ОПРЕДЕЛЕНИЕ РУТИНА В ЛИСТЬЯХ ИВЫ ТРЁХТЫЧИНКОВОЙ МЕТОДОМ ПЛАНАРНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Полный текст

Ива трехтычинковая (Salix triandra L.) широко распространена на Северном Кавказе. Является высоким быстрорастущим кустарником или небольшим деревцем до 5 - 6 м высотой. Отличается раскидистой густой кроной, длинными прутовидными желтовато-зелеными побегами и миндалевидными листьями [3]. Ива трехтычинковая относится к секции Amygdalinae, которая характеризуется наличием рутина, содержание которого в листьях достигает 5%. Рутин является специфичным для таксона данной секции ивы [2]. Количественное определение рутина в листьях ивы трехтычинковой (Salix triandra L.) проводилось в 60-е годы ХХ века хроматоспектрофотометрическим методом, который требовал длительной пробоподготовки. В настоящее время описаны доступные и простые методы определения рутина в растительном сырье. Однако в листьях ивы трехтычинковой до настоящего времени такие определения не проводились. Учитывая, что листья ивы трехтычинковой содержат значительное количество рутина и могут служить потенциальным сырьем для создания лекарственных средств на их основе, актуальным является разработка методики анализа рутина в листьях ивы трехтычинковой более совершенным и надёжным методом анализа. Цель работы - разработка методики идентификации и количественного определения рутина в листьях ивы трехтычинковой методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии. Для получения извлечения использовали разные способы. Способ 1. Навеску сырья массой около 3,0 г (точная навеска) помещают в колбу вместимостью 100,0 мл со шлифом, прибавляют 50 мл спирта этилового 70%. Настаивают 30 мин при комнатной температуре, затем нагревают на кипящей водяной бане в колбе с обратным холодильником в течение 2 часов. Полученное извлечение фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят спиртом до метки, хорошо перемешивают. Способ 2. Навеску сырья массой около 3,0 г (точная навеска) обрабатывают хлороформом при комнатной температуре (3 раза по 50 мл) для удаления липофильных веществ. Хлороформ отфильтровывают, сырье подсушивают в течение 15 мин в вытяжном шкафу и количественно переносят в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, прибавляют 50 мл спирта этилового 70% и нагревают на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 2 часов. Полученное извлечение фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят спиртом до метки, хорошо перемешивают. Приготовление раствора стандартного образца (СО) рутина: 0,1 г рутина (ФС 42- 2508-96) (точная навеска), предварительно высушенного при температуре 130-135 °С в течение 3 часов, помещали в мерную колбу вместимостью 100,0 мл, растворяли в спирте этиловом 95% при нагревании на водяной бане. Раствор охлаждали до комнатной температуры и доводили спиртом раствор до метки. Концентрация рутина в растворе 1,0 мкг/мкл. Для идентификации и количественного определения использовали метод тонкослойной хроматографии с денситометрической регистрацией аналитического сигнала. Хроматографирование проводили на пластинках марки «Sorbfil» ПТСХ-П-А-УФ (г. Краснодар) размером 10х15 см. В качестве подвижной фазы использовали систему н-бутанол-ледяная уксусная кислота-вода (4:1:1). Высота подъема растворителя 9 см. Детектирование проводили парами аммиака. На линию старта хроматографической пластинки длиной 15 см наносили 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 мкл раствора СО (содержание рутина - 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 мкг соответствен- но). На этой же пластинке обозначали четыре линии контрольных треков, на которые наносили спиртовые извлечения из листьев ивы объемом 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 мкл. Пробы наносили при помощи микрошприца МШ-10 (агат). Пластинки помещали в камеру для хроматографирования объемом 2000 см3, насыщенную парами растворителя в течение часа. После подъема растворителя на необходимый уровень пластинки вынимали, высушивали в вытяжном шкафу при комнатной температуре до удаления паров растворителя. На пластинке появляются пятна жёлтого цвета. Для усиления окраски пластинку держали над парами аммиака концентрированного. Далее пластинки сканировали при помощи планшетного сканера «HP Scanjet 3670» (разрешение 100 dpi) и осуществляли их цифровую обработку с помощью компьютерной программы «Видеоденситометр Sorbfi (г. Краснодар). Количественное определение проводили методом абсолютной калибровки (внешнего стандарта) по градуировочному графику зависимости «масса вещества - площадь пика» (линейная аппроксимация). Статистическая обработка результатов проводилась в соответствии с ОФС «Статистическая обработка результатов химического эксперимента и биологических испытаний» [1]. На треках контрольного образца визуально обнаруживались пятна жёлтого цвета с Rf (0,64±0,02), что соответствует окраске и Rf стандартных образцов. На оцифрованной хроматограмме спиртового извлечения появляется пик, соответствующий пикам стандартных образцов рутина (рис. 1). Эффективность пластинки около 2000 теоретических тарелок (N). Предел обнаружения (ПО) составляет 0,5 мкг. Градуировочный график рутина приведён на рисунке 2. Уравнение регрессии и коэффициент корреляции были рассчитаны в электронных таблицах Microsoft Excel. Уравнение регрессии имеет вид: S = 4,75×103 m (свободный член «a» незначим). Данной методикой было проведено количественное определение рутина в листьях ивы трёхтычинковой. Результаты исследований в пересчёте на воздушно сухое сырьё приведены в таблице 1. Извлечение рутина из обезжиренного сырья наиболее эффективно. Выводы 1. Предложен эффективный, высокочувствительный метод качественного и количественного определения рутина в растительном сырье. Метод не требует использования сложного дорогостоящего оборудования. 2. Наиболее полное извлечение рутина из листьев происходит с использованием способа 2 из обезжиренного сырья. Результаты значимо отличаются (t-критерий - 25,7; tтабл. - 2,3). Содержание рутина в листьях ивы трёхтычинковой, определённое данной методикой, составило 1,81±0,06% в пересчёте на воздушно сухое сырьё.

Об авторах

Е. Г Санникова

Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России

г. Пятигорск

Т. Д Мезенова

Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России

Email: mezenova@yandex.ru
г. Пятигорск

Список литературы

Дополнительные файлы