ИЗУЧЕНИЕ КИНЕТИКИ ГИДРОЛИЗА БАЙКАЛИНА ПРИ ЕГО ЭКСТРАКЦИИ ИЗ КОРНЕЙ ШЛЕМНИКА БАЙКАЛЬСКОГО

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Шлемник байкальский (Scutellaria baicalensis Georgi) это растение семейства Яснотковые (Lamiaceae), распространен в Российской Федерации на Забайкалье, Приамурье, Приморье, растет также в Монголии и Китае. Сырьем для медицинских целей является корень. В корне содержатся флавоноиды (байкалин более 9%, байкалеин до 5%, вогозид до 4%, вогонин до 0,7%, скутелляреин и др.), стероиды (ситостерин, стигмастерин и др.), кумарины и др. [1, 2]. Биологически активные вещества из корня шлемника байкальского проявляют различные ценные фармакологические эффекты. Они воздействуют на центральную нервную систему (проявляют седативный, гипотензивный, антиконвульсивный эффекты), полезны для печени (проявляют гепатозащитную и антиоксидантную активность), снижают процессы воспаления, угнетают рост патогенных микроорганизмов (бактерии, вирусы), имеют цитотоксический эффект на различные клеточные линии опухолей и др. [3-18]. Таким образом, БАВ из данного вида растительного сырья обладают ценными фармакологическими свойствами, а исследования в области технологии их выделения являются актуальными. Из литературных источников известно, что вид экстрагента, температура и время экстракции очень сильно влияют на качественный и количественный состав получаемого экстракта [19, 20]. Это обусловлено присутствием активного фермента бета-глюкуронидазы в клетках корня шлемника байкальского, который при смачивании сырья экстрагентом, содержащего воду начинает активно гидролизовать байкалин до его агликона (байкалеина) и глюкуроновой кислоты [21]. Данное обстоятельство следует учитывать при разработке методов контроля качества данного вида сырья, а также технологии выделения БАВ. Поэтому представляло интерес изучение процесса гидролиза байкалина во время его экстракции из корней шлемника байкальского. При этом полученная информация может стать отправной точкой для дальнейших исследований в оптимизации технологии выделения БАВ из данного вида сырья. Цель исследования - изучить кинетику гидролиза байкалина при его экстракции из корней шлемника байкальского. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объект исследования Корни шлемника байкальского приобретались в ООО Аптека «Лекарственные растения», г. Харьков, Украина, серия № 921217, срок годности до IX/2020 года. Для исследований корни измельчались до размера частиц 0,1-0,5 мм с помощью высокоскоростного измельчителя HC-500Y, Китай. Метод экстракции В исследованиях использовали простую мацерацию в течение заданного промежутка времени, при соотношении сырье : экстрагент 1:10 м/о и температуре 24±1°С, для этого точную навеску 1,0 г измельченного ЛРС помещали в герметичный флакон, заливали 10,0 мл экстрагента, укупоривали и оставляли для настаивания на требуемый промежуток времени, затем извлечение сливали, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин и передавали на анализ содержания байкалина и байкалеина. Извлечение перед анализом дополнительно центрифугировали при 13 000 об/мин в течение 5 мин. В качестве экстрагента использовали водные растворы этанола 26, 43, 59, 72, 81, 97±1% об. Пробоподготовка Анализ исходного содержания байкалина и байкалеина в растительном сырье проводили с помощью метода простой мацерации при следующих условиях: экстрагент - этанол 43% об., соотношение сырье : экстрагент около 1:50 м/о, время экстракции 30 мин, температура экстракции 95±5°С (водяная баня). Точную навеску 1,0 г измельченного растительного сырья помещали в колбу, заливали 50,0 мл экстрагента, колбу соединяли с обратным холодильником и экстрагировали 30 мин на водяной бане, затем колбу охлаждали, извлечение сливали, растительное сырье промывали дополнительно экстрагентом 5,0 мл, полученный слив объединяли с основной массой извлечения и взвешивали. Суммарное извлечение анализировали с помощью метода обратно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ). Плотность извлечения определяли по методу 1, согласно ОФС.1.2.1.0014.15 [22]. Содержание байкалина и байкалеина в растительном сырье (X1,2%), рассчитывали по формуле (1): где: C - концентрация байкалина или байкалеина, г/мл; M - масса извлечения, г; m - масса растительного сырья; г; ρ - плотность извлечения, г/мл. Метод анализа Содержание байкалина и байкалеина в извлечениях анализировали с помощью ОФ ВЭЖХ. Анализ проводили на хроматографе фирмы «Agilent Technologies», серии «Agilent 1200 Infinity», производства США. Более подробно условия анализа описаны в работе [23]. В качестве веществ стандартов использовали байкалеин и байкалин ФСО ГФУ, содержание ≥95,0 %. Аналитическая длина волны 275 нм. Основные параметры валидации метода анализа и пригодности ОФ ВЭЖХ системы для определения байкалеина и байкалина представлены в Таблице 1. