ISOLYQUIRITIGENIN AFFECTS PHAGOCYTES FUNCTIONS AND INCREASES MICE SURVIVAL RATE IN STAPHYLOCOCCAL INFECTION

Full Text

ВВЕДЕНИЕРаспознавание и элиминация микробных патоге-нов макроорганизмом происходит за счет активации врожденного и адаптивного звеньев иммунитета. Врожденный иммунитет предупреждает внедрение микробов в ткани и способен удалить их до включения механизмов приобретенного иммунитета. Врожден-ные иммунные реакции на патоген практически мо-ментальные и основаны преимущественно на реак-циях воспаления и фагоцитоза, тогда как адаптивный иммунный ответ включается лишь через несколько дней (оптимально - 7-14 дней), так как требует про-лиферации и дифференцировки лимфоцитов.Значительная бактериальная нагрузка в модели острой бактериальной инфекции вызывает леталь-ный исход лабораторных животных в течение первых дней наблюдения. Такая модель инфекции позволя-ет оценить не только антибактериальные эффекты исследуемых соединений, но и его влияние на функ-ции эффекторов врожденного иммунитета [1], среди которых фагоциты играют важнейшую роль.Полифенольные соединения высших растений (флавоноиды) обладают широким спектром биоло-гической активности, в том числе антимикробными и иммуномодулирующими эффектами [2]. Так, напри-мер, парентеральное введение флавоноидов корня солодки повышает резистентность мышей к острой стафилококковой инфекции в таких дозах, которые значимо не влияли на функции эффекторов врожден-ного иммунитета [3], но предотвращали активацию и пролиферативный ответ лимфоцитов [4]. Из корней солодки выделены десятки различных флавоноидов, одним из основных является изоликвиритигенин (ИЛГ). ИЛГ в различных концентрациях проявляет ан-тибактериальные свойства, влияет на пролиферацию лимфоцитов и секрецию ими цитокинов на ранних этапах иммунного ответа при стафилококковой ин-фекции у мышей [2]. ЦЕЛЬ. Изучение влияния ИЛГ на функцию челове-ческих и мышиных фагоцитов, а также его эффектив-ности в модели стафилококковой инфекции у мышей.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫТестируемый агентВ качестве тестируемого вещества использовали ИЛГ (чистота 98%, Xi’An YiyangBio-Tech Co., Китай). В экспериментах использовали раствор ИЛГ в диме-тилсульфоксиде (ДМСО, Panreac, Испания) так, чтобы in vitro конечная концентрация растворителя в опыт-ных образцах не превышала 1%. Учитывая, что МПК ИЛГ в отношении S. aureus J49 ATCC 25923 64 мкг/мл [5], для экспериментов in vitro использовали ИЛГ в диапазоне концентраций 16-128 мкг/мл. В серии экс-периментов in vivo матричный раствор ИЛГ в ДМСО разводили в фосфатно-солевом буфере (pH=7,4, PanEcoLLC, Россия), вводили внутрибрюшинно в объ-еме 0,5 мл в виде истинного раствора с концентраци-ей ДМСО не более 5%. Учитывая низкую токсичность и биодоступность ИЛГ [2], в экспериментах in vivoИЛГ вводили внутрибрюшинно в суммарной дозе 30 мг/кг. Контрольным образцам/группам вместо ИЛГ вводили соответствующие объемы/концентрации растворителя.Бактериальный штамм и условияего культивированияКультивирование штамма S. aureus J49 ATCC 25923 (ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицин- 141 RESEARCH ARTICLEVolume IX, Issue 2, 2021ского применения» Минздрава России (г. Москва, Россия)) осуществляли в бульоне Мюллера-Хинтона (Medicaplus LLS, Россия) при 37°C в стеклянных аэри-руемых флаконах. Для экспериментов in vitro и in vivo из ночной бактериальной культуры, находящейся в средней log-фазе, готовили разведения для культиви-рования и внутрибрюшинного введения животным. Для подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ) из-меряли оптическую плотность (OD) бактериальной суспензии при 630 нм в микропланшетном фотометре (ImmunoChem 2100, США) с использованием стандар-та МакФарланда, исходя из соотношения: 1 оптиче-ская единица OD630 = 8,5×108 КОЕ/мл.