ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНОЙ АВЕРСИВНОЙ СРЕДЫ НА ПОТРЕБЛЕНИЕ КИСЛОРОДА В МЫШЦАХ И КРОВИ У МЫШЕЙ В УСЛОВИЯХ ТЕСТА «ПРИНУДИТЕЛЬНОГО ПЛАВАНИЯ»

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ В настоящее время истощающим физическим нагрузкам подвержено большое количество людей. К данной категории можно отнести высококвалифицированных спортсменов [1], а также лиц, профессиональная деятельность которых связана с рядом воздействующих на организм негативных факторов окружающей среды [2-4]. К их числу можно отнести: пониженное парциальное давление кислорода и углекислого газа, высокие и низкие температуры, запыленность, десинхронозы, приводящие к срыву адаптационных возможностей человека и развитию дезадаптации [5]. Стоит отметить, что влияние неблагоприятной среды на организм в условиях истощающих физических нагрузок реализуется через изменение активности скелетной мускулатуры, при этом к числу основных компенсаторных механизмов в мышечной ткани, в ответ на стрессор, являются: увеличение потребления кислорода, активация белково-синтетических процессов, интенсификация метаболических реакций и т.д [6, 7]. Таким образом, оценка изменения потребления кислорода мышцами и кровью в различных аверсивных средах, может стать основным вектором, для разработки средств, препятствующих мышечному утомлению. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Лабораторные исследования Экспериментальное исследование было выполнено на 100 беспородных мышах-самцах, массой 23-25 г., полученных из питомника «Рапполово» (г. Санкт-Петербург), и содержащихся в виварии ПМФИ - филиала ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» МЗ РФ. Все воспроизводимые манипуляции над животными соответствовали «Правилам Европейской конвенции по защите позвоночных животных» (Страсбург, 1986 г). Мыши содержались в естественном режиме освещения вивария, температура воздуха и влажность составляли 22-24°С и 60±5% соответственно. Животные находились в пластмассовых клетках с древесными опилками и в свободном доступе получали корм и воду. Изначально, мыши-самцы были рандомизированы по времени плавания и распределены в следующие экспериментальные группы: интактная группа мышей - подвергалась плаванию с днями отдыха по 3 особи каждый день (ИНх , температура воды 15°С) (n=30), негативный контроль (НКх , температура воды 15°С) (n=10) [8]; интактная группа (ИНг , температура воды 41°С) (n=30) и негативный контроль ( НКг, температура воды 41°С) (n=10) [9], и две группы мышей (по 10 особей в каждой), получавших препарат сравнения Метапрот® в виде суспензии в дозировке 25 мг/ кг (капсулы, ЗАО «Фармпроект», Россия) [10]. Животные группы негативного контроля, а также мыши группы, получавшей Метапрот, подвергались ежедневным физическим нагрузкам в течение 10 дней. Модель мышечной дисфункции Ранее уже была проведена валидационная методика оценки физического напряжения животных в аверсивной среде (15°С) с нагрузкой 20% от массы тела животного [8]. Наряду с этой методикой представился интерес оценить физическую работоспособность в горячей воде [9]. Для этого животных подвергали принудительному плаванию с нагрузкой 20%, температурным режим воды 41°С. На 10-й день эксперимента производили декапитацию животных с забором биологического материала (кровь, мышечная ткань), с последующей оценкой потребления кислорода работающими мышцами и кровью в различных аверсивных средах. Забор и подготовка биоматериала Биологическим материалом в работе служили скелетные мышцы и кровь. Скелетные мышцы гомогенизировали в механическом гомогенизаторе Поттера с добавлением HEPES-буфера. В результате, полученная популяция клеток подвергалась дифференциальному центрифугированию: сначала в режиме 3,500 g - 5 мин, затем супернатант переносился в другие пробирки, и центрифугирование повторялось, но в режиме 13000 g - 10 мин. Для проведения дальнейшего анализа отбиралась надосадочная жидкость [11]. Респирометрический анализ Потребление кислорода в культурах клеток производили с помощью лабораторного респирометра АКПМ1-01Л (Альфа Бассенс, Россия). Ход работы полностью соответствовал прилагаемой производителем инструкции к прибору. Методы статистической обработки Статистическую обработку проводили с помощью программы «STATISTICA 6.0». Межгрупповые различия анализировались параметрическими или непараметрическими методами, в зависимости от типа распределения. В качестве параметрического критерия использован критерий