РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЛАВОНОИДОВ В ТРАВЕ КУЛЬБАБЫ ОСЕННЕЙ (LEONTODON AUTUMNALIS L.)

Полный текст

Кульбаба осенняя (Leontodon autumnalis L.) относящаяся к семейству астровые (Asteraceae) широко применяется в народной медицине в качестве противокашлевого средства на Кавказе и Карелии, при заболеваниях органов пищеварительного тракта на территории Украинского и Белорусского полесья. Так же в народной медицине существуют рекомендации по купанию младенцев в отваре кульбабы осенней, когда они кричат и плохо засыпают. Ранее было установлено, что трава кульбабы осенней содержит флавоноиды, которые представлены агликонами лютеолином и апигенином, и их гликозидами. Флавоноиды проявляют широкий спектр фармакологической активности. Флавоноиды и препараты на их основе оказывают противовоспалительное, антиоксидантное, диуретическое, иммуномодулирующее, антидиабетическое и другие виды действия [3, 5]. Обширное применение флавоноидов в медицинской практике создает необходимость разработки и совершенствования методов их анализа. Цель работы - разработка методики количественного определения флавоноидов в траве кульбабы осенней и ее валидация. Объектом исследования служила трава кульбабы осенней, заготовленная на территории Курской, Белгородской и Воронежской областей в 2013-2014 годах, в период массового цветения растений. Наиболее распространенным методом количественного определения флавоноидов является дифференциальная спектрофотометрия определения в видимой области спектра [1, 4]. Для количественного определения суммы флавоноидов в сырье кульбабы осенней нами была предложена методика спектрофотометрического определения, после предварительного проведения реакции комплексообразования с раствором алюминия хлорида на спектрофотометре СФ-2000. При выборе стандарта для расчета содержания суммы флавоноидов были измерены спектры поглощения спиртового извлечения из сырья кульбабы осенней с алюминия хлоридом и цинарозида с алюминия хлоридом. Полученные спектры совпадали и максимум поглощения находился при длине волны 395 нм. При этом, также изучены такие стадии, как экстрагирование флавоноидов и условия комплексообразования с раствором алюминия хлорида. Разработка методики количественного определения предусматривает проведение валидации. Таким образом, в качестве стандартного вещества для расчета суммы флавоноидов нами предложен 7-глюкозид лютеолина - цинарозид (стандартный образец фирмы Fitopanacea CAS №5373-11-5). При установлении количественного содержания флавоноидов в траве кульбабы осенней нами изучены и выявлены оптимальные условия анализа: степень измельченности сырья, время экстракции, тип экстрагента, объем и концентрация раствора алюминия хлорида (табл. 1) [2]. Было установлено, что наиболее полное извлечение флавоноидов из травы кульбабы осенней достигается при экстракции спиртом этиловым 70% в течении 45 минут со степенью измельчения сырья 1,0 мм, экстракция до наступления равновесия. Оптимальные условия комплексообразования: проведение реакции с 2 мл раствора алюминия хлорида 2% в течение 30 минут. На основании проведенных исследований разработана методика количественного определения флавоноидов в траве кульбабы осенней. Около 1,0 г (точная навеска) сырья, проходящего сквозь сито с диаметром отверстий 1 мм, помещают в колбу с притертой пробкой, объемом 250 мл. Сырье заливают 100 мл спирта этилового 70% и взвешивают с погрешностью ±0,01 г. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и помещают на кипящую водяную баню на 45 минут. Колбу время от времени взбалтывают, чтобы смыть частицы сырья со стенок. После чего колбу с извлечением охлаждают под струей проточной воды и взвешивают. При необходимости массу доводят до первоначальной спиртом этиловым 70%. Охлажденное и доведенное до первоначальной массы извлечение фильтруют через бумажный фильтр, при этом отбрасывают первые 10 мл фильтрата, необходимых для смачивания фильтра. Из полученного экстракта берут 10,0 мл фильтрата, которые помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 2 мл раствора алюминия хлорида 2%, растворенного