Экспериментальные животныеМыши Balb/С (самцы, 20-22 г, 6-8 недель) были получены от научно-производственного предприя-тия «Питомник лабораторных животных» Институ-та биологии Российской академии наук (г. Пущино, Россия). Уход за животными и обращение с ними осуществляли в соответствии с принципами ARRIVE [6]. Животные содержались при свободном доступе к воде и пище. Для экспериментов мыши случайным образом распределялись на группы по 8 особей. Вы-ведение из эксперимента осуществляли без наркоза путем декапитации или цервикальной дислокации. При выполнении экспериментов были соблюдены положения Хельсинкской декларации (Бразилия, 2013 г.), протокол данных экспериментов был одо-брен этическим комитетом ФГБОУ ВО «Чувашский государственный университет им. И.Н. Ульянова» (протокол No 20-04 от 17.04.2020 г.).Получение крови здоровых добровольцевДля определения поглотительной активности фа-гоцитов крови человека и продукции ими активных форм кислорода в день эксперимента производили забор крови в гепаринизированные пробирки у здо-ровых добровольцев (60 человек) в возрасте 18-25 лет после получения добровольного информирован-ного согласия. Протокол данных экспериментов был одобрен этическим комитетом ФГБОУ ВО «Чуваш-ский государственный университет им. И.Н. Ульяно-ва» (протокол No 20-04 от 17.04.2020 г.).Получение флюоресцеинизотиоцианат-меченого S. aureusДля инактивации S. aureus J49 ATCC 25923 осу-ществляли экспозицию ночной бактериальной куль-туры на водяной бане при 95ºC в течение 30-40 ми-нут, затем центрифугировали (1000 g, 25 мин.) [7]. Убитые осажденные бактерии однократно отмывали карбонатно-бикарбонатным буфером (0,1 М, pH 9,5) и готовили клеточную суспензию с концентрацией бактерий 2×108 микробных тел на 1 мл. К инакти-вированной бактериальной суспензии добавляли флюоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ), растворенный в ДМСО, из расчета 0,05 мг на 108 бактерий с последую-щей инкубацией в течение 1 ч. при комнатной темпе-ратуре без доступа света. Затем инактивированные бактериальные клетки трехкратно отмывали фосфат-но-солевым буфером центрифугированием (1000 g, 10 мин.) и готовили разведение взвеси ФИТЦ-мече-ных бактерий до концентрации 5×108 микробных тел на 1 мл. Аликвоты хранили при температуре -70ºС.Модель инфекции S. aureus у мышейСуспензию S. aureus в фосфатно-солевом буфе-ре вводили внутрибрюшинно 109 КОЕ/мышь. День заражения считали нулевым днем эксперимента. Выживание мышей оценивали каждые 6 ч. в первый день; со второго дня и в последующие 20 дней экс-перимента - ежедневно. Экспериментальным жи-вотным перед заражением вводили ИЛГ (общая доза 30 мг/кг, трехкратно через 4 ч., внутрибрюшинно). В качестве референта животным контрольной группы вводили соответствующие объемы и концентрации растворителя.Оценка хемотаксиса фагоцитовДля оценки миграции фагоцитов в брюшную по-лость руководствовались методикой, предложенной Miyazaki [8]. Экспериментальные животные были разделены на 4 группы, которые получали: группа 1 (отрицательный контроль) - стерильный фосфат-но-солевой буфер трехкратно (0,5 мл, внутрибрю-шинно); группа 2 - стерильный раствор пептона в фосфатно-солевом буфере (3% - 3 мл, внутрибрюш-инно); группа 3 - трехкратно растворитель (5% - 0,5 мл, внутрибрюшинно), затем - стерильный раствор пептона в фосфатно-солевом буфере (3% - 3 