Стьюдента, непараметрического - U-критерий Манна-Уитни. Различия считались достоверными при p<0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ В результате проведенного экспериментального исследования в различных аверсивных средах было отмечено, что в группе интактных животных продолжительность плавания была неизменной на протяжении всех дней эксперимента (рисунок 1). Время плавания на 1-ый день в группе мышей НКх составляло 128,7±9,5 сек. Затем, начиная со второго дня эксперимента, продолжительность плавания животных повышалась линейно, при этом пик физической работоспособности был отмечен на пятый день плавания мышей с нагрузкой (161,3±11,0 сек). Продолжительность плавания пикового дня была выше на 25,3% (p<0,05) относительно исходного дня плавания данной группы. Однако с шестого дня эксперимента в группе мышей, подвергавшихся ежедневным физическим нагрузкам, наблюдалось незначительное снижение времени плавания, что было ниже относительно пикового дня плавания данной группы на 23,1% (p<0,05). Стоит отметить, что тенденция к заметному снижению плавания была отмечена, начиная с 7-го дня и до конца эксперимента (рисунок 1). Работоспособность мышей в тесте «принудительного плавания с нагрузкой» в группе НКх была ниже на 51,4% (p<0,05), относительно исходного плавания животных данной группы и на 56% (p<0,05) в сравнении с исходным временем работоспособности группы ИНх . На фоне ежедневного введения мышам препарата сравнения Метапрот® было отмечено линейное нарастание работоспособности. Максимальный день плавания животных был зафиксирован на 7-й экспериментальный день, что было выше, относительно работоспособности первого дня животных данной группы на 144,8% (p<0,05), относительно интактной группы на 140,3% (p<0,05) и относительно группы негативного контроля на 165,1% (p<0,05). В последующем наблюдалось незначительное плавное снижение работоспособности, при этом длительность плавания животных на 10-й экспериментальный день была больше, чем в группе интактных животных и группе негативного контроля на 54,7% (p<0,05) и 251,5% (p<0,05) соответственно. При оценке принудительного плавания мышей в горячей воде, было отмечено линейное нарастание работоспособности животных. Так, наибольшая работоспособность была отмечена на 4-й день эксперимента, что было выше на 73% (p<0,05) исходного времени плавания и на 140,7% (p<0,05) первоначального дня плавания группы интактных животных (рисунок 2). Начиная с 4-го экспериментального дня работоспособность животных начала существенно снижаться. Так, время плавания мышей на 7-й день эксперимента было ниже относительно пикового дня работоспособности группы негативного контроля на 56,4% (p<0,05) и ниже на 33,5% (p<0,05) в сравнении с ИНг группой животных. Необходимо отметить, что к 10-му экспериментальному дню работоспособность животных негативного контроля, подвергавшихся ежедневным физическим нагрузкам в горячей воде, была ниже в 2,8 раз (p<0,05) и 2,0 раза (p<0,05), в сравнении с исходным значением времени плавания мышей группы негативного контроля, и группы ИНг соответственно. В условиях истощающих физических нагрузок в группе мышей, получавших Метапрот®, было отмечено нарастание работоспособности с 1-го по 6-й экспериментальный день (пик плавания). Было установлено, что пик физической работоспособности был выше на 129,2% (p<0,05), относительно исходного времени плавания группы, получавшей Метапрот®. Стоит отметить, что продолжительность плавания пикового дня группы, получавшей Метапрот®, была выше в сравнении с интактной и группой негативного контроля на 193% (p<0,05) и на 110,6% (p<0,05) соответственно. Стоит отметить, что к концу эксперимента резких падений работоспособности отмечено не было. Плавание в последний - 1-й день в группе, получавшей Метапрот®, было дольше на 119% (p<0,05) и 330,2% (p<0,05) относительно 10-го дня интактной и группы негативного контроля. Как видно из рисунка 3, в группе животных негативного контроля в горячей воде потребление кислорода эритроцитами в сравнении с интактной группой статистически достоверно не отличалось. В группе животных, получавших Метапрот®, отличий оксигенации крови относительно интактных животных зафиксировано не было. В то время как потребление кислорода митохондриями поперечно-полосатой мускулатурой в группе животных негативного контроля было ниже в 1,8 раз (p<0,05) в сравнении с группой ИНг мышей. Отличий потребления кислорода мышцами в группе, получавшей Метапрот®, относительно интактной