ИЗУЧЕНИЕ ФЛАВОНОИДОВ ИВЫ ТРЕХТЫЧИНКОВОЙ (SALIX TRIANDRA L.), ПРОИЗРАСТАЮЩЕЙ НА СЕВЕРНОМ КАВКАЗЕ

Полный текст

Введение. Флавоноиды - фенольные соединения, представляющие чаще всего различные производные фенилхромана или фенилхромона, найдены почти во всех частях высших растений в виде гликозидов и/или агликонов. Качественный их состав и количественное содержание зависит от семейства и вида растения [1]. Работами В.А. Компанцева показано, что растения рода ива богаты наличием различных флавоноидов. Им найдено, что в листьях ивы трехтычинковой содержится до 5% рутина, в коре - салипурпозид и нарингенин (около 1,5%), в соцветиях - рутин и кверцетин (около 1,5%) [2, 3]. Количественное определение рутина в листьях ивы трехтычинковой (Salix triandra L.) проводилось в 60-е годы ХХ века спектрофотометрическим методом, который в то время требовал длительной пробоподготовки (извлечение из сырья, ТСХ, извлечение из хроматографического слоя метанолом, удаление растворителя, растворение в этаноле, измерение оптической плотности). Параллельно в этих же условиях проводилось определение оптической плотности рутина [3]. В настоящее время описаны доступные и простые методы определения рутина в растительном сырье. Так в коре ивы трехтычинковой методом дифференциальной спектрофотометрии найдено 0,41% суммы флавоноидов в пересчете на рутин [4]. Однако в листьях и побегах ивы трехтычинковой до настоящего времени такие определения не проводились. Учитывая, что листья ивы трехтычинковой содержат значительные количества рутина и могут служить потенциальным сырьем для создания лекарственных средств на их основе, актуальным является определение суммы флавоноидов в листьях ивы трехтычинковой и ее побегах [5]. Целью настоящего исследования является определение суммы флавоноидов, в иве трехтычинковой, произрастающей на Северном Кавказе в зависимости от места и времени сбора. Методы. Объекты исследования - однолетние облиственные, неодревесневшие длиной до 30 см побеги ивы трехтычинковой, произрастающей на Северном Кавказе, собранные по берегам рек Подкумок (г. Пятигорск, Ставропольский край), Малка (Кабардино-Балкарская Республика), Кубань (Кочубеевский район Ставропольского края). Сырье собирали в разные стадии вегетации в 2013 - 2015 годах в период с 20 по30 число каждого месяца. В дальнейшем проводили сравнение содержания флавоноидов в побегах, а также в листьях и побегах без листьев по отдельности. Получение извлечения для идентификации флавоноидов: к 1,0 г сырья добавляли 20 мл спирта этилового 70% и нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 30 минут. Извлечение охлаждали до комнатной температуры, фильтровали и проводили следующие реакции: цианидиновая проба; борно-лимонная реакция; реакции с раствором ацетата свинца и раствором аммиака [6]. Качественный анализ флавоноидов проводили методом ТСХ в традиционно применяемой системе растворителей н-бутанол: кислота уксусная концентрированная: вода (4: 1: 2) [1]. На пластинку «Сорбфил» наносили по 15 мкл спиртовых извлечений побегов, листьев и побегов без листьев и по 5 мкл 0,05% спиртовых растворов образцов СО. Пластинки помещали в камеру, насыщенную системой растворителей в течение 1 часа. Когда фронт растворителя достигал 12 см, хроматограммы доставали из камеры, высушивали, просматривали в видимом и УФ-свете при длине волны 365 нм. Идентификацию веществ проводили с помощью обработки парами аммиака или 2% раствором алюминия хлорида. Для количественного определения суммы флавоноидов была использована методика дифференциальной спектрофотометрии, основанная на реакции флавоноидов с алюминия хлоридом [7]:1,0 г сырья (точная навеска) помещали в коническую колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляли 30 мл спирта этилового 70% и проводили экстракцию на водяной бане с обратным холодильником в течение 30 минут с момента закипания смеси. Горячий раствор фильтровали через ватный тампон в мерную колбу вместимостью 100 мл, помещая затем ватный тампон в колбу с сырьем. Экстрагирование проводили еще дважды. Раствор охлаждали при комнатной температуре, фильтровали через бумажный фильтр «синяя лента» в ту же колбу и доводили до метки спиртом этиловым 70%. При необходимости извлечение повторно фильтровали (раствор А). 2 мл раствора А помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляли 10 мл спирта этилового 95% и 2 мл алюминия хлорида спиртового раствора 2%. Через 10 минут прибавляли 0,1 мл уксусной кислоты разведенной и доводили до метки спиртом этиловым 95%. По истечении 40 минут измеряли оптическую плотность на спектрофотометре СФ-2000 при длине волны 410 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали раствор, состоящий из 2 мл соответствующего извлечения, 0,1 мл уксусной кислоты разведенной и доведенный спиртом этиловым 95% до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл. Параллельно измеряли оптическую плотность раствора стандартного образца рутина, для чего в две мерные колбы вместимостью 25 мл вносили по 1 мл 0,05% спиртового раствора рутина и далее поступали, как описано выше. Содержание суммы флавоноидов вычисляли в пересчете на рутин. Валидационную оценку методики количественного определения флавоноидов проводили в соответствии с требованиями ОФС.1.1.0012.15 «Валидация аналитических методик» [8]. Для построения градуировочного графика отбирали по 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 и 3,5 мл из раствора А (см. методику) и помещали в мерные колбы вместимостью 25 мл, далее поступали, как описано в методике. Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин определяли в конкретной аликвоте в г/мл. По полученным данным рассчитывали коэффициент и свободный член уравнения регрессии в соответствие с требованиями ОФС.1.1.0013.15 «Статистическая обработка результатов химического эксперимента» [9]. Результаты. Положительные результаты вышеперечисленных реакций свидетельствуют о присутствии флавоноидов (табл.1). С помощью метода ТСХ нами подтверждено, что в листьях, побегах и побегах без листьев содержится рутин (на хроматограмме просматривалось яркое пятно на уровне пятна СО рутина), кроме рутина наблюдалось слабо окрашенное пятно на уровне пятна СО кверцетина, однако в побегах без листьев пятно кверцетина не наблюдалось. Далее, используя дифференциальную спектрофотометрическую методику, принятую ГФ 13 издания (2015 г.) для определения суммы флавоноидов в лекарственном растительном сырье, определяли сумму флавоноидов в листьях, побегах и побегах без листьев ивы трехтычинковой. Учитывая, что во всех исследуемых образцах содержался рутин и максимум поглощения растворов исследуемых образцов находился в области максимума поглощения комплекса рутина с алюминия хлоридом - 410-412 нм содержание суммы в пересчете на рутин. Ввиду того, что данная методика для определения суммы флавоноидов ивы трехтычинковой используется впервые, нами предварительно была проведена валидация методики по критериям: специфичность, прецизионность, линейность и правильность (табл. 2) на примере определения суммы флавоноидов в побегах ивы трехтычинковой, собранных в сентябре 2013 года. Для данной выборки значение коэффициента корреляции составило 0,994. Полученное уравнение позволяет сделать вывод о наличии линейной зависимости оптической плотности от концентрации флавоноидов в области концентраций от 0,0005 г/мл до 0,0026 г/мл. Правильность методики рассматривали как результат изучения линейности валидируемой методики: если свободный член в уравнении статистически достоверно не отличается от нуля, то использование такой методики дает результаты, свободные от систематической ошибки. Согласно статистической обработке полученного уравнения коэффициент «а» имеет доверительный интервал 374±10, а свободный член «b» значимо не отличается от нуля, т.к. его доверительный интервал намного больше этого значения и равен 0,014 (0,002± 0,014). В виду того, что свободный член b =0, уравнение принимает вид у=(375±3)х и предлагаемая методика не отягощена систематической погрешностью [10]. Таким образом, на основании полученных результатов (табл. 2), можно сделать вывод о том, что применяемая методика является валидной по следующим характеристикам: специфичность, линейность, правильность и повторяемость. Валидированная методика была использована для определения содержания суммы флавоноидов в побегах, листьях и побегах без листьев, собранных в 2013, 2014 и 2015 гг., в различное время и различных районах Северного Кавказа. Анализ проводился в год сбора сырья (табл. 3). Обсуждение. Таким образом, результаты таблицы 3 свидетельствуют, что наибольшее количество суммы флавоноидов накапливается в листьях (от 2,661% до 3,676%), в побегах - это значение не- много меньше (от 1,73% до 3,26%). В побегах без листьев содержание флавоноидов почти в 10 раз меньше (от 0,117% до 3,266%). В связи с низким содержанием флавоноидов, в сырье, заготовленном в 2015 г., определение суммы флавоноидов в побегах без листьев не проводилось. Проведенный анализ на примере сырья, заготовленного в пойме реки Подкумок в течение трех лет (сентябрь 2013, 2014 и 2015 гг.), позволяет сделать вывод, что содержание суммы флавоноидов в сырье ивы трехтычинковой, собранного в одном месте, но в разные годы под- вергается незначительным изменениям (2,14; 2,80 и 2,61% в побегах и 3,19; 3,23 и 3,49% соответственно в листьях). Однако накопление флавоноидов в течение весны, лета и осени в различные годы сбора происходит не однозначно. Так, в 2014 году наибольшая сумма флавоноидов накапливалась летом, тогда, как в 2015 году она оказалась наибольшей осенью. Оказалось также, что содержание флавоноидов зависит от места сбора сырья, что также следует учитывать при заготовке в промышленных масштабах. Заключение. При исследовании наличия флавоноидов в листьях и побегах ивы трехтычинковой, произрастающей на Северном Кавказе, найдено, что и листья, и побеги содержат флавоноиды: рутин и кверцетин. Валидационная оценка спектрофотометрической методики определения суммы флавоноидов в сырье ивы трехтычинковой подтвердила ее применимость. Погрешность определения находится в пределах 2,5%. Найдено, что наибольшее количество суммы флавоноидов накапливается в листьях (от 2,6% до 3,7%), в побегах - это значение немного меньше (от 1,7% до 3,3%). В побегах без листьев содержание флавоноидов почти в 10 раз меньше (от 0,1% до 0,3%). Показано, что содержание флавоноидов зависит от места и времени сбора сырья.

Об авторах

Е. Г Санникова

Пятигорский медико-фармацевтический институт-филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России

Email: je-je4ka2012@yandex.ru
г. Пятигорск, Россия

О. И Попова

Пятигорский медико-фармацевтический институт-филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России

Email: beegeeslover@mail.ru
г. Пятигорск, Россия

О. О Фролова

Пятигорский медико-фармацевтический институт-филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России

г. Пятигорск, Россия

А. Ю Айрапетова

Пятигорский медико-фармацевтический институт-филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России

Email: asyapgfa@mail.ru
г. Пятигорск, Россия

Список литературы

Дополнительные файлы