мл, вну-трибрюшинно); группа 4 - ИЛГ (внутрибрюшинно, трехкратно), затем стерильный раствор пептона в фосфатно-солевом буфере (3% - 3 мл, внутрибрю-шинно). Спустя 24 ч. и 72 ч. животных выводили из эксперимента и внутрибрюшинно вводили по 20 мл фосфатно-солевого-буфера. Полученные после паль-паторного массирования брюшка промывные воды отбирали в пластиковые пробирки для последующе-го центрифугирования. Осажденные клетки подсчи-тывали в камере Горяева. После рассчитывали ин-декс стимуляции как отношение количества клеток в группах, получавших пептон, к числу клеток в группе отрицательного контроля.Оценка поглотительной активности фагоцитовОценку поглотительной активности фагоцитов осуществляли с использованием проточной цито-метрии [7]. Для этого к образцам гепаринизирован-ной крови человека добавляли ИЛГ в концентра-циях 16-128 мкг/мл. Экспериментальные образцы культивировали 30 минут (t=37ºC, φ=100%, СО2 = 5%). Затем к образцам добавляли ФИТЦ-меченый S. aureus и продолжали инкубацию также в течение 30 минут (t=37ºC, φ=100%, СО2=5%). По истечению вре-мени инкубации для лизиса эритроцитов добавля-ли лизирующий раствор (Backman Coulter, USA) и DOI: 10.19163/2307-9266-2021-9-2-139-148 142ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯISSN 2307-9266 e-ISSN 2413-2241Том 9, Выпуск 2, 2021инкубировали 10 минут. Образцы анализировали на проточном цитометре Cytomics FC500 (Backman Coulter, USA) и рассчитывали фагоцитарный индекс (количество фагоцитов, поглотивших ФИТЦ-мечен-ные бактерии, к общему числу фагоцитов), а также интенсивность флуоресценции.Оценка продукции активных формкислорода фагоцитамиОценку продукции активных форм кислоро-да фагоцитами осуществляли с использованием проточной цитометрии [7]. Для постановки теста форбол-12-миристат-13-ацетат(ФМА)-индуци-рованного «кислородного взрыва» к образцам гепаринизированной крови человека, предвари-тельно инкубированным с ИЛГ в концентрациях 16-128 мкг/мл 30 минут (условия инкубации: t=37°C; φ=100%; СО2=5%), добавляли ФМА (0,1 мкг/мл, об-разцы с активированными фагоцитами) или 0,2% ЭДТА (контрольные, не стимулированные образцы фагоцитов <1% ДМСО) и инкубировали 10 минут. После инкубации к образцам добавляли флуоро-генный субстрат дигидрородамин 123 (ДГР 123) и инкубировали еще в течение 10 минут. Лизирован-ные образцы крови анализировали на проточном цитометре Cytomics FC500 (Backman Coulter, USA) определяли процент активированных нейтрофи-лов и моноцитов, а также показатели спонтанной и стимулированной интенсивности флуоресценции.Статистический анализВсе эксперименты были выполнены не менее, чем в трех повторениях. Полученные данные были статистически обработаны с помощью программно-го обеспечения GraphPadPrism 8.4.0. Для оценки ди-намики гибели мышей строили кривые Каплан-Мей-ера. Полученные результаты подчинялись закону нормального распределения, обрабатывались мето-дами вариационной статистики и представлялись в виде среднего арифметического значения (M) ± стан-дартной ошибки среднего (SEM). Достоверность раз-личий между группами в экспериментах определяли по критерию Стьюдента, проводя парное сравнение. Различия считались достоверными при р<0,05, где р - уровень значимости. РЕЗУЛЬТАТЫВлияние ИЛГ на выживаемость мышей Balb/C при заражении S. Aureus J49 ATCC 25923Установлено, что при заражении 109 КОЕ/мышь в обеих экспериментальных группах на второй день эксперимента отмечалось начало гибели живот-ных. В контрольной группе смертность нарастала более динамично, и к 4-му дню выживаемость со-ставила лишь 17,0±7,6% (рис. 1). В группе, полу-чавшей предварительные инъекции ИЛГ в дозе 30 мг/кг, выживаемость была достоверно выше и на 7-й день эксперимента составила 67,0±16,5% (p <0,05).