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ На рис. 1, представлена хроматограмма извлечения при опреледении содержания байкалина и байкалеина в растительном сырье согласно пункта «Пробоподготовка» в разделе «Материалы и методы». Как видно из рис. 1, в полученном извлечении доминирует байкалин (I) (время удерживания 22,4 мин). После подстановки полученных экспериментально значений площади пика байкалина/байкалеина в уравнение регрессии (табл. 1), рассчитывали концентрацию данных веществ в извлечении, затем проводили расчет их содержания в исходном сырье по уравнению (1). Исходное содержание байкалина в растительном сырье составляло - 14,8±0,7% масс., байкалеина - 1,89±0,09% масс. На рис. 2, представлена хроматограмма извлечения при аналитической длине волны 275 нм, на основе этанола 72% об., которое было получено при времени настаивания 13,3±0,2 часа, температуре 24±1°С и соотношении сырье : экстрагент 1:10 м/о. Как видно из рис. 2, в полученном извлечении доминируют два вещества байкалин (I) и байкалеин (II), хотя в исходном сырье доминировал только байкалин. Следовательно, за 13,3±0,2 часа настаивания произошел гидролиз байкалина с образованием значительного количества байкалеина. Результаты ОФ ВЭЖХ анализа выхода байкалеина и байкалина в извлечения для различных концентраций этанола при тех же условиях (13,3±0,2 часа настаивания при температуре 24±1°С и соотношении сырье:экстрагент 1:10 м/о), представлены на рис.3. Выход байкалина рассчитывали к его исходной величине в ЛРС. Выход байкалеина (X3 ), рассчитывали в пересчете на его гипотетическое содержание в сырье при условии, что весь байкалин (X1 ), превратился в него (X3 =X2 +X1 ·Mr2 /Mr1 =1,89+14,8·270,2/446,4=10,9% масс.). Число повторов n=3, уровень значимости Р=0,95. Из эмпирических графиков представленных на рис. 3, видно, что в условиях эксперимента (13,3±0,2 часа настаивания при температуре 24±1°С и соотношении сырье:экстрагент 1:10 м/о), в этаноле 43 % об., значительная часть байкалина распадается до байкалеина. При этом выход байкалина в данный экстрагент составлял 6,2% от его первоначального содержания в сырье, а выход байкалеина составлял 44,5 % от его гипотетического содержания в сырье. Полученные значения дают возможность рассчитать процент превращенного байкалина, который составил 44,8% ={100·[(10,9-1,89)·44,5/100]·446,4/(270,2·14,8)}, т.е. почти половина байкалина распалась от его первоначального содержания в сырье. Вероятно его оставшаяся часть (49% =100-44,8-6,2), не растворилась в этаноле с данной концентрацией и осталась в сырье, что требует дополнительных исследований. На полученных эмпирических кривых хорошо виден максимум выхода для байкалина в этанол 70±5% об., и для байкалеина в этанол 53±10% об. Интересно также отметить существование общей (изобестической) точки пересечения эмпирических кривых для этанола с концентрацией 62±3% об., в которой наблюдается 50% значение выхода каждого компонента. Кроме этого из графиков также видно, что байкалеин и байкалин в этанол с концентрацией ниже 30% об., и более 90% об., практически не переходят. В этаноле с концентрацией от 40 до 60% об., наблюдается максимальный выход байкалеина, который достигает величины 45-50% от его гипотетического содержания в сырье, что вероятно объясняется, как уже было отмечено выше, его неполной растворимостью в этаноле данной концентрации. Из представленных выше данных можно предположить, что активность фермента бета-глюкуронидазы в корнях шлемника байкальского не подавляется в присутствии этанола и имеет высокий уровень активности в этаноле с концентрацией от 30 до 90% об. Следующий этап исследований был связан с изучением кинетики гидролиза байкалина в корнях шлемника байкальского при тех же условиях проведения процесса экстракции. Для этого использовали в качестве экстрагента этанол 43 и 72% об. При этом нами было выдвинуто предположение, что гидролиз байкалина должен проходить по реакции первого порядка, поэтому экспериментальные