ИЗУЧЕНИЕ АНТИСЕКРЕТОРНОЙ АКТИВНОСТИ ДИНИТРАТА 2-ФЕНИЛ-9-ДИЭТИЛАМИНОЭТИЛИМИДАЗО[1,2-А] БЕНЗИМИДАЗОЛА МЕТОДОМ НЕПРЕРЫВНОЙ ПЕРФУЗИИ ЖЕЛУДКА КРЫС

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ На сегодняшний день актуальной проблемой современной клинической гастроэнтерологии представляется лечение кислотозависимых заболеваний, таких как гастро-эзофагеальная рефлюксная болезнь (ГЭРБ), язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, функциональная диспепсия [1-4]. В терапии кислотозависимых заболеваний основным патогенетическим принципом является подавление секреции соляной кислоты париетальными клетками слизистой оболочки желудка, что позволяет устранить или ослабить основные клинические проявления вышеуказанных заболеваний [5, 6]. Угнетение секреции HCl также в значительной степени устраняет проявления гастроинтестинальных осложнений при приеме нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП), антиагрегантов и антикоагулянтов, а при инфицировании Helicobacter pilory - повышать эффективность эрадикационной терапии путем повышения антихеликобактерной активности антибактериальных препаратов [7, 8]. В качестве антисекреторных средств используются блокаторы водородно-калиевой АТФ-азы (ингибиторы протонной помпы), антагонисты гистаминовых H2 -рецепторов, селективные М-холиноблокаторы, антациды, а также отчасти блокаторы гастриновых и холецистокининовых CCK-2-рецепторов [2, 4, 5, 9]. Безусловно, положительные эффекты препаратов, перечисленных групп, неоспоримы и все они широко применяются в терапии кислотозависимых заболеваний, однако им свойственны определенные недостатки и побочные эффекты. Антагонисты Н2 -гистаминовых рецепторов до введения в клиническую практику ингибиторов протонной помпы являлись «золотым стандартом» антисекреторной терапии [9]. Однако, наряду с резистентностью к их применению примерно у 1/5 больных с кислотозависимыми заболеваниями, отмечается быстрое развитие толерантности у прежде восприимчивых больных, синдром отмены. Помимо этого, побочные эффекты, характерные для этой группы препаратов, такие как снижение либидо, брадикардия, гепатотоксичность и другие, в значительной степени ограничивают прием и назначение этих средств [10-14]. Доказано, что долгосрочное лечение ингибиторами протонной помпы, может вызывать ряд нежелательных эффектов, таких как: дефицит магния, гипергастринемия и риск развития опухолей, дефицит витамина B12, острый интерстициальный нефрит, остеопороз и повышенный риск возникновения переломов, синдром избыточного бактериального роста в кишечнике, риск сердечно-сосудистых катастроф [15]. М-холиноблокаторы, в том числе селективные, такие как пирензепин обладают всем спектром побочных эффектов, характерных для «классических» неселективных средств, хотя и менее выраженных, таких как сухость слизистых оболочек, тахикардия, нарушение аккомодации и светобоязнь, атония кишечника и мочевого пузыря, головокружение, головная боль [11, 16-18]. Антацидные средства в современных условиях можно рассматривать только как дополнительные средства вспомогательной терапии кислотозависимых заболеваний [11]. В связи с этим остается актуальным поиск новых средств лечения кислотозависимых заболеваний, более безопасных, эффективных в отношении подавления кислотности и в тоже время доступных для потребителя. На сегодняшний день на фармацевтическом рынке представлен широкий спектр препаратов на основе производных бензимидазола, таких как противоязвенные средства, ингибиторы водородно-калиевой АТФазы - омепразол, лансопразол; антигистаминные средства - астемизол; антигипертензивные средства - телмисартан, кандесартан; антивирусные средства - энвирадин, марибавир; антипаразитические средства - альбендазол, оксфендазол и многие другие[19-22]. Это свидетельствует о значительной медицинской ценности данной группы химических веществ и обеспечивает высокий интерес к ним. Целью данного исследования являлось экспериментальное изучение антисекреторной активности субстанции и готовой лекарственной формы динитрата 2-фенил-9-диэтиламиноэтилимидазо[1,2-а] бензимидазола методом непрерывной перфузии желудка крыс. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Животные Исследования антисекреторной активности выполнено на аутбредных крысах линии Wistar обоего пола (возраст 10-12 недель) весом 180,0-250,0 г. Разброс по исходной массе животных в группе не превышал 10% [23]. Животные получены из ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово». Условия содержания животных соответствовали требованиям постановления Главного государственного санитарного врача РФ от 29.08.2014 №51 «Об утверждении СП 2.2.1.3218-14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)». Во время эксперимента животные содержались в контролируемых условиях: температура окружающего воздуха 20-26°C и 30-70% относительной влажности. Для размещения животных применяли макролоновые клетки, Т-3 (для крыс) оборудованные стальными решетчатыми крышками. В качестве подстилочного материала использовали древесные опилки. Животные находились на стандартном пищевом рационе со свободным доступом к корму (Полнорационный комбикорм рецепт ПК-120 для содержания лабораторных животных, ГОСТ Р 50258-92, производитель ООО «Лабораторкорм») и воде. Подстил, клетки и аксессуары, поилки для питья, менялись еженедельно. Манипуляции с экспериментальными животными выполнялись в соответствии с общепринятыми этическими нормами, принятыми Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (1986) и с учетом Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997) [24, 25]. Исследуемые вещества Исследуемая фармацевтическая субстанция динитрата 2-фенил-9-диэтиламиноэтилимидазо[1,2-а] бензимидазола представляет собой мелкокристаллический порошок белого или светло-серого цвета. Умеренно растворим в воде. Для исследований в качестве растворителя навески субстанции при внутрижелудочном введении использовали воду очищенную. Готовая лекарственная форма динитрата 2-фенил-9-диэтиламиноэтилимидазо[1,2-а]бензимидазола (ГЛФ) была представлена в виде таблеток, покрытых пленочной оболочкой, 60 мг, светло-зеленого цвета без запаха, двояковыпуклые. Для исследований брали навеску предварительно растертой в порошок готовой лекарственной формы или препаратов сравнения и растворяли в воде очищенной. Полученную суспензию вводили внутрижелудочно с помощью атравматичного зонда. Максимальный объем для внутрижелудочного введения крысам не превышал 3,0 мл для животных массой до 200 г, 5,0 мл для животных от 200 до 240 г и 6,0 мл для животных массой более 240 г. Препараты сравнения В качестве препарата сравнения в экспериментах по изучению базальной и стимулированной секреции фармацевтической субстанции была выбрана субстанция ранитидина (SigmaАldrich, США). При исследовании антисекреторного действия готовой лекарственной формы использовали Ранитидин (Хемофарм А.Д., Сербия, серия М703084). Дизайн исследования В первой серии экспериментов проводилась оценка влияния изучаемой субстанции в дозах 3 мг/кг, 10 мг/кг и 30 мг/кг на базальную и стимулированную гистамином секрецию соляной кислоты. В качестве объектов сравнения была использованы субстанция ранитидина 3 мг/кг, 10 мг/кг и 30 мг/кг (Sigma Аldrich, США). Полученные данные были использованы для расчета значения ЕD50 для субстанции динитрата 2-фенил-9-диэтиламиноэтилимидазо [1,2-а] бензимидазола. Далее при исследовании антисекреторной активности были использованы дозы ГЛФ, равные значениям ЕD50, а расчет доз препарата сравнения производился относительно терапевтической дозы для человека с учетом коэффициента межвидового переноса и составил 28 мг/кг. Контрольная группа животных получала растворитель (воду очищенную) в эквиобъемном вводимым препаратам количестве. Перед началом эксперимента животные подвергались 24-часовой пищевой депривации со свободным доступом к воде. После наркотизации хлоралгидратом (350 мг/кг) выполнялась срединная лапаротомия. Желудок выводился в операционную рану. Через разрез в проксимальной части двенадцатиперстной кишки вводилась канюля до уровня пилорического сфинктера и фиксировалась лигатурой. Вторая канюля вводилась в просвет желудка через разрез в кардиальной части и фиксировалась к нижнему пищевому