Влияние ИЛГ на пептон-индуцированную миграцию фагоцитов в брюшную полость мышей Миграцию фагоцитов в брюшную полость оцени-вали, рассчитывая индекс стимуляции - количество клеток, стимулированных внутрибрюшинной инъ-екцией пептона, относительно фосфатно-солевого буфера. Индексы стимуляции у мышей, получавших ИЛГ, и контрольных животных, стимулированных пептоном, достоверно не отличались друг от друга (рис. 2). Так, через 24 ч. индекс стимуляции в кон-трольной группе составлял 2,4±0,1 против 2,0±0,1 группы, получавшей ИЛГ; через 72 ч. значения ин-декса стимуляции характеризовались значениями 1,6±0,1 (контрольная группа) по сравнению с 1,8±0,1 (группа, получавшая ИЛГ).Влияние ИЛГ на поглотительную активность фагоцитов крови человекаИзучение влияния ИЛГ на поглотительную ак-тивность фагоцитов проводилось цитофлуориме-трическим методом. Было показало, что предва-рительная обработка фагоцитов ИЛГ in vitro не приводит к достоверному изменению процента фа-гоцитирующих нейтрофилов и моноцитов по срав-нению с контролем (табл. 1). В контрольных образ-цах фагоцитарный индекс у нейтрофилов составил 93,9±6,0%, а у моноцитов - 73,9±14,1%. В концен-трации ИЛГ 128 мкг/мл наблюдалась недостовер-ная тенденция к снижению фагоцитарного индекса-нейтрофилов (92,5±5,5%) и моноцитов (64,1±13,7%). Однако при оценке интенсивности флуоресценции показано, что в сравнении с контролем в образцах с добавлением ИЛГ происходит увеличение доли флуоресцирующих нейтрофилов (184,8±44,8 Ед про-тив 145,5±41,1 Ед) и моноцитов (58,5±17,2 Ед против 64,1±18,1 Ед).Влияние ИЛГ на продукцию АФК фагоцитами крови человекаБыло оценено влияние ИЛГ на продукцию АФК фагоцитами без их активации ФМА (табл. 2). При этом в отсутствии ИЛГ доля флуоресцирующих ней-трофилов (3,9±1,8%) и моноцитов (3,0±2,0%) была очень низкой. По сравнению с контрольными пока-зателями добавление ИЛГ дозозависимо увеличива-ло долю флуоресцирующих нейтрофилов в концен-трациях 128 мкг/мл (100,0±0,1%; р<0,05), 64 мкг/мл (99,6±0,5%; р<0,05), 16 мкг/мл (34,7±8,9%; р<0,05), а в концентрациях 128 мкг/мл (86,2±11,7%; p<0,05), 64 мкг/мл (47,2±18,7%; p<0,05) - процент флуорес-цирующих моноцитов (рис. 3). В то же время интен-сивность флуоресценции нейтрофилов достоверно отличалась от показателей контроля (2,5±0,3 Ед) в присутствии ИЛГ 128 мкг/мл (6,6±1,6 Ед; р<0,05), 64 мкг/мл (3,8±0,2 Ед; p<0,05), а моноцитов - при 128 мкг/мл (3,0±0,15 Ед; р<0,05). 143 RESEARCH ARTICLEVolume IX, Issue 2, 2021Рисунок 1 - Выживаемость мышей Balb/C, зараженных S. aureus J49 ATCC 25923Примечание: группа А - контроль, 109 КОЕ/мышь; группа В - предварительное введение ИЛГ (30 мг/кг), 109 КОЕ/мышь1,81,62,42,00,00,51,01,52,02,53,024 ч.72 ч.Индекс стимуляции, ед.АВРисунок 2 - Влияние ИЛГ на миграцию фагоцитов в брюшную полость мышей Balb/CПримечание: А - контроль; В - ИЛГТаблица 1 - Влияние ИЛГ на показатели фагоцитарного индекса (%) и интенсивности флуоресценции (ЕД) нейтрофилов и моноцитов крови человекаФагоцитыКонтроль128 мкг/мл64 мкг/мл16 мкг/млНейтрофилы%93,9±6,092,5±5,592,1±7,695,6±2,4Ед.145,5±41,1184,8±44,8 *129,1±55,6118,1±40,5Моноциты%73,9±14,164,1±13,771,4±11,271,4±11,4Ед.64,1±18,158,5±17,2 *51,4±21,945,4±15,4 Примечание: * - достоверные изменения при р <0,05DOI: 10.19163/2307-9266-2021-9-2-139-148 144ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯISSN 2307-9266 e-ISSN 2413-2241Том 9, Выпуск 2, 2021Таблица 2 - Влияние ИЛГ на продукцию АФК нейтрофилами и