группы животных установлено не было. Однако, относительно группы негативного контроля данный показатель был выше в 2,6 раз (p<0,05). В группе мышей негативного контроля, где в качестве аверсивной среды выступала холодная вода, отмечено статистически значимое по отношению к интактной группе животных уменьшение потребления кислорода митохондриями мышц в 2,4 раза (p<0,05) и неизменный уровень оксигенации крови (рисунок 5, 6). Необходимо отметить, что потребление кислорода митохондриями поперечно-полосатых мышц в группе, получавшая Метапрот®, было выше, в сравнении с группой животных негативного контроля в 4,3 раза (p<0,05), что касается сравнения с группой интактных животных, то статистически значимых отличий не выявлено. На фоне «Принудительного плавания с нагрузкой» в холодной воде в группе мышей, получавшей препарат сравнения Метапрот®, уровень оксигенации крови не имел достоверных отличий от значения интактной группы. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Оптимальный уровень физической активности является одной из главных составляющих здорового образа жизни, обеспечивающего необходимое качество жизни населения [12]. Установлено, что у лиц, страдающих гиподинамией, отмечается повышенный риск развития сахарного диабета, артериальной гипертензии, онкопатологии, ожирения и психических расстройств (тревоги, панических атак, депрессии, когнитивного дефицита) [13]. Однако, чрезмерные, истощающие физические нагрузки, напротив, являются мощным стрессогенным фактором и могут способствовать существенному ухудшению качества жизни населения, развитию кардиоваскулярной патологии, снижению интенсивности иммунных реакций [14]. Стрессовое воздействие на организм человека усиливается характером неблагоприятной (аверсивной среды), усугубляющей действие стрессора на организм [15]. В условиях истощающих физических нагрузок действие аверсивной среды на организм оказывает влияние на изменение активности скелетной мускулатуры - основной составляющей оптимальной физической активности [7]. При этом основными компенсаторными механизмами в мышечной ткани в ответ на действие неблагоприятного средового фактора являются: увеличение потребления кислорода, активация белково-синтетических процессов, интенсификация метаболических реакций и активация метаботропных транспортных систем [6]. Однако по мере прогрессирующего мышечного утомления данные компенсаторные механизмы «отключаются», а увеличение потребление тканями кислорода не сопровождается увеличением энергетического выхода, что в свою очередь снижает активность поперечно-полосатой мускулатуры и общий уровень физической работоспособности [16]. В проведенном исследовании, посвященном оценке влияния характера аверсивной среды на уровень потребления кислорода в мышечной ткани и кислородную емкость крови, было установлено, что в группе животных негативного контроля, у которых в качестве аверсивной среды использовалась горячая вода (температура 41°С) наблюдалось изменение работоспособности: с пиком плавания мышей (4-й день - 70% (p<0,05)), относительно первоначального дня плавания мышей данной группы. Подобный характер изменения физической активности в группе мышей негативного контроля, предположительно может быть опосредован действием аверсивной среды (горячей воды) на активность скелетных мышц экспериментальных животных. В сложившихся условиях (горячая вода), вероятно, отмечается дилатация кровеносных сосудов поперечно-полосатых мышц, что, несмотря на возросшую потребность мышечной ткани в кислороде, увеличивает доставку к миоцитам скелетной мускулатуры кислорода и питательных веществ [17]. Кроме того, в литературных источниках приводятся сведения, что тепловое воздействие на скелетную мускулатуру, активирует метаболические процессы и препятствует мышечному утомлению [17, 18]. В дальнейшем наблюдалось падение уровня работоспособности, что было ниже в 2,8 раз (p<0,05) и 2,0 раза (p<0,05), относительно исходного значения времени плавания мышей группы негативного контроля, и интактной группы соответственно. Изменение в потреблении кислорода наблюдалось только митохондриями поперечно-полосатых мышц, что было ниже в 1,8 раза (p<0,05) в сравнении с интактной группой животных. Данный факт снижения работоспособности, вероятно, можно связать с тем, что неблагоприятная среда (горячая вода) может приводить к структурным изменениям в мышцах, а именно, к нарастанию повреждения белка, что, в свою очередь, может способствовать нарушению сократительной