данные в координатах lnC=f(t), должны хорошо аппроксимироваться линейным регрессионным уравнением. Результаты обработки полученных данных представлены на рис. 4. Как видно из рис.4, экспериментальные точки зависимости концентрации байкалина в извлечении от времени настаивания хорошо аппроксимируются линейным уравнением в предсказанных координатах (коэффициент детерминации более R²˃0,99, что говорит о функциональной зависимости между параметрами). Следовательно, эксперимент подтвердил предположение относительно механизма гидролиза байкалина в корнях шлемника байкальского, который подчиняется уравнению кинетики первого порядка. Интересно отметить, что этанол при этом влияет на энергетику процесса ферментативного гидролиза и замедляет его с повышением концентрации этанола в экстракционной смеси. Полученные константы и некоторые величины, которые можно из них получить с точки зрения законов химической кинетики для реакции первого порядка приведены в табл. 2. Как видно из данных приведенных в табл. 2, значения производного показателя - исходная концентрация байкалина в этаноле 43% и 72% об., близки, но статистически различаются друг от друга (0,0082±0,0004<0,0101±0,0002, г/мл). Более того, вычисленные значения меньше экспериментально найденного значения байкалина в сырье в 1,8 и 1,4 раза соответственно (0,0148±0,0007 г/мл). Данные несоответствия требуют дополнительных экспериментальных исследований и теоретического объяснения. Интересно отметить, что производный показатель время полураспада байкалина в этаноле с концентрацией 43 % об., на порядок меньше чем в этаноле с концентрацией 72% об. (4,6±0,5<<42,3±1,8 ч). Полученные значения времени полураспада байкалина показывают, что для получения экстракта с максимальным содержанием байкалина и минимальным содержанием байкалеина целесообразно применять технологию быстрой экстракции (в течение 1-2 часов), а также использовать этанол с концентрацией 70-80% об. В случае же необходимости выделения байкалеина рекомендуется применять настаивание не менее 12 часов и использовать этанол с концентрацией от 30 до 60% об. В целом полученные результаты позволяют описать кинетику гидролиза байкалина в рамках законов химической кинетики и катализа. Более того, для изучения влияния вида и состава экстрагента на выход байкалина и его гидролиз, следует использовать также законы физической химии и дополнительные исследования, которые позволят создать более полную математическую модель с введением понятия энергии активации процесса гидролиза. Данные результаты могут быть использованы для развития технологии выделения байкалина или байкалеина из корней шлемника байкальского. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Изучена кинетика гидролиза байкалина во время его экстракции из корней шлемника байкальского с помощью этанола с концентрацией 43 и 72% об. Установлено, что процесс гидролиза байкалина хорошо описывается кинетическим уравнением первого порядка. Найдены константы процесса гидролиза байкалина во время его экстракции из корней шлемника байкальского с помощью этанола различной концентрации.

Об авторах

Н. Н. Бойко

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования научно-исследовательский университет «Белгородский государственный университет» Министерства образования и науки РФ

Email: boykoniknik@gmail.com

Д. И. Писарев

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования научно-исследовательский университет «Белгородский государственный университет» Министерства образования и науки РФ

Email: pisarev@bsu.edu.ru

Е. Т. Жилякова

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования научно-исследовательский университет «Белгородский государственный университет» Министерства образования и науки РФ

Email: ezhilyakova@bsu.edu.ru

А. Ю. Малютина

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования научно-исследовательский университет «Белгородский государственный университет» Министерства образования и науки РФ

Email: malyutina_a@bsu.edu.ru

О. О. Новиков

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Российский университет дружбы народов»

Email: ole9222@yandex.ru

М. А. Бочарникова

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования научно-исследовательский университет «Белгородский государственный университет» Министерства образования и науки РФ

Email: bocharnikova_m@bsu.edu.ru

Список литературы

Дополнительные файлы