макрофагами/моноцитами крови человекаКонтрольИЛГ128 мкг/мл64 мкг/мл16 мкг/млНейтрофилыАктивацияФМА%93,3±14,9100,0±0,199,9±0,199,5±0,4Ед11,3±3,715,8±3,0 *14,8±4,2 *14,1±5,2БезактивацииФМА%3,9±1,8100,0±0,1 *99,6±0,5 *34,7±8,9 *Ед2,5±0,36,6±1,6 *3,8±0,2 *2,1±0,2МоноцитыАктивацияФМА%44,5±27,297,8±1,8 *88,1±7,8 *62,7±17,7Ед3,4±0,76,0±1,3 *4,6±1,1*4,0±1,0БезактивацииФМА%3,0±2,086,2±11,7 *47,2±18,7 *4,6±2,4Ед2,3±0,53,0±0,15 *2,3±0,22,4±0,7Примечание: Ед - единицы интенсивности флуоресценции; * - достоверные изменения при р <0,05АВСКонтрольбезактивацииФМАКонтрольсактивациейФМАИЛГ = 128 мкг/млбезактивацииФМАИЛГ = 128 мкг/млсактивациейФМАРисунок 3 - Распределение клеток крови по боковому светорассеянию (А) и гистограммы флуоресценции, соответствующие гейтам нейтрофилов (красный) и макрофагов/моноцитов (зеленый) (В, С) 145 RESEARCH ARTICLEVolume IX, Issue 2, 2021Также было изучено влияние ИЛГ на способ-ность человеческих фагоцитов продуцировать АФК в ответ на активатор протеинкиназы С - ФМА. В кон-трольных образцах количество нейтрофилов, проду-цировавших АФК, составило 93,3±14,9%, моноцитов - 44,5±27,2% (табл. 2). В присутствии ИЛГ в концен-трациях 128 мкг/мл, 64 мкг/мл и 16 мкг/мл наблю-далась незначимая тенденция к дозозависимому увеличению доли флуоресцирующих нейтрофилов: 100,0±0,1% (р=0,07), 99,9±0,1% (р=0,07) и 99,5±0,4% (р=0,08) соответственно (рис. 2). По сравнению с контрольными образцами (11,3±3,7 Ед) в присут-ствии ИЛГ в концентрациях 128 мкг/мл (15,8±3,0 Ед, р<0,05) и 64 мкг/мл (14,8±4,2 Ед, р<0,05) отмечено достоверное увеличение интенсивности флуорес-ценции, а в концентрации 16 мкг/мл - наблюдалась лишь тенденция к таковому (14,1±5,2 Ед, р=0,09).При оценке функций моноцитов в присутствии ИЛГ в кон-центрациях 128 мкг/мл (97,8±1,8%, p<0,05), 64 мкг/мл (88,1±7,8%, p<0,05) наблюдалась дозозависимое значимое увеличению количества флуоресцирую-щих клеток по сравнению с контрольными значе-ниями (44,5±27,2 Ед). Данные по повышению доли флуоресцирующих моноцитов при экспозиции с ИЛГ в концентрациях 64-128 мкг/мл были сопоставимы с дозозависимым увеличением степени их флуорес-ценции (табл. 2).ОБСУЖДЕНИЕНастоящее исследование посвящено изучению влияния ИЛГ на некоторые механизмы врожденно-го иммунитета (функции фагоцитов) как возможных факторов, влияющих на выживаемость в ранние сроки бактериальной инфекции. Парентеральное введение ИЛГ до заражения мышей повышало вы-живаемость экспериментальных животных в моде-ли стафилококкового сепсиса и септического шока, когда на фоне выраженной бактериальной нагруз-ки 1,5×109 КОЕ/мышь животные погибали в первые 24-48 ч [5]. В настоящем эксперименте, при инфи-цирующей дозе 109 КОЕ/мышь, динамика гибели отличалась (животные погибали позже), но предва-рительное внутрибрюшинное введение ИЛГ также было эффективным и увеличивало продолжитель-ность жизни мышей линии Balb/С. В экспериментах установлено, что ИЛГ обладает антибактериальной активностью [5]. Однако анти-бактериальная активность проявляется при достаточ-но больших концентрациях (64 мкг/мл), вероятность достижения и поддержания которой в биологиче-ских жидкостях/очагах инфекции в условиях in vivoнизкая, тем более что ИЛГ имеет довольно короткий период полувыведения [9, 10]. Учитывая эти особен-ности, в настоящей работе был сделан акцент на изу-чение влияния ИЛГ на функции фагоцитов.