функции мышц [19]. В тоже время у группы мышей (негативный контроль), где в качестве аверсивной среды использовали холодную воду (температура 15°С) отмечено статистически значимое (к концу эксперимента) по отношению к интактной группе животных снижение продолжительности плавания, сопровождаемое уменьшением потребления кислорода митохондриями мышц, при неизменном уровне оксигенации крови. При этом на 5-й день эксперимента продолжительность плавания мышей в холодной воде увеличилась на 25,3% (p<0,05) относительно интактной группы. Полученные результаты могут быть связаны с особенностями действия пониженных температур на организм. Так, в работе Naresh C, et.al, 2017 показано, что воздействие низких температур на мышечную ткань вызывает в последней существенные метаболические изменения, сопровождаемые активацияей митохондриального разобщающего белка типа 1 (UCP-1) [20]. Активация UCP-1 в поперечно-полосатых миоцитах способствует снижению протонного градиента в митохондриальном матриксе, что в свою очередь ведет к интенсификации гликолиза, со сниженным образованием АТФ, сопровождаемого усилением термогенеза, что может способствовать сохранению мышечной активности и, следовательно, физической работоспособности [21]. Однако, данный компенсаторный механизм имеет краткосрочный эффект, и в последствии отмечен существенный спад физической активности (уменьшение продолжительности плавания мышей в холодной воде в сравнении с интактной группой животных на 105,9% (p<0,05) к 10-му дню эксперимента). При достаточной оксигенации крови (в холодной воде у мышей не наблюдалось снижения кислородтранспортной функции крови), гиперфункция белка UCP-1 способствует разобщению окисления и фосфорилирования в виду практической утраты протонного градиента митохондриального матрикса [22], что ведет к снижению утилизации кислорода скелетной мускулатурой и, как следствие, ухудшается синтез макроэргических соединений, одновременно происходит активация окислительного стресса, что негативно сказывается на уровне физической активности [23]. Можно предположить, что помимо активации термогенина UCP-1 в условиях воздействия на мышечную ткань холодных температур отмечается дисфункция метаботропных транспортных систем GLUT4 [24], а также снижается активность АМФ-активируемой киназы [25], что ухудшает поступление в миоциты поперечно-полосатой мускулатуры глюкозы и усугубляет энергодефицит. В условиях истощающих физических нагрузок, в группе животных, получавшая Метапрот®, было отмечено нарастание работоспособности, как в горячей (с 1-го по 6-й экспериментальный день (пик плавания), так и в холодной воде - максимальный результат плавания животных был отмечен на 7-й день. В дальнейшем, в обеих экспериментальных группах наблюдалось плавное снижение работоспособности. При этом, необходимо сказать, что оксигенация крови и мышечной ткани на фоне истощающих нагрузок в группе, получавшей Метапрот®, не отличалась от значений группы интактных животных в различных аверсивных средах. Повышение физической работоспособности животных на фоне применения Метапрота®, вероятно, можно связать с торможением распада гликогена, снижением теплопродукции, а также с активацией синтеза митохондриальных белков (ферменты глюконеогенеза) [26, 27]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, на основании полученных данных можно предположить, что в условиях принудительного плавания с отягощением у животных наиболее глубокие изменения функций поперечно-полосатой мускулатуры отмечаются в холодной воде (15°С), выступающей в роли стрессора, что отражается в снижении физической работоспособности, а также в снижении потребления кислорода мышечной тканью. Применение препарата Метапрот® способствовало корректировке возникших изменений физической работоспособности животных, что нашло свое отражение в ее повышении на 144,8% (p<0,05), в сравнении с исходным временем плавания данной группы, без увеличения потребления кислорода эритроцитами и митохондриями поперечно-полосатых мышц.

Об авторах

А. В. Воронков

Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России

Email: prohor77@mail.ru

А. Д. Геращенко

Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России

Email: anastasia_gerashchenko@mail.ru

Д. И. Поздняков

Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России

Email: pozdniackow.dmitry@yandex.ru

Д. В. Хусаинов

Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России

Список литературы

Дополнительные файлы