные эффекты на жизнедеятельность клеток организма, опосредуя свое влияние путем регулирования систем вторичных посредников и через различные сигнальные пути [16]. Литий влияет на ряд элементов систем мессенджеров: G-белки, протеинкиназы, аденилатциклазы, инозитол-трифосфат, 3β киназу гликогенсинтазы (рис. 1). По данным Suganthi M. с соавторами [17], в зависимости от концентрации литий может оказывать прямо противоположное действие на апоптоз и пролиферацию Таблица 2. Содержание микроэлементов в плазме крови больных со злокачественными новообразованиями эпителиальных тканей Исследованные группы Fe, мкг/мл Cu, мкг/мл Zn, мкг/мл Li, мкг/мл Ba, мкг/мл Sr, мкг/мл Практически 1,24±0,04 1,36±0,08 0,88±0,09 0,005±0,0011 0,007±0,003 0,043±0,008 здоровые люди (контрольная группа) Онкологические больные I стадия 1,95±0,19* ■ p=0,028 ▲ p=0,035 1,02±0,07* ■ p=0,031 ▲ p=0,038 0,74±0,14 ■ p=0,534 ▲ p=0,191 0,002±0,0006* ■ p=0,001 ▲ p=0,028 0,006±0,001 ■ p=0,998 ▲ p=0,821 0,074±0,014* ■ p=0,041 ▲ p=0,056 II стадия 1,69±0,06* ■ p=0,007 ▲ p=0,011 1,06±0,08* ■ p=0,036 ▲ p=0,049 0,49±0,05* ■ p=0,016 ▲ p=0,041 0,002±0,0006* ■ p=0,026 ▲ p=0,038 0,012±0,003 ■ p=0,081 ▲ p=0,319 0,082±0,017* ■ p=0,001 ▲ p=0,013 III стадия 1,28±0,18 ■ p=0,513 ▲ p=0,319 1,10±0,10* ■ p=0,049 ▲ p=0,037 0,51±0,11* ■ p=0,034 ▲ p=0,048 0,002±0,0007* ■ p=0,018 ▲ p=0,041 0,005±0,002 ■ p=0,827 ▲ p=0,976 0,061±0,03 ■ p=0,156 ▲ p=0,423 IV стадия 1,31±0,12 ■ p=0,909 ▲ p=0,703 1,25±0,09 ■ p=0,139 ▲ p=0,827 0,47±0,09* ■ p=0,023 ▲ p=0,038 0,001±0,0007* ■ p=0,004 ▲ p=0,032 0,009±0,002 ■ p=0,494 ▲ p=0,998 0,079±0,01* ■ p=0,029 ▲ p=0,017 ■ - уровень значимости различий по тесту Манна-Уитни ▲ - уровень значимости различий по тесту Колмогорова-Смирнова * - различия с показателями контрольной группы достоверны (р<0,05) 12 Функциональная диагностика и диагностические технологии в восстановительной медицине и медицинской реабилитации,способы резервометрии Вестник восстановительной медицины № 5·2014 клеток. Известно влияние солей лития на Wnt/β катенин сигнальный путь, а также через изменение активности 3β киназы гликоген синтазы на активность белков, не входящих в состав пути Wnt, например, опухолевого супрессора р53. Однако, малигнизированные клетки более чувствительны к TRAIL-индуцированному апоптозу (рис. 2) [18]. TRAIL (tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand) - цитокин семейства факторов некроза опухоли, который связывается с рецепторами клеточной смерти DR4 и DR5. При связывании лигандов, они активируют каспазу-8, образуя индуцирующий смерть сигнальный комплекс, содержащий рецепторы, адаптер FADD (Fas-associated protein with death domain) и профермент каспазы-8. Активированная каспаза-8 высвобождается в цитоплазму и там инициирует протеазный каскад, активирующий эффекторные каспазы - в частности каспазу-3. Каспаза-3 инактиирует белок-ингибитор нуклеазы CAD (caspase-activated deoxyribonuclease), вызывая фрагментацию ДНК. Каспаза-8 кроме того расщепляет цитозольный белок Bid, после чего он, превращаясь в активный белок tBid, активирует путем частичного расщепления другой проапоптозный белок - Вах. Тот, взаимодействуя с митохондриальным белком пори-ном, образует во внешней мембране канал, по которому выходит цитохром с. Цитохром с формирует комплекс с Liнмдуцмрует МИТОХОНДРИИ Рис. 2. Схема влияния лития на TRAIL-индуцированный апоптоз малигнизированных клеток Функциональная диагностика и диагностические технологии в восстановительной медицине 13 и медицинской реабилитации, способы резервометрии Вестник восстановительной медицины № 5^2014 цитозольными белками Apaf-1, Smac/DIABLO и прока-спазой-9, приводя к образованию активной каспазы-9. Она в свою очередь активирует прокаспазы-3 и -7. В исследованиях Yan Lan с соавторми [19] была показана повышенная экспрессия рецепторов клеточной смерти, сопровождающаяся активацией каскада каспаз под действием солей лития. Таким образом, обнаруженное в нашем исследовании снижение концентрации лития в плазме крови в несколько раз уже на начальных стадиях злокачественных новообразований, может являться одним из пусковых патогенетических механизмов канцерогенеза. При недостатке данного микроэлемента возможна такая ситуация, при которой под действием ДНК-повреждающих агентов (активных форм кислорода или ионизирующей радиации) не будет развиваться апоптоз клетки с нарушенной ДНК по причине нарушения активности TRAIL-индуцированного апоптоза. Принимая во внимание тот факт, что литий может модулировать активность ДНК-полимеразы [17], становиться ясным, что недостаток данного микроэлемента особенно в условиях активации свободнорадикального окисления может стать пусковым механизмом для малигнизации клеток. При анализе уровня макроэлементов (Na, K, Cl, Mg, Ca, P) плазмы