Фагоциты представляют собой эффекторные клетки врожденного иммунитета, осуществляющие первую линию защиты при инвазии инфекционных патогенов. Основными этапами фагоцитарных ре-акций являются хемотаксис, поглощение, киллинг и переваривание инфекционного патогена. Влияние на хемотаксис было изучено в модели, индуциро-ванной пептоном, миграции фагоцитов в брюшную полость мышей [8]. Выявлено, что ИЛГ не оказывает подавляющего влияния на миграцию фагоцитов как через 24 ч. (хемотаксис преимущественно нейтрофи-лов), так и через 72 ч. (хемотаксис преимущественно макрофагов).Поглощение фагоцитами инфекционного аген-та реализуется за счет таких механизмов, как: сбли-жение фагоцита и патогена; установление контакта; подготовка к погружению; обволакивание патогена; замыкание мембраны; поглощение объекта. Данные этапы суммарно оценивались с применением ци-тометрического метода и ФИТЦ-меченых бактерий. В качестве бактериального агента для фагоцитоза использовали коллекционный штамм S. aureus J49 ATCC 25923. В исследуемом диапазоне концентраций (16-128 мкг/мл) ИЛГ не снижал долю нейтрофилов и моноцитов, способных поглощать бактериальные клетки. Однако интенсивность флуоресценции мо-ноцитов при экспозиции с некоторыми концентра-циями ИЛГ имела тенденцию к снижению. Но дан-ный факт не является значимым, так как в больших концентрациях ИЛГ способен реализовывать прямую антибактериальную активность. Таким образом, внутрибрюшинное введение ИЛГ в суммарной дозе 30 мг/кг значимо не влияет на хемотаксис нейтрофилов и макрофагов в ответ на стандартный активатор миграции пептон у мышей Balb/С, а также в диапазоне концентраций 16-128 мкг/мл не ингибирует поглотительную функцию ней-трофилов и моноцитов крови человека в отношении штамма S. aureus J49 ATCC 25923. Следует отметить, что в указанных концентрациях ИЛГ выражено ин-гибирует пролиферацию митоген-активированных T-лимфоцитов [5], что свидетельствует о том, что ИЛГ проявляет селективные супрессивные свойства в от-ношении эффекторов адаптивного иммунитета, не затрагивая основные врожденные иммунные реак-ции фагоцитов.Киллинг и переваривание фагоцитами бактери-альных патогенов происходят за счет кислородно-го (продукция АФК) и азотного метаболизма. АФК - группа высокореактивных кислородсодержащих химических веществ, связанных не только с патоло-гическими (хроническое воспаление, патологическая пролиферация клеток) [11], но и с физиологически-ми процессами (выживание, рост, пролиферация и дифференциация клеток, иммунный ответ) [12]. В частности, важным звеном в реализации врожден-ных иммунных реакций является запуск массивной продукции АФК («кислородный взрыв») в фагоци-тах. Инициирует начало «кислородного взрыва» DOI: 10.19163/2307-9266-2021-9-2-139-148 146ОРИГИНАЛːНА˔ СТАТː˔ISSN 2307-9266 e-ISSN 2413-2241Том 9, Выпуск 2, 2021никотинамидадениндинуклеотидфосфатоксидаза (НАДФН-оксидаза) (в фагоцитах основной изофор-мой является НАДФН-оксидаза 2 типа) [13], актива-ция которой может происходить в сигнальном каска-де, связанном с протеинкиназой С, форболовыми эфирами (например, ФМА) [14]. В связи с этим влия-ние ИЛГ на переваривающую способность фагоцитов оценивали по продукции АФК нейтрофилами и мо-ноцитами с применением флуорогенного субстрата ДГР 123, который взаимодействует с АФК с образо-ванием флуорохрома родамина 123. Интенсивность «кислородного взрыва» оценивалась при помощи проточной цитометрии. В ходе экспериментов уста-новлено, что добавление ИЛГ (16-128 мкг/мл) даже к не активированным ФМА клеткам дозозависимо увеличивало долю флуоресцирующих нейтрофилов и моноцитов, а также интенсивность флуоресценции по сравнению с контрольными пробами, что свиде-тельствует о накоплении АФК в фагоцитах. Добавле-ние ИЛГ к ФМА-активированным фагоцитам также увеличивало продукцию АФК в сравнении с ФМА-ак-тивацией без экспозиции с ИЛГ. При этом наблюда-лись суммационные эффекты по показателю интен-сивности флуоресценции. Так, сумма интенсивности флуоресценции ФМА-активированных нейтрофилов (11,3±3,7 Ед) и нейтрофилов, не активированных ФМА, но инкубированных с ИЛГ (128 мкг/мл) (6,6±1,6 Ед), сопоставима со значениями интенсивности флу-оресценции ФМА-активированных нейтрофилов, инкубированных с ИЛГ в дозе 128 мкг/мл (15,8±3,0 Ед). Аналогичная суммация эффекта выявлена в об-разцах моноцитов.