сфинктеру. Желудок перфузировался через пищеводную канюлю 0,1 М фосфатным буферным раствором (рН 7,4, температура 37о С, на 100 мл буфера 77,4 мл 1М динатрия гидрофосфата и 22,6 мл 1М натрия дигидрофосфата) с помощью перистальтического насоса с постоянной скоростью 0,5 мл/мин. Образцы перфузата собирали из пилорической канюли. С целью исследования базальной секреции собиралось 3 образца перфузата с 20-минутным интервалом в течение 1 часа. Исследуемая субстанция вводилась через зонд внутрижелудочно за 1 час до начала сбора образцов. ГЛФ вводилась через зонд внутрижелудочно за 2 часа до начала сбора образцов. Содержание кислоты в перфузате определялось титрованием 0,01М раствором натрия гидроксида. Величину кислотности определяли в пересчете на дебит-час хлористоводородной кислоты. С целью определения стимулированной секреции непосредственно перед началом сбора образцов перфузата подкожно вводился гистамина дигидрохлорид в дозе 5 мг/кг. Подкожное введение осуществлялось стерильными шприцами. Исследуемая субстанция вводились за 1 час до сбора образцов перфузата внутрижелудочно через зонд. Содержание кислоты в перфузате определялось титрованием 0,01М раствором натрия гидроксида. Величину кислотности определяли в пересчете на дебит-час хлористоводородной кислоты. Расчет дебит-часа хлористоводородной кислоты Dч=V1 *E1 *0,001+V2 *E2 *0,001+V3 *E3 *0,001 где Dч - дебит-час соляной кислоты, ммоль; V - объем порции желудочного содержимого, мл; E - концентрация свободной соляной кислоты той же порции в титрационных единицах; 0,001 - количество хлористоводородной кислоты в 1 мл желудочного содержимого при концентрации ее, равной 1 ммоль/л. Определяемые показатели Для оценки антисекреторного действия определяли содержание соляной кислоты желудочного сока в условиях базальной и стимулированной гистамином секреции (общая кислотность), расчет дебит-часа хлористоводородной кислоты. По результатам исследования рассчитаны величины ЕД50 для изучаемой субстанции, готовой лекарственной формы и ранитидина. Статистическая обработка Полученные экспериментальные данные анализировались с использованием метода вариационной статистики. В итоговых таблицах представлены средние значения по группе (М) и стандартная ошибка среднего значения (m). Межгрупповые различия анализировались с помощью непараметрического критерия - U-критерий Манна-Уитни. Различия определялись при 0,05 уровне значимости. Для статистической обработки результатов использовали пакет программ «StatPlus 2009». Результаты Анализ экспериментальных данных показал, что исследуемая субстанция в дозе 10 мг/кг и 30 мг/кг достоверно относительно контроля снижала базальную секрецию соляной кислоты на 35% и 54% соответственно. Введение субстанции в дозе 3 мг/кг достоверно не влияло на базальную секрецию соляной кислоты. Ранитидин, в аналогичных исследуемой субстанции дозах, также способствовал достоверному относительно контроля подавлению секреции на 22% и 29% соответственно. При этом субстанция исследуемого вещества в дозе 30 мг/кг достоверно более эффективно снижала базальную секрецию относительно ранитидина (табл. 1). Данные, отражающие процент снижения базальной секреции относительно контроля позволили рассчитать значения ЕD50 для исследуемой субстанции и ранитидина (Рис. 1, 2). Расчетные данные составили для исследуемой субстанции - 26 мг/кг, а для ранитидина - 54,0 мг/кг. Готовая лекарственная форма в дозе 26 мг/кг способствовала снижению базального уровня секреции достоверно относительно контроля на 33%. Полученные результаты достоверны относительно контроля и значений группы, получавшей ранитидин в дозе 28 мг/кг (табл. 2). По результатам исследования стимулированной гистамином секреции установлено, что введение гистамина увеличивало выработку соляной кислоты в 1,8 раз относительно базального уровня. Исследуемая субстанция достоверно подавляла секрецию соляной кислоты во всех изучаемых дозах, при этом, в дозе 30 мг/кг секреция снижалась на 80%, в то время как ранитидин ингибировал секрецию на 56%, что статистически достоверно. Изучаемая субстанция и ранитидин в дозе 10 мг/кг также