крови пациентов с рецидивом злокачественных новообразований эпителиальныхтканей статистически значимые изменения после проведения 1 курса полихимиотерапии были выявлены только для кальция и фосфора (табл. 3), что подтверждается данными B.K. Shah для B-клеточной лимфомы [20]. В случае последующей успешности проведенного лечения уровень фосфора в плазме крови значительно (в 3,97 и 3,51 раз соответственно) возрастал, что, вероятно, обусловлено его попаданием в системный кровоток при разрушении малигнизированных клеток, которые, являясь активно пролиферирующими, характеризуются высокой удельной концентрацией фосфора, входящего в состав нуклеиновых кислот. Кроме того, в ходе некроза идет разрушение плазматической мембраны, в состав которой также входит значительное количество фосфолипидов. При неэффективности лечения и прогрессии заболевания наблюдается противоположный эффект. Статистически значимое повышение уровня кальция в плазме крови после проведения полихимиотерапии независимо от результатов лечения, возможно, объясняется активацией процессов апоптоза под действием химиопрепаратов, выступающих как стрессорные факторы. На поверхности стрессированных клеток появляется первый морфологический сигнал апоптозозависимых модификаций - кальретикулин (Са2+-связывающий протеин, который при нормальной жизнедеятельности клетки находится в эндоплазматическом ретикулуме) [21]. При анализе уровня микроэлементов (Sr, Ва, Zn, Си, Li, AI, Fe, Mn) плазмы крови пациентов с рецидивом злокачественных новообразований эпителиальных тканей статистически значимые изменения после проведения 1 курса полихимиотерапии в зависимости от успеха лечения были выявлены для цинка, железа, лития и частично для меди - в группе больных с рецидивом рака мочевого пузыря (табл. 4). Уровень марганца значимо снижался независимо от результата лечения цитостатиками (табл. 4). Некоторые опухоли эпителиальных тканей накапливают металлы [22, 23]. В связи с этим, при лизисе зло- Таблица 3. Содержание макроэлементов в плазме крови больных с рецидивом злокачественных новообразований эпителиальных тканей ■ - уровень значимости различий по тесту Манна-Уитни ▲ - уровень значимости различий по тесту Колмогорова-Смирнова * - различия с показателями контрольной группы достоверны (р<0,05) 14 Функциональная диагностика и диагностические технологии в восстановительной медицине и медицинской реабилитации,способы резервометрии Вестник восстановительной медицины № 5·2014 Таблица 4. Содержание микроэлементов в плазме крови больных с рецидивом злокачественных новообразований эпителиальных тканей ■ - уровень значимости различий по тесту Манна-Уитни ▲ - уровень значимости различий по тесту Колмогорова-Смирнова * - различия с показателями контрольной группы достоверны (р<0,05) качественных клеток под действием химиотерапии эти металлы попадают в кровь. Установлено значимое повышение их содержания в кровотоке: цинка - в 1,6 и в 2,2 раза; лития - в 2,5 и 1,8 раза; железа - в 3,1 и 2,5 раза соответственно в группах с положительной динамикой при рецидиве рака кишечника и мочевого пузыря. Все вышесказанное было суммировано в схематичном изображении событий, происходящих в случае успешной химиотерапии (рис. 3). Обращает внимание повышение почти в 2 раза концентрации лития в плазме крови в случае объективного эффекта химиотерапии (табл.4). Имеются данные об использовании солей лития при терапии злокачественных новообразований [24]. Авторы предполагают, что под влиянием солей лития активируется апоптоз и увеличивается уровень активных форм кислорода в раковых клеток. Выводы Нарушение минерального гомеостаза является значимым звеном в дезинтеграции метаболических процессов при канцерогенезе. Изменение параметров минерального обмена в плазме крови после первого курса полихимиотерапии могут быть использованы в качестве опережающих маркеров оценки ее эффективности при злокачественных новообразованиях эпителиальных тканей. Рис. 3. Механизмы изменения минерального гомеостаза плазмы крови при некротическом разрушении клеток опухоли в случае успешной полихимиотерапии Функциональная диагностика и диагностические технологии в восстановительной медицине 15 и медицинской реабилитации, способы резервометрии

About the authors

E. I Erlykina

«Nizhny Novgorod State Medical Academy»

L. M Obukhova

«Nizhny Novgorod State Medical Academy»

Email: ObuhovaLM@yandex.ru

A. V Alyasova

«Nizhny Novgorod State Medical Academy»

T. N Gorshkova

«Volga Regional Medical Center» of the Federal Medical-Biological Agency of Russia

V. G Pimenov

«Institute of Chemistry of High-Purity Substances n.a. G.G. Devyatykh»

I. I Evdokimov

«Institute of Chemistry of High-Purity Substances n.a. G.G. Devyatykh»

References

Supplementary files