в спирте этиловом 70%. Затем, через 10 минут - 2 капли разведенной уксусной кислоты. Спиртом этиловым 70% доводят объем раствора до метки. Еще через 30 минут измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 395 нм в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют раствор, содержащий все те же компоненты, что и анализируемый раствор, но не без добавления алюминия хлорида. Содержание суммы флавоноидов в процентной концентрации (Х) в пересчете на цинарозид вычисляли по формуле: где D - оптическая плотность анализируемого раствора при длине волны 395 нм; V - объем извлечения в мл; m - масса навески сырья в граммах; W- влажность сырья, %. Валидацию разработанной методики количественного определения флавоноидов проводили по показателям: линейности, диапазону использования, повторяемости, воспроизводимости, правильности в соответствии с руководства ICH «Валидация аналитических методик. Содержание и методология» [5]. При проверке линейности методики были приготовлены 6 окрашенных растворов комплекса лютеолин-7-глюкозида с алюминия хлоридом различной концентрации, измерены их оптические плотности при длине волны 395 нм и построен график зависимости оптической плотности от концентрации флавоноидов (рис. 1). Коэффициент корреляции составил 0,999614, следовательно, данную методику можно использовать для анализа флавоноидов травы кульбабы осенней в пересчете на цинарозид в указанном диапазоне концентраций (табл. 2). Для проверки диапазона использования методики получали извлечения из травы кульбабы осенней различной концентрации, для чего получали извлечения из навесок массой 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2 (точные навески) и в полученных извлечениях по разработанной методике проводили определение суммы флавоноидов (рис. 2). По полученным экспериментальным данным рассчитывали коэффициент корреляции, угловой коэффициент линейной регрессии, свободный член графика (табл. 3). Коэффициент корреляции составил 0,999954, таким образом, разработанную методику можно использовать для количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид в указанном диапазоне концентраций. Для подтверждения повторяемости разработанной методики нами анализировался один образец сырья кульбабы осенней в шести повторностях. Критерий приемлемости выражался величиной относительного стандартного отклонения, которое не должно превышать 10% (табл. 4). Воспроизводимость методики определяли на одном образце сырья в 6 повторностях. Критерий приемлемости выражался величиной относительного стандартного отклонения, которое не должно превышать 15%. Он составил 6,98% (табл. 5). Правильность методики устанавливали путем измерения количественного содержания флавоноидов в пересчете на цинарозид в извлечениях, полученных путем добавления необходимого количества стандартного раствора цинарозида 0,05% - 0,25 мл, 0,5 мл, 0,75 мл к исследуемому извлечению. Критерий приемлемости - средний процент восстановления при использовании растворов заданных концентраций, его средняя величина должна находиться в пределах 100 ± 5%. В разработанной методике процент восстановления колеблется от 97,12% до 102,69%, его среднее значение составляет 100,17% при относительной ошибке 4,37% (таблица 6). По разработанной методике было установлено содержание флавоноидов в траве кульбабы осенней, заготовленной в различных местах произрастания (таблица 7). Анализируя данные таблицы 7, можно отметить, что в траве кульбабы осенней содержание флавоноидов колеблется от 0,55% до 0,71. Выводы 1. Нами впервые разработана методика спектрофотометрического определения суммы флавоноидов в траве кульбабы осенней. Содержание флавоноидов в сырье кульбабы осенней колеблется от 0,55% до 0,71%. 2. Проведена валидация разработанной методики по показателям линейности, диапазону использования, повторяемости, воспроизводимости и правильности.

Об авторах

Р. А Бубенчиков

Курский государственный медицинский университет

Email: bubenchikova.ksmu@yandex.ru
г. Курск

Н. Н Гончаров

Курский государственный медицинский университет

г. Курск

Список литературы

Дополнительные файлы