способствовали достоверному относительно контроля подавлению кислотопродукции, однако достоверных межгрупповых различий не наблюдалось. Введение дозы 3 мг/кг не оказывало ожидаемого фармакологического эффекта как в опытной группе, так и в группе сравнения (табл. 3). Значение ЕD50 рассчитывалось по уравнению тренда и для исследуемой субстанции составило 13,0 мг/кг (Рис. 3), а для ранитидина составило 23,6 мг/кг (Рис. 4). По результатам исследования стимулированной гистамином секреции установлено, что ГЛФ динитрата 2-фенил-9-диэтиламиноэтилимидазо[1,2-а]бензимидазола в дозе 26 мг/кг достоверно подавляла секрецию соляной кислоты на 66%, в то время как ранитидин на 52%. (Табл. 4). ОБСУЖДЕНИЕ Бензимидазол содержит два вида атомов азота (пиррольного и пиридинового типа), выступающих в роли как донора, так и акцептора протона, и существует в двух таутомерных формах. Бензимидазольный бицикл может не только присоединять или отдавать протон, но также легко вступать в различные невалентные взаимодействия (водородные связи, Ван-дер-Ваальсовы взаимодействия, стэкинг-взаимодействия). Эти особенности строения бензимидазольной молекулы обуславливают возможность ее связывания с разнообразными терапевтическими мишенями, обеспечивая широкий спектр биологической активности производных бензимидазола. Спектр биологической активности производных бензимидазолов включает противовирусную [26], противогрибковую [27], антимикробную [28], противораковую [29], антигельминтную [30], анальгетическую и жаропонижающую [31], антидиабетическую [32], антипротозойную [33], антиоксидантную [34], противоконвульсивную [27], антипсихотическую [35], противоязвенную [36], анестезирующую [37] и другие виды активности. Значительная медицинская ценность бензимидазолсодержащих препаратов обеспечивает высокий интерес и интенсивное развитие данного направления в фармакологии. Анализ полученных в ходе эксперимента данных позволил установить, что исследуемая субстанция динитрата 2-фенил-9-диэтиламиноэтилимидазо[1,2-а] бензимидазола способна подавлять базальную и стимулированную гистамином секрецию соляной кислоты на модели непрерывной перфузии желудка. Результаты согласуются с выявленным в процессе комплексного исследования специфической фармакологической активности Н2 -гистаминоблокирующим действием изучаемого соединения при исследовании данного рецепторного эффекта на изолированных тканях предсердий. Однако, с учетом того, что рецепторный эффект не превосходил показатели ранитидина, полученные in vivo результаты, демонстрирующие более выраженное подавление кислотопродукции, могут быть связаны с наличием дополнительных механизмов влияния на секрецию соляной кислоты, что создает предпосылки для дальнейших исследований. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, субстанция динитрата 2-фенил-9-диэтиламиноэтилимидазо[1,2-а]бензимидазола в дозе 30 мг/кг и готовая лекарственная форма в дозах, равных ED50 обладает антисекреторной активностью, статистически достоверно превосходящей эффект известного Н2-гистаминоблокатора ранитидина в среднем в 2 раза, как на уровне базальной, так и стимулированной гистамином секреции. Готовая лекарственная форма в используемых дозах проявила в целом сопоставимый фармакологический эффект по сравнению с данными, полученными при исследовании субстанции, с поправкой на расчетный характер значений ED50. Полученные результаты служат достаточным обоснованием для дальнейшего изучения возможности использования субстанции и готовой лекарственной формы динитрата 2-фенил-9-диэтиламиноэтилимидазо[1,2-а]бензимидазола в качестве эффективного фармакотерапевтического средства при кислотозависимых заболеваниях желудочно-кишечного тракта.

Об авторах

М. В. Черников

Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: pharmax@list.ru

М. А. Оганова

Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: marina-oganova81@mail.ru

А. С. Герасименко

Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: ger_ann5@ro.ru

Е. А. Артемьев

Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: johni1001@rambler.ru

Список литературы

Дополнительные файлы