С другой стороны, флавоноиды хорошо известны как антиоксиданты, которые могут снижать продук-цию АФК фагоцитами. Так, например, ресвератрол подавляет активность НАДФН-оксидазы, миелоперок-сидазы и, как следствие, образование хлорноватистой кислоты [15]. АФК участвуют в реализации одного из механизмов врожденного иммунного ответа - фор-мировании «нейтрофильных ловушек» (НЛ) [16]. Ак-тивированные бактериями (S. aureus и E. coli) либо химическими веществами (ФМА) нейтрофилы произ-водят АФК и образуют нейтрофильные внеклеточные конгломераты, которые направлены на сдерживание бактериальное диссеминирования из очага инфекции [17]. Однако имеются данные, что чрезмерная актива-ция НЛ ухудшает микроциркуляцию в очаге воспале-ния [18, 19]. Продемонстрировано, что флавоноиды (эпикатехин, катехин-гидрат и тригидрат рутина, а также лютеолин, кемпферол) подавляют образование АФК-зависимых НЛ [20, 21], а ресвератрол улучшает функции легких во время острых инфекций дыхатель-ных путей или хронических воспалительных заболева-ний легких [22].В некоторых биологических системах, а также в больших концентрациях природные полифенолы могут демонстрировать прооксидантные свойства [23-26]. Так, ИЛГ повышает продукцию АФК в различ-ных опухолевых клетках [27], что рассматривают как один из его противоопухолевых механизмов. По-ви-димому, аналогичные механизмы продукции АФК при участии флавоноидов возможны в нейтрофилах и моноцитах, что продемонстрировано в настоящем исследовании в образцах с ИЛГ. Возможно, что это имеет значение в реализации антистафилококковых эффектов флавоноидных соединений. Однако, следу-ет учитывать и возможность необратимого повреж-дения митохондрий, гибели макрофагов, вызванных увеличением выработки АФК и диссеминации погло-щенных бактерий при незавершенном фагоцитозе, что продемонстрировано при исследовании ресве-ратрола в отношении микобактерий [28].ЗАКЛЮЧЕНИЕУстановлено, что предварительное внутрибрюш-инное введение ИЛГ в дозе 30 мг/кг самцам мышей Balb/С достоверно увеличивает выживаемость жи-вотных в модели инфекционного процесса, вызван-ного S. aureus J 49 ATCC 25923, не ингибирует хемо-таксис нейтрофилов и макрофагов у мышей Balb/С. Также выявлено, что ИЛГ в концентрациях 16-128 мкг/мл статистически значимо не влияет на поглоще-ние моноцитами и нейтрофилами периферической крови человека S. aureus J49 ATCC 25923, но дозоза-висимо увеличивает количество фагоцитов, продуци-рующих АФК, а также интенсивность «кислородного взрыва» активированных нейтрофилов и моноцитов периферической крови человека. Таким образом, эти эффекты вкупе могут рассматриваться как один из возможных механизмов выживаемости мышей в ранние сроки развития стафилококковой инфекции у мышей

About the authors

E. A. Solenova

Chuvash State University n. a. I.N. Ulyanov

Email: elensoul@mail.ru
15, Moskovsky Ave., Cheboksary, Chuvash Republic, Russia, 428015

S. I. Pavlova

Chuvash State University n. a. I.N. Ulyanov

Email: flavonoid@yandex.ru
15, Moskovsky Ave., Cheboksary, Chuvash Republic, Russia, 428015

References

Supplementary files